苦參堿對急性髓系白血病SCID模型鼠細(xì)胞生物學(xué)特性的影響

王穎 阿茹娜 呂鵬

摘要? 目的：觀察苦參堿對急性髓系白血病SCID小鼠模型細(xì)胞生物學(xué)特性的影響。方法：將40只數(shù)字隨機(jī)法分為空白組（ n =10）、模型組（ n =30），其中模型組小鼠腹腔注射對數(shù)生長期HL-60細(xì)胞株制備急性髓系白血病模型，4周后將27只成模的模型組小鼠隨機(jī)分為造模組、苦參堿A組及苦參堿B組，每組9只。其中苦參堿A組及B組分別用10 mL/kg及5 mL/kg灌胃，空白組及造模組大鼠接受等體積生理鹽水灌胃，各組均連續(xù)干預(yù)4周。比較各組生存期、體質(zhì)量、外周血血常規(guī)變化、同源性磷酸酶-張力蛋白（PTEN）水平變化、白血病細(xì)胞HL-60各周期生長情況以及Th1/Th2細(xì)胞的相關(guān)指標(biāo)水平變化。結(jié)果：苦參堿可明顯延長SCID小鼠生存期，減少外周血白細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、HL-60細(xì)胞數(shù)量、IL-4、IL-10水平，上調(diào)PTEN、IFN-γ、IL-2水平、G0/G1期的細(xì)胞含量，與造模組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（ P <0.05）。結(jié)論：苦參堿對急性髓系白血病HL-60細(xì)胞株具有明顯的抑制效應(yīng)，療效具有一定的劑量依賴性，其作用機(jī)制可能與增強(qiáng)PTEN蛋白及調(diào)整Th1/Th2細(xì)胞平衡有關(guān)。

關(guān)鍵詞? 急性髓系白血病;SCID模型鼠;HL-60細(xì)胞株;苦參堿;PTEN;Th1;Th2;失衡

Effects of Matrine on Cell Biological Characteristics of Acute Myeloid Leukemia SCID Model Mice

WANG Ying，A Runa，LYU Peng

（Department of Hematology，People′s Hospital of Inner Mongolia Autonomous region，Huhehaote 010017，China）

Abstract Objective： To observe the effects of matrine on the biological characteristics of SCID mice model with acute myeloid leukemia. Methods： A total of 40 mice were randomly divided into a blank group（ n =10）and a model group（ n =30）.The acute myeloid leukemia model was established by intraperitoneal injection of logarithmic HL-60 cells in the model group.4 weeks later，27 mice in the model group were randomly divided into a model group，a matrine A group and a matrine B group，with 9 mice in each group.The rats in group A and B were given 10 mL/kg and 5 mL/kg respectively by gavage，and the rats in the blank group for 4 weeks and model group were given the same volume of normal saline by gavage for 4 weeks.The survival time，body weight，the changes of peripheral blood routine，the level of homologous phosphatase-tensin（PTEN），the growth of leukemic cell HL-60 and the level of related indexes of Th1/Th2 cells were compared in each group. Results： Matrine could significantly prolong the survival time of SCID mice，decrease the number of leukocytes，lymphocytes，HL-60 cells and the levels of IL-4 and IL-10 in peripheral blood，and increase the levels of PTEN，IFN-γ，IL-2 and G0/G1 cells in the model group. Conclusion： Matrine has obvious inhibitory effects on acute myeloid leukemia HL-60 cell line in a dose-dependent manner，and the curative effects are dependent on dose to some degree.Its mechanism may be related to the enhancement of PTEN protein and regulation of Th1/Th2 cell balance.

