NUCB2和Bcl-2在前列腺中的表達(dá)和相關(guān)性研究

劉歡 王麗強(qiáng) 單鏡源 羅振國

摘要：目的 檢測人前列腺組織中NUCB2和Bcl-2蛋白的表達(dá)，探索二者在前列腺癌中表達(dá)的意義和相關(guān)性。方法 收集選取本院2010年1月至2019年1月的前列腺組織標(biāo)本，及病例臨床資料，應(yīng)用免疫組化法檢測在良性前列腺增生（BPH）、前列腺上皮內(nèi)瘤變（PIN）及前列腺癌（PC）組織中Nuxb2與Bcl-2的表達(dá)，并分析二者在PC組織中的表達(dá)有無相關(guān)性。結(jié)果 NUCB2在PC組織中的表達(dá)顯著高于BPH和PIN組織，其表達(dá)與年齡無關(guān)，與Gleason分級、術(shù)前血清PSA有關(guān);<5年生存期病例的NUCB2表達(dá)陽性率高于>5年生存期病例。Bcl-2在PC組織中的表達(dá)顯著高于BPH和PIN組織，其表達(dá)與年齡無關(guān)，與Gleason分級及血清PSA均有關(guān)。在5年生存率上表達(dá)無差異。在前列腺癌組織中Nucb2與Bcl-2的表達(dá)呈正相關(guān)（P =0.012）。結(jié)論 NUCB2與Bcl-2兩者間可能存在一種相關(guān)性，聯(lián)合檢測二者有助于前列腺癌的進(jìn)一步研究。NUCB2的檢測可能有助于評估前列腺癌的預(yù)后。

關(guān)鍵詞：前列腺癌;NUCB2 Bcl-2;免疫組化

【中圖分類號】R697? 【文獻(xiàn)標(biāo)識碼】A??? 【文章編號】2107-2306（2020）02-018-03

前列腺癌是老年男性泌尿生殖系統(tǒng)常見的惡性腫瘤之一，在中國，近年來前列腺癌的發(fā)病率一直在上升，也是導(dǎo)致男性因癌癥相關(guān)死亡的主要原因^[1]。盡管我們在前列腺癌的診斷和輔助治療方面取得了相當(dāng)大的進(jìn)步，但是迄今為止僅有低級別和局灶性前列腺癌治愈率達(dá)60%左右，中晚期患者5年生存率仍低于30%^[2-3]，患者整體生存率無明顯提高。因此對前列腺癌發(fā)生發(fā)展以及治療和預(yù)后的研究具有重要意義因此對前列腺癌發(fā)生發(fā)展以及治療和預(yù)后的研究具有重要意義。1992年，Kanai Y，Tanuma S^[4]等在小鼠及人細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)了一種EF手型鈣結(jié)合蛋白，并將其命名為核組蛋白（ nucleobindin-2，NUCB2） 。目前發(fā)現(xiàn)NUCB2具有特殊的結(jié)構(gòu)功能，并且是一種癌癥相關(guān)基因，該基因在胃癌、乳腺癌、前列腺癌、腎透明細(xì)胞癌等中被相繼報(bào)道。BCL-2即B細(xì)胞淋巴瘤-2基因，抑制凋亡是目前研究的與凋亡關(guān)系十分密切的原癌基因之一，可抑制細(xì)胞凋亡延長其生長，導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生^[4]。

1、材料與方法

1.1、標(biāo)本來源及分組

收集佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院病理科2010年1月至2019年1月存檔前列腺石蠟標(biāo)本，將病理組織分為三組，分別為前列腺癌組、前列腺上皮內(nèi)瘤變組，以及前列腺良性增生組。其中前列腺癌51例、前列腺上皮內(nèi)瘤變共39例[低級別上皮內(nèi)瘤變（LGPIN）18例、高級別上皮內(nèi)瘤變（HGPIN）21例]、良性前列腺增生20例。兩位資深病理醫(yī)師對所有標(biāo)本進(jìn)行嚴(yán)格審查。前列腺癌病例組患者年齡57-82歲，平均年齡 72歲，≥72歲者30例，<76歲者21例。通過查閱病例，搜集患者術(shù)前血清前列腺特異性抗原（PSA）水平。所有患者術(shù)前均無放化療..。前列腺癌組進(jìn)行Gleason評分，對同一腫瘤的主要結(jié)構(gòu)和次要結(jié)構(gòu)分別評分，兩項(xiàng)評分相加總積分為≤5分者列為高分化組（4例）、6～7分者列為中分化組（19例）、8～10分者列為低分化組（22例）。對前列腺癌病例組進(jìn)行隨訪，共40例患者滿足條件，其中5年內(nèi)死亡25例，5年以上存活15例。

