姜黃素類似物對糖尿病腎病小鼠腎纖維化的影響及機(jī)制探討

劉瑾 沈婷婷 蔣潔瑩 郁韶明

摘要? 目的：探討姜黃素類似物對糖尿病腎?。―N）小鼠腎纖維化的影響及機(jī)制。方法：KKAy小鼠給予高脂飼料連續(xù)飼養(yǎng)2周構(gòu)建DN小鼠模型，隨機(jī)分為模型組和實(shí)驗(yàn)組，每組12只，10只C57BL/6J小鼠飼喂普通飼料，作為正常組。實(shí)驗(yàn)組小鼠灌胃姜黃素類似物H8 5 mg/kg，模型組和正常組均灌胃等量生理鹽水，1次/d，連續(xù)干預(yù)6周。采用血糖儀檢測小鼠空腹血糖（FBG），雙縮脲法檢測處死前24 h尿液尿蛋白（UP）;過碘酸-無色品紅染色（PAS染色）觀察小鼠腎組織病理形態(tài)變化;蛋白免疫印跡（WB）法及實(shí)時熒光定量-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（qPCR）檢測各組小鼠腎組織α-平滑肌肌動蛋白（α-SMA）、纖連蛋白（FN）和IV型膠原（Col-Ⅳ）、Twist蛋白表達(dá)情況。結(jié)果：干預(yù)后，正常組、模型組和實(shí)驗(yàn)組小鼠腎臟指數(shù)（KI）分別為（6.24±0.32）、（14.4±2.39）、（9.14±1.43）mg/g，F(xiàn)BG分別為（4.96±1.25），（35.54±3.43），（27.54±1.12）mmol/L，24 h UP分別為（31.69±5.51）、（710.54±231.28）、（410.43±130.36）μmol/L;腎小球硬化評分分別為（0.00±0.00）、（3.02±0.24）、（1.69±0.21）分，組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義（ P <0.05）。與正常組比較，模型組小鼠腎組織α-SMA、FN和Col-Ⅳ、Twist蛋白及mRNA相對表達(dá)量升高（ P <0.05），而實(shí)驗(yàn)組小鼠低于模型組（ P <0.05）。結(jié)論：姜黃素類似物可改善DN小鼠腎功能及腎組織損傷程度，降低纖維化蛋白表達(dá)，延緩腎組織纖維化，可能與下調(diào)Twist蛋白表達(dá)有關(guān)。

關(guān)鍵詞? 糖尿病腎病;姜黃素類似物;Twist蛋白;纖維化;腎組織病理;腎組織病理;纖連蛋白;IV型膠原;Twist蛋白

Exploration on Effects of Curcumin Analogs on Renal Fibrosis in Diabetic Nephropathy Mice and Its Mechanism

LIU Jin，SHEN Tingting，JIANG Jieying，YU Shaoming

（Manufacturing Laboratory，Shuguang Hospital Affiliated to Shanghai University of Traditional Chinese Medicine，Shanghai 200021，China）

Abstract Objective： To explore effects and mechanism of curcumin analogs on renal fibrosis in diabetic nephropathy（DN）mice. Methods： KKAy mice were fed with high-fat diet for 2 weeks to establish DN mice model.They were randomly divided into model group and test group，with 12 mice in each group.Ten C57BL/6J mice were fed with common diet as normal group.Mice in the test group were given 5 mg/kg curcumin analogs H8 by gavage，and mice in the model group and the normal group were given the same amount of saline，once a day for 6 weeks.Fasting blood glucose（FBG）was measured by blood glucose meter.Before execution，24 h urinary protein（UP）was measured by biuret method.Renal histopathological changes were observed by periodic acid-Schiff staining（PAS staining）.Expressions of α-smooth muscle actin（α-SMA），fibronectin（FN），collagen IV（Col-IV）and Twist protein in renal tissue of mice in each group were measured by western blot（WB）and real-time fluorescent quantitative polymerase chain reaction（qPCR）. Results： After the intervention，the kidney index（KI）of mice in the normal group，the model group and the test group was（6.24±0.32），（14.4±2.39）and（9.14±1.43）mg/g，respectively.The FBG was（4.96±1.25），（35.54±3.43）and（27.54±1.12）mmol/L，respectively.The 24 h UP was（31.69±5.51），（710.54±231.28）and（410.43±130.36）μmol/L，respectively.The glomerulosclerosis score was（0.00±0.00），（3.02±0.24）and（1.69±0.21），respectively.There was statistically significant difference between the groups（P < 0.05）.Compared with the normal group，the relative expressions of α-SMA，F(xiàn)N，Col-IV，Twist protein and mRNA in kidney tissue of the model group mice were increased（P < 0.05），while those in the test group were lower than those in the model group（P < 0.05）. Conclusion： Curcumin analogs can improve renal function and damage degree of renal tissue in DN mice，decrease the expression of fibrosin and delay renal fibrosis，which may be related to down-regulation of Twist protein expression.