Keywords? Acute myeloid leukemia; SCID model mouse; HL-60 cell line; Matrine; PTEN; Th1; Th2; Imbalance

中圖分類號：R285.5 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A? doi： 10.3969/j.issn.1673-7202.2020.04.013

急性髓細(xì)胞白血?。ˋcute Myeloid Leukemia，AML）是以造血祖細(xì)胞或干細(xì)胞過度增殖、分化異?；虻蛲鍪芤种茷橹饕憩F(xiàn)的血液系統(tǒng)惡性腫瘤[1-2]?；熓悄壳癆ML的主要治療手段，但醫(yī)療費(fèi)用昂貴、不良反應(yīng)及耐藥性限制其臨床運(yùn)用，故探尋新的、安全的抗癌方案具有重要的臨床意義。近年來，中草藥以其抗癌效果明顯、安全性高等諸多優(yōu)勢被眾多生物、醫(yī)學(xué)界科研工作者所重視。苦參堿是中草藥苦參的提取物，臨床不乏其有效治療肺癌、肝癌、胃癌等諸多實(shí)體腫瘤的臨床報(bào)道[3-5]，但其作用機(jī)制目前尚未清楚。本研究嘗試通過細(xì)胞周期檢測、Western Blotting、ELisa等手段，觀察苦參堿對急性髓系白血病SCID小鼠模型細(xì)胞生物學(xué)特性的影響，以期為中西結(jié)合防治白血病提供有力證據(jù)，報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物 40只SPF級SCID小鼠[購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，許可證號SCXK（京）2006-0009]，所有動(dòng)物飼養(yǎng)于本院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，飼養(yǎng)條件：溫度（22±1.5）℃，濕度（50±2）%，以12/12 h為光暗周期。

1.1.2 藥物 AML細(xì)胞株HL-60（購自上海舜冉生物科技有限公司，批號S678）;苦參堿（純度≥98%，配置儲(chǔ)存液濃度為10 mg/mL，購自美國Sigma公司，批號38293）。

1.1.3 試劑與儀器 同源性磷酸酶-張力蛋白單克隆一抗抗體（PTEN，購自美國CST公司，貨號9188T）;IFN-γELISA試劑盒（購自上海西唐生物科技有限公司，貨號32462）、IL-2 ELISA試劑盒（ 購自上海西唐生物科技有限公司，貨號39283）、IL-4 ELISA試劑盒（購自上海西唐生物科技有限公司，貨號23442）、IL-10ELISA試劑盒（購自上海西唐生物科技有限公司，貨號49233）;環(huán)磷酰胺（購自湘潭嘉葉源生物科技有限公司，批號XT382）。血細(xì)胞分析儀（購自濟(jì)南格利特科技有限公司，型號GRT-6002型）。

1.2 方法

1.2.1 分組與模型制備 40只小鼠隨機(jī)法分為空白組（ n =10）、模型組（ n =30），其中模型組小鼠腹腔注射對數(shù)生長期HL-60細(xì)胞株制備急性髓系白血病模型，4周后將27只成模的模型組小鼠隨機(jī)分為造模組、苦參堿A組及苦參堿B組，每組9只。各組小鼠在體質(zhì)量、鼠齡各方面差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（ P >0.05），具有可比性。

1.2.2 給藥方法 苦參堿A組及B組每天分別用10 mL/kg及5 mL/kg灌胃，空白組及造模組大鼠接受等體積生理鹽水灌胃，各組均連續(xù)干預(yù)4周。

1.2.3 檢測指標(biāo)與方法

1.2.3.1 各組小鼠一般情況比較 比較干預(yù)后各組小鼠生存期、體質(zhì)量及外周血血常規(guī)的變化。

1.2.3.2 Western Blot檢測各組小鼠脾臟組織PTEN水平 干預(yù)結(jié)束后各組隨機(jī)抓取5只小鼠，利用10%水合氯醛腹腔麻醉后冰上快速取出脾臟組織，按照100 mg∶ 0.5 mL裂解液的比例加入適量1%PMSF的蛋白裂解液，勻漿后室溫下靜置10 min后，用BCA試劑盒測定樣本總蛋白，根據(jù)結(jié)果得出上樣量后進(jìn)行電泳跑膠，轉(zhuǎn)膜，加入PTEN及β-actin一抗，比例均按照1∶ 1 000稀釋，再進(jìn)行生物辣根過氧化酶HRP標(biāo)記的二抗孵育，最后顯影、拍攝，用Image（BIO-RAD公司）的圖像處理軟件進(jìn)行處理，測定各樣本灰度值。