1.2、試劑

兔抗人 NUCB2多克隆抗體購自武漢優(yōu)爾生，兔抗人Bcl-2單克隆抗體，SP免疫組化染色試劑盒、DAB顯色試劑購自北京中杉金橋。

1.3、主要方法

標(biāo)本按理想實(shí)驗(yàn)要求切片;60℃烤箱烘烤1小時(shí);二甲苯分梯度脫蠟;再用梯度酒精脫去二甲苯;PBS和蒸餾水沖洗;置于EDTA抗原修復(fù)液PH9.0高溫高壓抗原修復(fù);切片至Tween 20，浸泡震蕩沖洗去污;切片至于3%的H2O2中滅活內(nèi)源性酶及封閉內(nèi)源性生物素，山羊血清抗原封閉;滴加配置好濃度的Nucb2一抗、滴加即用型Bcl-2一抗，常規(guī)孵育;滴加與一抗相匹配的二抗，再次孵育;每一步之間用PBS沖洗3次，每次3分鐘;滴加顯色劑，顯微鏡下控制顯色時(shí)間，用蒸餾水充分沖洗;蘇木精復(fù)染細(xì)胞核;封片，光學(xué)顯微鏡下觀察結(jié)果。陽性結(jié)果判定由本院兩位病理科資深醫(yī)師在高倍鏡視野下，進(jìn)行陽性結(jié)果判定;最終結(jié)果分為：陽性表達(dá)、高表達(dá)和低表達(dá)。

1.4、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS26.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。NUCB2和Bcl-2在前列腺癌、前列腺上皮內(nèi)瘤變及良性前列腺增生組織中的表達(dá)差及相關(guān)性分析采用 χ2檢驗(yàn)，以a=0.05為顯著性檢驗(yàn)水平，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2、結(jié)果

2.1、NUCB2、Bcl-2在前列腺癌、前列腺上皮內(nèi)瘤變及良性前列腺增生組織中的表達(dá)。

NUCB2主要表達(dá)于腺上皮細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)，呈棕黃色至棕褐色。NUCB2在BPH、LGPIN、HGPIN及PC組陽性率分別為10%，11.11%，14.29%及70.59%。NUCB2在PC組中的陽性率明顯高于BPH組、LGPIN組和HGPIN組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05見表1）。

Bcl-2主要表達(dá)于正常前列腺的腺上皮細(xì)胞以及前列腺癌細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)，在BPH、LGPIN、HGPIN及PC組陽性率分別為15%，27.78%，52.29%及76.74%。在PC組中的陽性率明顯高于BPH組、LGPIN組和HGPIN組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05見表1）。

2.2、NUCB2和Bcl-2的表達(dá)與前列腺癌臨床病理參數(shù)的關(guān)系。

在前列腺癌組織中，NUCB2表達(dá)與患者年齡無關(guān);與Gleason評分和術(shù)前血清PSA值有關(guān)，隨著Gleason評分的增高，NUCB2的表達(dá)率也增高，同樣隨著術(shù)前血清PSA值的增加，NUCB2的表達(dá)率也增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。<5年生存期病例的NUCB2表達(dá)陽性率高于≥5年生存期病例，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P〈0.05見表2）。

Bcl-2表達(dá)與患者年齡、5年生存率均無關(guān)，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）;與Gleason評分和術(shù)前血清PSA值有關(guān)，隨著Gleason評分的增高，Bcl-2的表達(dá)率也增高，同樣隨著術(shù)前血清PSA值的增加，NUCB2的表達(dá)率也增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05見表2）。

2.3、NUCB2與Bcl-2在高級別上皮內(nèi)瘤變組HGPIN和高分化前列腺癌PC組中的表達(dá)。

NUCB2在高分化PC組中陽性表達(dá)率高于HGPIN組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），而Bcl-2在高分化PC組中陽性表達(dá)率也高于HGPIN組，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（（P>0.05見表3）。

2.4、NUCB2表達(dá)與PC預(yù)后的關(guān)系。

預(yù)后分析得知，前列腺癌組中，共有40人滿足5年生存率調(diào)查。Nucb2組中，<5年生存率的25人中，23人陽性表達(dá)，2人陰性表達(dá);≥5年生存率的15人中，9人陽性表達(dá)，6人陰性表達(dá)，陽性和陰性患者間術(shù)后生存差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

Bcl-2組中，<5年生存率的25人中，18人陽性表達(dá)，7人陰性表達(dá);≥5年生存率的15人中，9人陽性表達(dá)，6人陰性表達(dá)，陽性和陰性患者間術(shù)后不生存差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（見表2）。

