利用SNP分子標(biāo)記構(gòu)建50份糯玉米自交系DNA指紋庫(kù)

韓 晴，孫小淋，盧 媛，田 東，施 標(biāo)，沈雪芳*

(1上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物育種栽培研究所，CIMMYT：中國(guó)特用玉米研究中心，上海 201403；2上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院生態(tài)環(huán)境保護(hù)研究所，上海201403)

糯玉米(ZeamaysL.var.ceratinaKulesh)是玉米屬的一種類型，起源于中國(guó)[1]，富含支鏈淀粉、賴氨酸、蛋白質(zhì)等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，具有良好的適口性且營(yíng)養(yǎng)豐富，深受廣大消費(fèi)者和食品加工企業(yè)的歡迎。近年來(lái)，通過(guò)國(guó)家審定的糯玉米品種數(shù)量越來(lái)越多，其種植面積不斷增加，同時(shí)也出現(xiàn)套牌侵權(quán)、偽劣假種等現(xiàn)象，嚴(yán)重影響種業(yè)健康持續(xù)發(fā)展[2]。

早期的品種鑒別主要依靠形態(tài)學(xué)方法，這種方法易受人為和環(huán)境的影響。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，出現(xiàn)了分子標(biāo)記技術(shù)如RFLP、AFLP、SSR等，該技術(shù)不受環(huán)境影響，鑒別周期短，被廣泛應(yīng)用于品種鑒定、遺傳多樣性分析、DNA指紋庫(kù)構(gòu)建等。王鳳格等[3]利用40對(duì)核心SSR引物分析了328個(gè)玉米品種的遺傳多樣性，發(fā)現(xiàn)育成的品種遺傳多樣性指數(shù)在不同年份間變化不大。盧媛等[4]利用29對(duì)SSR標(biāo)記對(duì)87份糯玉米自交系進(jìn)行遺傳多樣性分析，并將其劃分為4大類群，各個(gè)類群包含種質(zhì)不同。常利芳等[5]利用40對(duì)SSR標(biāo)記對(duì)56份超甜玉米和88份普甜玉米進(jìn)行聚類分析，共篩選出14個(gè)超甜玉米和19個(gè)普甜玉米兩個(gè)亞群體種質(zhì)，這兩個(gè)亞群核心種質(zhì)保留了原始群體的遺傳多樣性和表型變異，能夠代表原始甜玉米材料群體。但采用SSR等分子標(biāo)記技術(shù)構(gòu)建玉米品種DNA指紋庫(kù)普遍存在檢測(cè)位點(diǎn)數(shù)量少、標(biāo)記數(shù)量有限和位點(diǎn)突變率高等缺點(diǎn)。SNP標(biāo)記作為繼AFLP、SSR標(biāo)記后的第三代分子標(biāo)記，具有分布廣泛、呈二態(tài)性、通量高、遺傳穩(wěn)定性強(qiáng)和易于自動(dòng)化分析等優(yōu)點(diǎn)，已被國(guó)際植物新品種權(quán)保護(hù)聯(lián)盟(UPOV)推薦用于DNA指紋數(shù)據(jù)庫(kù)的構(gòu)建[6]。目前，SNP標(biāo)記已應(yīng)用于油菜[7]、甘藍(lán)[8]、海島棉[9]等作物指紋庫(kù)的構(gòu)建和作物的分子標(biāo)記輔助育種中[10]，但SNP標(biāo)記在糯玉米DNA指紋庫(kù)中的應(yīng)用很少。本研究利用SNP標(biāo)記對(duì)糯玉米自交系進(jìn)行基因型分析，并利用核心SNP標(biāo)記構(gòu)建糯玉米自交系的DNA指紋庫(kù)，同時(shí)對(duì)糯玉米自交系類群進(jìn)行聚類分析，以期為糯玉米品種確權(quán)、遺傳多樣性分析和育種者權(quán)益保護(hù)提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試材料為50份糯玉米自交系，由上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院玉米遺傳育種課題組提供。編號(hào)為1—50，品系名稱、系譜來(lái)源及籽粒性狀見(jiàn)表1。