1.2.3.3 IL-2、IL-4、IL-10、IFN-γ濃度檢測 收集1.2.3.2步驟中大鼠的腹主動(dòng)脈血，4 ℃ 10 000 r/min下離心5 min，抽吸上清液，使用ELISA（酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)）對小鼠外周血清IL-2、IL-4、IL-10、IFN-γ濃度進(jìn)行檢測，具體過程如下：將樣本滴加如反應(yīng)孔中，37 ℃孵育1 h，用PBS洗滌反應(yīng)孔后每孔加入0.1 mL的酶標(biāo)抗體，37 ℃孵育30 min，在用PBS洗滌，隨后在各反應(yīng)孔中加入0.1 mL的TMB底物溶液，37 ℃孵育30 min，再加入2 mol/L硫酸0.05 mL中止反應(yīng)。隨后將反應(yīng)孔板置于酶標(biāo)儀中讀取數(shù)據(jù)，波長設(shè)置492 nm。操作過程全部按照試劑盒說明書進(jìn)行檢測。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)學(xué)進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)量數(shù)據(jù)都用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（? ±s ）表示，組間比較采用兩樣本 t 檢驗(yàn)或兩樣本秩和檢驗(yàn);組內(nèi)比較采用配對 t 檢驗(yàn)或配對秩和檢驗(yàn)。以 P <0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠一般情況比較 苦參堿組小鼠生存期明顯較模型組延長，其中苦參堿A組生存時(shí)間長于苦參堿B組;接受造模的小鼠體質(zhì)量明顯較空白組下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（ P <0.05），用藥后小鼠體質(zhì)量有所回升，其中苦參堿A組優(yōu)于苦參堿B組;苦參堿A組和苦參堿B組外周血白細(xì)胞、淋巴細(xì)胞以及HL-60細(xì)胞的數(shù)量較造模組明顯下降（ P <0.05），其中苦參堿A組下降趨勢大于苦參堿B組（ P <0.05）。見表1。

2.2 各組小鼠的實(shí)體瘤的病理變化 苦參堿A組和苦參堿B組PTEN水平較造模組明顯升高（ P <0.05），其中苦參堿A組上調(diào)幅度較苦參堿B組明顯（ P <0.05）。見圖1及表2。

2.3 各組HL-60細(xì)胞G1期細(xì)胞百分比比較 苦參堿干預(yù)小鼠G0/G1期的細(xì)胞含量明顯多于造模組（ P <0.05）， 且S期明顯少于造模組（ P <0.05），其中苦參堿A組優(yōu)于苦參堿B組（ P <0.05）。見表3。

2.4 各組外周血IL-2、IL-4、IL-10、IFN-γ濃度變化? 造模組、苦參堿組小鼠外周血IFN-γ、IL-2水平較空白組降低，IL-4、IL-10水平均較空白組升高（ P <0.05），其中苦參堿A組與苦參堿B組比較改善差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（ P <0.05）。見表4。

3 討論

AML是常見的血液疾病，給家庭及社會(huì)帶來巨大打擊，研究AML的治療方案極具臨床意義。AML是造血祖細(xì)胞或干細(xì)胞過度增殖、分化異常或凋亡受抑制，影響了正常造血功能，廣泛浸潤肝、脾、淋巴等重要臟器， 從而出現(xiàn)貧血、出血、反復(fù)感染等不良反應(yīng)。有研究顯示PTEN蛋白的缺失在AML發(fā)生發(fā)展過程占據(jù)重要意義。PTEN是磷酸酶活性的抑癌基因，廣泛參與諸多細(xì)胞生長信號通路，與細(xì)胞諸多生物行為密切相關(guān)[7-8]。PTEN具有蛋白磷酸酶活性和脂質(zhì)磷酸酶活性，通過抑制以酪氨酸激酶為主的磷酸化酶的活性而發(fā)揮抑制癌細(xì)胞生長的作用[9]。本研究制備急性髓系白血病SCID小鼠模型，結(jié)果顯示造模組小鼠外周血白細(xì)胞、淋巴細(xì)胞數(shù)量較空白組明顯升高，中性粒細(xì)胞較空白組明顯下降，這提示造模成功。造模組小鼠PTEN水平較空白組明顯下降，這提示SCID小鼠模型在被成功制備成急性髓系白血病時(shí)機(jī)體的PTEN水平下降，抗癌能力減弱。眾所周知癌細(xì)胞的生長周期紊亂是導(dǎo)致其異常增殖的關(guān)鍵，傳統(tǒng)抗癌藥物多數(shù)是通過將癌細(xì)胞阻滯于G2/M或者S期而實(shí)現(xiàn)治療目的的。本研究通過細(xì)胞周期檢測發(fā)現(xiàn)造模組小鼠G0/G1期的細(xì)胞含量明顯少于其他組，S期細(xì)胞含量明顯多于其他組，這說明體內(nèi)細(xì)胞周期調(diào)控紊亂，從而導(dǎo)致惡性腫瘤的發(fā)生，進(jìn)一步證實(shí)造模成功。

