豬偽狂犬病毒TK基因的擴(kuò)增及序列分析

林 鷙，何錫忠，潘 潔，朱永軍，彭麗英

(上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，上海201106)

豬偽狂犬病(Pseudorabies，PR)是由豬偽狂犬病毒(Pseudorabies virus，PRV)引起的急性傳染病，臨床特征為動(dòng)物發(fā)熱、奇癢及繁殖障礙，成年豬隱性感染從而造成長(zhǎng)期帶毒排毒等[1]。PRV基因組為GC含量高達(dá)70%以上的線狀雙鏈DNA，編碼100多種蛋白。TK基因是豬偽狂犬病毒復(fù)制增殖的非必需基因，同時(shí)也是主要的毒力基因，對(duì)PRV毒力的影響最大，其編碼的胸苷激酶參與病毒的復(fù)制和潛伏感染，對(duì)病毒在神經(jīng)組織中的增殖具有重要作用[2-4]。

2011年以來(lái)，我國(guó)暴發(fā)了一種由豬偽狂犬病毒變異毒株引起的豬偽狂犬病，主要造成母豬繁殖障礙和初生乳豬死亡。接種傳統(tǒng)的偽狂犬病疫苗已不能抵御偽狂犬病毒變異毒株的侵襲[5-6]。不同學(xué)者在不同的地區(qū)都分離到了流行的變異毒株[7-10]。本實(shí)驗(yàn)室也從發(fā)病豬腦中分離到了一株豬偽狂犬病毒，并命名為SX株，本試驗(yàn)擬利用PCR對(duì)該毒株的TK基因進(jìn)行擴(kuò)增和測(cè)序，并與國(guó)內(nèi)外經(jīng)典毒株、疫苗毒株以及近些年的變異毒株進(jìn)行序列比對(duì)，以期了解豬偽狂犬流行變異毒株TK基因的結(jié)構(gòu)特征及分子流行病學(xué)特點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 種毒、細(xì)胞

豬偽狂犬病毒SX株由上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所分離所得。ST細(xì)胞由上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所保存。

1.2 主要試驗(yàn)試劑

病毒DNA/RNA提取試劑盒為天根生化科技有限公司產(chǎn)品；Ex Taq DNA 聚合酶、DL5000 DNA Marker等均為生工生物工程(上海)股份有限公司產(chǎn)品。

1.3 引物設(shè)計(jì)

根據(jù)GenBank上已公布的序列設(shè)計(jì)針對(duì)TK基因的特異性引物，上游引物F：GCACCCCGAGGTTGACTTCA；下游引物R：AGGGTCACACCCCCATCTCC。擴(kuò)增片段大小預(yù)計(jì)為1 125bp。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.4 PRV DNA提取與PCR擴(kuò)增

收集病變達(dá)到80%以上的ST細(xì)胞，反復(fù)凍融3次，12 000r/min離心后，取200 μL上清，利用試劑盒提取病毒DNA。利用1.3節(jié)的引物擴(kuò)增PRV的TK基因。PCR反應(yīng)體系：病毒DNA模板 2 μL，PCR mix 25 μL，上游引物F 2.5 μL，下游引物R 2.5 μL，ddH2O 18 μL，總體積50 μL。反應(yīng)程序：95 ℃ 變性5 min； 95 ℃ 60 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 60 s，35 個(gè)循環(huán)； 72 ℃延伸10 min。取5 μL PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，其余產(chǎn)物送生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行測(cè)序。

1.5 序列分析

采用DNAStar軟件將測(cè)序得到的SX株TK基因核苷酸序列及推導(dǎo)出的氨基酸序列與GenBank上9株國(guó)內(nèi)外PRV分離株的相應(yīng)序列進(jìn)行同源性比對(duì)分析和進(jìn)化樹(shù)分析。9株國(guó)內(nèi)外分離株分別為來(lái)自中國(guó)的變異毒株HeN1株、JS2012株、TJ株、GD株、經(jīng)典毒株Ea株，匈牙利的Kaplan株和疫苗毒株Bartha株，美國(guó)的Becker株以及希臘的Kolchis株。

2 結(jié)果與分析

2.1 PRV TK基因的擴(kuò)增

用設(shè)計(jì)的特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增之后，產(chǎn)物在瓊脂糖凝膠電泳上有一條特異性的條帶，約1 100bp(圖1)，大小與預(yù)期結(jié)果相符。

2.2 PRV TK基因核苷酸序列分析

PCR產(chǎn)物測(cè)序顯示，目的片段包括了TK基因的編碼區(qū)序列，長(zhǎng)度為963bp，共編碼320個(gè)氨基酸。將得到的序列結(jié)果與GenBank中已知的其他毒株TK基因核苷酸序列進(jìn)行比對(duì)發(fā)現(xiàn)(圖2)，SX株的TK基因序列與近些年國(guó)內(nèi)分離得到的流行毒株TK基因序列同源性為100%；與經(jīng)典毒株Ea株的同源性為99.6%，存在4個(gè)堿基的變異，分別為：第13位由A突變?yōu)镃，第643位和第644位由A和C突變?yōu)镚和T，第851位由C突變?yōu)門(圖3)；與疫苗毒株Bartha株的同源性為99.7%，存在以下變異：第643位和第644位堿基由A和C分別突變?yōu)镚和T，第851位堿基由C突變?yōu)門(圖3)；與國(guó)外的Becker、Kaplan、Kolchis毒株的同源性分別為99.6%，99.7%和99.4%。與Becker毒株的同源性和Ea株相同；與Kaplan毒株相比存在3個(gè)堿基的變異：第57位T突變?yōu)镚，第643和第644位由A和C突變?yōu)镚和T；與Kolchis毒株相比存在5個(gè)堿基的突變：第163位G突變?yōu)锳，第513位A突變?yōu)镚，第643位和第644位由A和C突變?yōu)镚和T，第810位A突變?yōu)镚(圖3)。