Keywords? Diabetic nephropathy; Curcumin analogs; Twist protein; Fibrosis; Renal histopathology; Renal histopathology; Fibronectin; Collagen IV; Twist protein

中圖分類號：R285.5 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A? doi： 10.3969/j.issn.1673-7202.2020.04.017

糖尿病腎?。―iabetic Nephropathy，DN）已經(jīng)成為導(dǎo)致糖尿病患者終末期腎臟衰竭的最主要原因，與遺傳因素、血流動力學(xué)異常、炎性反應(yīng)等導(dǎo)致的血管活性物質(zhì)和細(xì)胞因子代謝異常、氧化應(yīng)激等有關(guān)，逐步導(dǎo)致腎臟的纖維化[1-2]。姜黃素是由姜科植物根莖中提取的酚類化合物，具有廣泛的藥理活性，但代謝速度較快、生物利用度低[3];姜黃素衍生物H8保留了姜黃素母體結(jié)構(gòu)，但更易溶于水、穩(wěn)定性強(qiáng)、生物利用度高[4]。本研究即探討姜黃素類似物H8對DN小鼠腎纖維化病變的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 SPF雄性KKAy小鼠，24只，8～10周齡，體質(zhì)量（30.0±2.5）g，C57BL/6J小鼠，12只，9～11周齡，體質(zhì)量（25.0±2.5）g，購于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司，生產(chǎn)許可證號：SCXK（京）2016-0011;于室溫22～25 ℃，濕度50%～65%，12 h明暗交替環(huán)境下飼養(yǎng)約6 d，完全適應(yīng)新環(huán)境后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究。

1.1.2 藥物 姜黃素類似物H8（由福建醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院提供）。

1.1.3 試劑與儀器 α-平滑肌肌動蛋白（α-SMA）（批號：20180802），纖連蛋白（FN）（批號：20196234），購自上海聯(lián)邁生物工程有限公司;IV型膠原（Col-Ⅳ）（批號：196358）、Twist抗體（批號：183654），購于美國Cell Signaling Technology公司;血糖儀（美國強(qiáng)生公司，型號：OneTouchsurestep）;光學(xué)顯微鏡（日本Olympus公司，BX51F32H01型）;凝膠成像系統(tǒng)（美國Genesis公司，型號：Gel-Pro 2020D）等。

1.2 方法

1.2.1 分組與模型制備 KKAy小鼠給予高脂飼料連續(xù)飼養(yǎng)2周，若血糖≥13.9 mmol/L，則表明DN建立成功，C57BL/6J小鼠飼喂普通飼料，作為正常組。將DN小鼠隨機(jī)分為模型組和實(shí)驗(yàn)組，每組12只[5]。

1.2.2 給藥方法 實(shí)驗(yàn)組小鼠灌胃姜黃素類似物H8 5 mg/kg，模型組和正常組均灌胃等量生理鹽水，1次/d，連續(xù)干預(yù)6周。

1.2.3 檢測指標(biāo)與方法

1.2.3.1 各組小鼠血清生化指標(biāo)比較 干預(yù)后稱重小鼠體質(zhì)量，采用血糖儀檢測所有小鼠空腹血糖（FBG），代謝籠收集小鼠處死前24 h尿液，雙縮脲法檢測尿蛋白（UP）用，尿總蛋白量為24 h尿量與尿蛋白濃度的乘積，采用全自動生化分析儀檢測血清肌酐（CREA）和尿素（URE）。

1.2.3.2 過碘酸-無色品紅染色（PAS染色）觀察各組小鼠腎組織病理形態(tài)變化 斷頭法處死小鼠，取左側(cè)腎臟，去除腎包膜，稱重后計算腎臟指數(shù)（KI）=腎質(zhì)量（mg）/體質(zhì)量（g）;4 ℃生理鹽水洗滌，將1部分腎組織置于4%多聚甲醛中固定，其余腎組織于-70 ℃冰箱保存。腎組織常規(guī)石蠟包埋。每組取3張切片進(jìn)行常規(guī)PAS染色，于光學(xué)顯微鏡下觀察并記錄腎組織的病理變化，參照相關(guān)文獻(xiàn)對腎小球硬化程度進(jìn)行評分[6]。

1.2.3.3 蛋白免疫印跡（WB）法[7]及實(shí)時熒光定量-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（qPCR）[8]檢測各組小鼠腎組織相關(guān)蛋白表達(dá)情況 取保存于-70 ℃冰箱的腎組織，提取腎組織總蛋白，經(jīng)BCA法定量，參照相關(guān)文獻(xiàn)檢測腎組織中α-SMA、FN和Col-Ⅳ、Twist蛋白及mRNA，統(tǒng)計其相對表達(dá)量。各組均測量3次并取平均值。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計量資料以 （ ±s） 表示，2組間比較進(jìn)行 t 檢驗(yàn)，以 P <0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠觀察比較 與正常組小鼠比較，模型組和實(shí)驗(yàn)組小鼠體毛缺乏光澤，且均有精神不振、活動遲緩現(xiàn)象，并出現(xiàn)多飲、多食、多尿，但實(shí)驗(yàn)組小鼠上述情況較模型組均有所改善。正常組、模型組和實(shí)驗(yàn)組小鼠KI分別為（6.24±0.32）、（14.4±2.39）、（9.14±1.43）mg/g。與正常組比較，模型組大鼠KI明顯增加（ P <0.05）;與模型組比較，實(shí)驗(yàn)組KI明顯降低（ P <0.05）。見表1。