苦參堿是中藥苦參的主要成分，大量臨床藥理研究證實(shí)苦參堿具有多種類藥理作用，包括保肝、抗病毒、升高白細(xì)胞、抗心血管疾病等。近年來苦參堿 的抗癌效應(yīng)尤受關(guān)注。張文陸等[10]通過研究發(fā)現(xiàn)苦參堿可誘導(dǎo)人胃癌細(xì)胞SGC-7901的凋亡，從而實(shí)現(xiàn)抗胃癌效應(yīng);楊靜波等[11]亦通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)苦參堿可抑制肝癌細(xì)胞SMMC-7721的增殖，且具有明顯的劑量依賴性。本研究對急性髓系白血病SCID小鼠模型進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示苦參堿可明顯延長急性髓系白血病SCID小鼠的生存周期，并且提高其體質(zhì)量，改善其血細(xì)胞的水平。在細(xì)胞周期檢測中我們發(fā)現(xiàn)苦參堿干預(yù)小鼠G0/G1期的細(xì)胞含量明顯多于造模組（ P <0.05），且S期明顯少于造模組（ P <0.05），其中苦參堿A組優(yōu)于苦參堿B組（ P <0.05），提示苦參堿可影響腫瘤細(xì)胞的周期而抑制癌細(xì)胞增殖，實(shí)現(xiàn)抗癌效應(yīng)，且具有一定的劑量依賴性。

急性髓系白血病患者出現(xiàn)明顯的貧血、出血、發(fā)熱、感染等癥狀，有資料[12-14]顯示與免疫功能紊亂關(guān)系密切，Th1、Th2細(xì)胞廣泛參與機(jī)體的免疫應(yīng)答過程[15-16]，IFN-γ、IL-2是Th1的標(biāo)志性指標(biāo)，IL-4及IL-10則是Th2的標(biāo)志性指標(biāo)，Th1與Th2處于相互調(diào)節(jié)、相互抗衡的動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài)，如果其中指標(biāo)出現(xiàn)異常，則破壞Th1與Th2的動(dòng)態(tài)平衡[17-18]，急性髓系白血病患者機(jī)體亦存在Th1與Th2的動(dòng)態(tài)平衡受破壞，故恢復(fù)Th1與Th2的動(dòng)態(tài)平衡是治療該病的關(guān)鍵。研究中發(fā)現(xiàn)造模組、苦參堿組小鼠外周血IFN-γ、IL-2水平較空白組降低，IL-4、IL-10水平均較空白組升高，其中苦參堿A組較苦參堿B組改善，提示調(diào)整Th1與Th2的動(dòng)態(tài)平衡可能是苦參堿有效治療急性髓系白血病的作用機(jī)制之一。

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（2019-05-15收稿 責(zé)任編輯：芮莉莉）

基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（81460027）;內(nèi)蒙古自治區(qū)自然科學(xué)資助基金項(xiàng)目（2018MS08070）作者簡介：王穎（1980.08—），女，碩士研究生，主治醫(yī)師，研究方向：急性白血病的治療，E-mail：cfwy1980@163.com