2.3 PRV TK基因編碼的氨基酸序列分析

結(jié)果顯示(圖4)：SX株TK基因編碼的氨基酸與近幾年分離得到的流行毒株的TK基因編碼的氨基酸同源性為100%。與國(guó)內(nèi)經(jīng)典毒株Ea株TK基因編碼的氨基酸同源性為99.4%，存在2個(gè)氨基酸的突變(圖5)：第215位的蘇氨酸(T)突變?yōu)槔i氨酸(V)，第284位的丙氨酸(A)突變?yōu)槔i氨酸(V)；與國(guó)外毒株TK基因編碼的氨基酸同源性為99.1%—99.7%；與Bartha株、Becker株相比存在2個(gè)氨基酸的突變：第215位的蘇氨酸(T)突變?yōu)槔i氨酸(V)，第284位的丙氨酸(A)突變?yōu)槔i氨酸(V)；與Kaplan株相比只存在1個(gè)氨基酸的突變，即第215位的蘇氨酸(T)突變?yōu)槔i氨酸(V)；與Kolchis株相比存在3個(gè)氨基酸的突變(圖5)：第55位的丙氨酸(A)突變?yōu)樘K氨酸(T)，第215位的蘇氨酸(T)突變?yōu)槔i氨酸(V)，第293位蘇氨酸(T)突變?yōu)楸彼?A)。

利用DNAstar軟件繪制進(jìn)化樹(shù)，從圖6可看出，SX株與近些年國(guó)內(nèi)分離得到的流行變異毒株在一個(gè)分支上，與國(guó)內(nèi)經(jīng)典毒株Ea株、疫苗株Bartha株以及國(guó)外其他毒株呈現(xiàn)各自獨(dú)立的遺傳進(jìn)化分支。

3 討論與結(jié)論

已有研究表明，TK基因?qū)儆赑RV的早期基因，也是主要的毒力基因，TK基因雖然是PRV復(fù)制的非必需基因，但是對(duì)病毒在神經(jīng)組織中的增殖具有重要作用。缺失了TK基因的病毒很難在神經(jīng)元中增殖，同時(shí)也降低了病毒的嗜神經(jīng)毒性和毒力[2-4]。因此，對(duì)TK基因的序列進(jìn)行比對(duì)分析，在某種程度上可以反映出PRV的毒力強(qiáng)弱，有助于在分子水平上分析PRV 致病的分子機(jī)理。

本試驗(yàn)參考GenBank中已知的PRVTK基因及相近的序列，設(shè)計(jì)特異性引物擴(kuò)增了TK基因的全長(zhǎng)，測(cè)序顯示TK基因的編碼區(qū)為963個(gè)堿基，編碼320個(gè)氨基酸。與國(guó)內(nèi)外不同毒株比對(duì)顯示，SX株TK基因序列與近些年分離到的變異毒株(HeN1、JS2012、TJ、GD)核苷酸和氨基酸均完全一致，同源性為100%；與國(guó)內(nèi)經(jīng)典毒株Ea株核苷酸和氨基酸的同源性分別為99.6%和99.4%；與國(guó)外的毒株(Bartha、Becker、Kaplan、Kolchis)核苷酸和氨基酸序列同源性分別為99.4%—99.7%和99.1%—99.7%。對(duì)比近些年國(guó)內(nèi)流行的變異毒株TK基因與國(guó)內(nèi)經(jīng)典毒株及國(guó)外毒株TK基因氨基酸序列發(fā)現(xiàn)，存在的突變位點(diǎn)雖然不多，但是大部分都出現(xiàn)了第215位由蘇氨酸(T)突變?yōu)槔i氨酸(V)和第284位由丙氨酸(A)突變?yōu)槔i氨酸(V)，這兩個(gè)位點(diǎn)值得注意，可能這兩個(gè)位點(diǎn)的突變是目前國(guó)內(nèi)流行的變異毒株TK基因重要的分子特征之一。此外，TK基因有2個(gè)非常重要的結(jié)構(gòu)域，即ATP結(jié)合結(jié)構(gòu)域和核苷酸結(jié)合結(jié)構(gòu)域，分別位于10—18位和108—110位[12]，這些核心區(qū)域都沒(méi)有發(fā)生突變。由此可以看出，不管是核苷酸序列還是氨基酸序列，不同毒株之間存在一定的變異，但是同源性還是很高的，說(shuō)明PRVTK基因具有較高的保守性。

本試驗(yàn)對(duì)PRV SX株的TK基因分子特征進(jìn)行了初步的分析，可以為PRV分子流行病學(xué)調(diào)查、TK基因的功能研究及病毒基因組改造等提供參考。