2.2 各組小鼠血液生化檢測指標(biāo)比較 與正常組比較，模型組大鼠血清FBG、24UP、URE明顯升高，CREA明顯降低，實(shí)驗(yàn)組血清FBG、24UP、URE明低于模型組，CREA明顯高于模型組（ P <0.05）。見表2。

2.3 各組小鼠鼠腎組織病理變化 正常組、模型組和實(shí)驗(yàn)組腎小球硬化評分分別為（0.00±0.00）分、（3.02±0.24）分、（1.69±0.21）分，模型組腎小球硬化評分高于正常組（ P <0.05），實(shí)驗(yàn)組低于模型 組（ P <0.05）;模型組和實(shí)驗(yàn)組小鼠出現(xiàn)腎小球肥大，系膜區(qū)增寬，基底膜增厚，腎間質(zhì)充血，近曲小管上皮細(xì)胞空泡變性及炎性細(xì)胞浸潤等;實(shí)驗(yàn)組上述病理改變均減輕。見圖1。

2.4 各組小鼠腎組織相關(guān)蛋白表達(dá) 與正常組比較，模型組小鼠腎組織α-SMA、FN和Col-Ⅳ、Twist蛋白及mRNA相對表達(dá)量升高（ P <0.05），而實(shí)驗(yàn)組小鼠低于模型組（ P <0.05）。見圖2，表3、4。

3 討論

目前糖尿病和DN已成為威脅人類健康的重要疾患，DN疾病進(jìn)程中主要病理特征為腎小管間質(zhì)纖維化，其中腎小管上皮細(xì)胞向間充質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)分化發(fā)揮著關(guān)鍵作用[9-10]。糖尿病進(jìn)展過程中腎小管間質(zhì)發(fā)生了上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化，促進(jìn)了腎功能的惡化，因此逆轉(zhuǎn)上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化的發(fā)展對于延緩DN等慢性腎臟疾病具有重要的意義[11-12]。近年來中藥及其單體成分抗纖維化的研究日益增多;姜黃素具有抗炎、抗氧化、抗腫瘤及抗纖維化的多種功能，可抑制炎性反應(yīng)因子的產(chǎn)生，保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞免受腫瘤壞死因子-α損傷，在風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、炎性反應(yīng)性腸道疾病、1型糖尿病等疾病的治療中顯示出較好的治療作用[13-14]。陳澤等[15]研究顯示，姜黃素衍生物C66能有效抑制鼠肝星狀細(xì)胞增殖及膠原合成，具有一定的防治肝纖維化的作用。

本研究結(jié)果顯示，與模型組比較，實(shí)驗(yàn)組KI明顯降低，血清FBG、24UP明顯降低，提示姜黃素衍生物H8可改善DN小鼠腎功能及腎組織損傷程度。Twist基因?yàn)橐环N癌基因，在多種實(shí)體腫瘤中高表達(dá)，能夠促使上皮細(xì)胞向間充質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)分化，是多種腫瘤細(xì)胞發(fā)生侵襲和轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵調(diào)控因子[16];目前研究[17]發(fā)現(xiàn)，Twist促進(jìn)上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化的進(jìn)展參與某些器官纖維化。Kida等[18]在UUO腎纖維化模型中發(fā)現(xiàn)，Twist表達(dá)量與上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化的發(fā)生率呈正相關(guān)。He等[19]用高糖刺激人腹膜間質(zhì)細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)Twist基因大量表達(dá)，通過與下游的YB-1基因作用，激活靶基因的E-box，導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)生纖維化。從本研究的結(jié)果可以看出，姜黃素衍生物H8干預(yù)后改善了DN小鼠腎功能及腎組織損傷程度，降低織α-SMA、FN和Col-Ⅳ纖維化蛋白表達(dá)，延緩腎組織纖維化，分析其可能與下調(diào)Twist蛋白表達(dá)有關(guān)。

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（2020-02-05收稿 責(zé)任編輯：王明）

基金項(xiàng)目：上海市衛(wèi)生和計劃生育委員會科技項(xiàng)目（20144Y016）作者簡介：劉瑾（1970.03—），女，碩士，副主任藥師，研究方向：中藥制劑，E-mail：873231876@qq.com通信作者：郁韶明（1961.04—），女，本科，副主任藥師，研究方向：臨床新藥研究，E-mail：568976178@qq.com