表1 50份供試糯玉米自交系

1.2 DNA提取

將50份自交系種植在人工氣候培養(yǎng)箱中，生長(zhǎng)到兩葉一心時(shí)取幼苗葉片。每個(gè)品系取5株，混合，采用植物基因組DNA提取試劑盒(離心柱型，TIANGEN DP320)提取幼苗DNA，具體流程參照試劑盒說(shuō)明書。用1%瓊脂糖凝膠電泳對(duì)提取樣品DNA質(zhì)量進(jìn)行檢測(cè)，要求主帶明顯、單一，保證DNA的A260/A280值在1.8—2.2。樣品DNA置于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 基因分型

利用Illumina公司研發(fā)的包含56 110個(gè)SNP標(biāo)記(Illumina，San Diego，California,U.S.A)對(duì)供試材料進(jìn)行基因型分析，按照芯片操作手冊(cè)進(jìn)行DNA處理、DNA與芯片雜交、洗脫、單堿基延伸等步驟，將原始數(shù)據(jù)導(dǎo)入GenomeStudio 軟件(V2 011.1，Illumina，Inc.)進(jìn)行SNP 分型。

用tassel 5.0軟件對(duì)試驗(yàn)材料基因型進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，包括樣品的缺失率、雜合率以及SNP的最小等位基因頻率(Minor Allele Frequency，MAF)，選出位點(diǎn)檢出率大于95%、最小等位基因頻率大于0.01、雜合率小于0.05的共42 406個(gè)SNP標(biāo)記用于后續(xù)分析。利用位點(diǎn)篩選工具LociScan_V1.0對(duì)位點(diǎn)進(jìn)行梯度篩選。

1.4 聚類分析

用tassel 5.0軟件計(jì)算各品系之間的遺傳距離和遺傳相似度，利用NTSYSpc 2.1軟件和UPGMA算法進(jìn)行聚類分析[11]。

2 結(jié)果與分析

2.1 SNP標(biāo)記的分析

利用篩選得到的42 406個(gè)SNP標(biāo)記對(duì)50份糯玉米自交系進(jìn)行SNP分型。99%的位點(diǎn)檢出率大于95%，94%的位點(diǎn)檢出率超過(guò)97%(圖1)。說(shuō)明該芯片對(duì)糯玉米自交系SNP位點(diǎn)具有較高的分型效率。42 406個(gè)SNP位點(diǎn)在50份糯玉米自交系的雜合率為2%—9%，平均4%，說(shuō)明自交系純合度較高；SNP缺失率為0—13%，平均1%，說(shuō)明SNP芯片質(zhì)量好；最小等位基因頻率(MAF)為0.05—0.55，平均0.40；多態(tài)性信息含量(PIC)在0.12—0.46，平均0.38?；蚨鄻有灾笖?shù)變化范圍為0.15—0.65，平均0.44。

2.2 DNA指紋庫(kù)的構(gòu)建

分別選用8個(gè)不同的數(shù)量位點(diǎn)，即7 000、8 000、9 000、 10 000、25 000、30 000、35 000、40 000，統(tǒng)計(jì)分析位點(diǎn)的識(shí)別率。發(fā)現(xiàn)這些位點(diǎn)MAF在0.41及以上，雜合率在0.05及以下，PIC在0.31及以上。隨著位點(diǎn)數(shù)的增加，識(shí)別率也越來(lái)越高。當(dāng)達(dá)到10 000位點(diǎn)時(shí)，識(shí)別率為95%；當(dāng)達(dá)到25 000位點(diǎn)時(shí)，識(shí)別率為98%，以后趨于平緩(表2)。25 000位點(diǎn)時(shí)的雜合率0.03，MAF為0.42，PIC均值0.35，98%的糯玉米材料可以被有效區(qū)分開(kāi)。因此，最終選擇25 000個(gè)核心SNP位點(diǎn)組合構(gòu)建50個(gè)糯玉米品種DNA指紋庫(kù)(本文未列出)。

表2 SNP核心位點(diǎn)的篩選

2.3 聚類分析

50份自交系兩兩之間的相似系數(shù)在0.38—0.93。18SW-中(編號(hào)38)與B紅(編號(hào)41)、19SW-恒(編號(hào)4)與19SW-35(編號(hào)5)之間相似系數(shù)最大，為0.925，二者之間有6 875個(gè)位點(diǎn)的差異。說(shuō)明18SW-93(編號(hào)23)與18SW-OP(編號(hào)28)之間親緣關(guān)系要遠(yuǎn)；18SW-中(編號(hào)38)與B紅(編號(hào)41)、19SW-恒(編號(hào)4)與19SW-35(編號(hào)5)之間親緣關(guān)系要近。在玉米育種實(shí)踐中，應(yīng)盡量避免將親緣關(guān)系近的自交系配組。