2.5前列腺癌中NUCB2與Bcl-2表達(dá)的相關(guān)性

NUCB2、Bcl-2在前列腺癌組織中的表達(dá)呈正相關(guān)性（見表4）

4、討論

前列腺癌患者主要是老年男性，近年來呈現(xiàn)明顯上升趨勢，目前前列腺癌位居我國男性泌尿生殖系統(tǒng)惡性腫瘤中發(fā)病率的第三位^[6]。因此，因此，對于前列腺癌的發(fā)生、發(fā)展和診斷已經(jīng)成為一個(gè)重要的課題。

NUCB2也稱為NEFA蛋白，是一種新的腫瘤相關(guān)基因，最近研究發(fā)現(xiàn)與乳腺癌的復(fù)發(fā)和不良預(yù)后密切相關(guān)^[7]，而且體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示能夠有效的增加乳腺癌細(xì)胞系的增殖，轉(zhuǎn)移和侵襲能力。所有的結(jié)果顯示和乳腺癌的轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，而且可以作為預(yù)測乳癌預(yù)后的一個(gè)重要指標(biāo)^[8]。在正常胃組織，Nucb2表達(dá)較高，主要陽性分布于胃粘膜泌酸腺內(nèi)分泌細(xì)胞。用RT-PCR法分析和比較胃癌組織中癌組織和癌旁組織中nucb2m?RNA的變化，發(fā)現(xiàn)胃癌組織中nucb2m?RNA水平下調(diào)了50%，nucb2在胃癌組織中具有典型的抑癌基因[9-10]。

本課題中前列腺癌組Nucb2表達(dá)明顯高于前列腺增生組和前列腺上皮內(nèi)瘤變組（P<0.05），本實(shí)驗(yàn)顯示，在PC組中NUCB2表達(dá)與年齡無關(guān)，與腫瘤的Gleason分級、術(shù)前血清PSA相關(guān)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，血清PSA—直被認(rèn)為是前列腺癌的理想分子標(biāo)志物，血檢測被廣泛應(yīng)用于前列腺癌的發(fā)生、進(jìn)展、治療后殘余癌的治療及前列腺癌復(fù)發(fā)后的隨訪等過程中。隨著術(shù)前血清PSA值的升高，Nucb2蛋白的表達(dá)率也增高。前列腺癌Gleason評分與前列腺癌的生物學(xué)行為和臨床預(yù)后之間具有很好的關(guān)聯(lián)性，隨著Gleason分級的增加，評分越高，前列腺癌分化越差，NUCB2表達(dá)率越高，提示NUCB2表達(dá)可能與癌癥的進(jìn)展和分化有關(guān)。NUCB2在<5年與≥5年生存期病例中的表達(dá)存在差異，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示Nucb2的異常表達(dá)可能與前列腺癌的預(yù)后有關(guān)。HGPIN目前認(rèn)為是一種癌前病變，組織學(xué)形態(tài)及其組織的生物學(xué)行為以及與PC類似并有關(guān)聯(lián)，尤其是高分化前列腺癌。這組課題表明，高分化PC組的Nucb2陽性表達(dá)率高于HGP?IN組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示其可用于鑒別診斷。

本實(shí)驗(yàn)中顯示Bcl-2在前列腺癌組中的表達(dá)明顯高于良性前列腺增生組和前列腺上皮內(nèi)瘤變組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示bcl-2可能參與了前列腺癌的發(fā)生。在PC組中Bcl-2表達(dá)與年齡無關(guān)，與腫瘤的Gleason分級、術(shù)前血清PSA相關(guān)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，隨著Gleason分級的增加，Bcl-2表達(dá)率越高，提示Nucb2表達(dá)可能與癌癥的進(jìn)展和分化有關(guān)。Bcl-2在<5年與≥5 年生存期病例中的表達(dá)有差異，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)無顯著差異，在高分化PC組和HGPIN組中表達(dá)存在差異，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)無顯著差異。

通過相關(guān)性分析得知NUCB2、Bcl-2在前列腺癌組織中的表達(dá)呈正相關(guān)性（P<0.05）。由此可以提示NUCB2的高表達(dá)引起B(yǎng)cl-2的高表達(dá)，影響細(xì)胞凋亡失衡，NUCB2與Bcl-2兩者間存在一種相互作用機(jī)制在前列腺癌中發(fā)揮作用，對前列腺癌的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，檢查其表達(dá)水平對疾病鑒別診斷和治療預(yù)后有一定幫助，對鑒別高分化PC和中HGPIN有一定意義。目前NUCB2 與 Bcl-2之間的相互關(guān)系以及生物學(xué)功能方面的研究還比較少，尤其是在腫瘤中的相互作用機(jī)制，需要擴(kuò)大樣本進(jìn)行更詳細(xì)的研究。

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