在相似系數(shù)0.65處，50份糯玉米自交系劃分為4大類群。第Ⅰ大群包括19SW-玉、19SW-萬(wàn)、19SW-張、19SW-18、18SW-52等12個(gè)糯玉米自交系；第Ⅱ大群包括19SW-恒、19SW-35、19SW-恒6、19SW-蘇科、18SW-江恒等11個(gè)糯玉米自交系；第Ⅲ大群包括19SW-紅、19SW-48、19SW-75、18SW-H、18SW-OP等14個(gè)糯玉米自交系；第Ⅳ大群包括19SW-玉、19SW-31、18SW-甜糯、18SW-彩甜糯、申-3等13個(gè)糯玉米自交系。聚類結(jié)果與各類群的籽粒顏色表現(xiàn)和系譜來(lái)源均一致，如第一大類群籽粒顏色均為白色，組合父本為‘萬(wàn)糯2000’；第二大類群籽粒顏色均為紫白色，組合父本為‘恒♀-2’；第三大類群籽粒顏色均為紅色，組合父本為‘紅w’；第四大類群籽粒顏色均為五彩色，組合父本為‘w93’。

3 討論與結(jié)論

SNP分子標(biāo)記技術(shù)被國(guó)際植物品種權(quán)保護(hù)聯(lián)盟指定為構(gòu)建DNA指紋數(shù)據(jù)庫(kù)的標(biāo)記方法之一，具有與功能基因關(guān)聯(lián)度高、自動(dòng)化程度高、樣品檢測(cè)通量高等優(yōu)點(diǎn)?，F(xiàn)在已經(jīng)被廣泛用于玉米DNA指紋庫(kù)的構(gòu)建、遺傳距離和遺傳相似度的分析[12]。

目前，在玉米研究中應(yīng)用比較多的SNP標(biāo)記有600K、50K、5K、3K、1K等，SNP標(biāo)記在基因組中密度高且分布均勻，是最具發(fā)展?jié)摿Φ慕◣?kù)標(biāo)記之一[13-14]。本研究采用的Illumina公司開(kāi)發(fā)的包含56 110個(gè)SNP標(biāo)記屬于高密度SNP標(biāo)記。通過(guò)軟件計(jì)算得出所選SNP標(biāo)記的PIC均值為0.35，按照PIC>0.5為高度多態(tài)性；0.25

通過(guò)設(shè)置8個(gè)不同數(shù)量位點(diǎn)梯度篩選核心標(biāo)記，可節(jié)約檢測(cè)成本，提高品種鑒別的準(zhǔn)確度。梯度篩選分析表明，當(dāng)數(shù)量位點(diǎn)為7 000時(shí)，供試材料的識(shí)別率就可達(dá)85%，對(duì)于親緣關(guān)系較遠(yuǎn)的品種，可選擇7 000個(gè)SNP位點(diǎn)結(jié)合定點(diǎn)測(cè)序的方法進(jìn)行鑒定；當(dāng)數(shù)量位點(diǎn)達(dá)到25 000時(shí)，供試材料間的識(shí)別率高達(dá)98%，對(duì)親緣關(guān)系較近的品種，需要結(jié)合高通量測(cè)序技術(shù)進(jìn)行區(qū)分。本研究篩選SNP核心位點(diǎn)組合，可為糯玉米自交系指紋庫(kù)構(gòu)建、遺傳多樣性分析和種質(zhì)資源評(píng)價(jià)等研究提供參考依據(jù)。

聚類結(jié)果表明，50份糯玉米自交系被劃分為四大類群。通過(guò)系譜分析和農(nóng)藝性狀比較，發(fā)現(xiàn)聚類結(jié)果與系譜來(lái)源較一致。如品系18SW-中與18SW-56籽粒顏色都是紅色，穗型都是筒錐型，株型一致；品系18SW-中與18SW-56的父本是同一個(gè)父本，都是‘紅w’。說(shuō)明SNP標(biāo)記技術(shù)能夠根據(jù)親緣關(guān)系遠(yuǎn)近，準(zhǔn)確劃分糯玉米自交系。