扶正解毒化瘀方對脂多糖誘導(dǎo)大鼠肺巨噬細胞的調(diào)控作用

崔蘭鳳 徐紅日 王玉婷 趙世同 王成祥

摘要? 目的：觀察扶正解毒化瘀方對脂多糖誘導(dǎo)的大鼠肺巨噬細胞中NLRP3炎性體通路及相關(guān)炎性反應(yīng)遞質(zhì)的作用。方法：將大鼠NR8383細胞分為空白組、模型組、扶正解毒化瘀方組、哌拉西林他唑巴坦（TZP）組以及中藥+TZP組。用制備扶正解毒化瘀方中藥原液作用于脂多糖誘導(dǎo)的大鼠NR8383細胞，采用qPCR和Western blotting分別檢測NLRP3炎性體通路的mRNA表達和蛋白水平，酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）檢測干預(yù)前后炎性反應(yīng)遞質(zhì)的水平。結(jié)果：扶正解毒化瘀方組和TZP組均能明顯降低NLRP3、Caspase-1和ASC的mRNA表達，2組NLRP3和ASC的蛋白水平明顯下降，Caspase-1和IL-1β蛋白水平也有下降趨勢。扶正解毒化瘀方組和TZP組均能明顯降低IL-18和IL-1β炎性反應(yīng)遞質(zhì)水平，聯(lián)合用藥有增效作用。結(jié)論：扶正解毒化瘀方對NLRP3炎性體作用明確，可能通過NLRP3炎性體通路延緩機體免疫炎性損傷。

關(guān)鍵詞? 扶正解毒化瘀方;多重耐藥銅綠假單胞菌;NLRP3炎性體;固有免疫;脂多糖

Study on Regulatory Effect of Fuzheng Jiedu Huayu Decoction on Lung Macrophages Induced by LPS in Rats

CUI Lanfeng1，XU Hongri1，WANG Yuting2，ZHAO Shitong2，WANG Chengxiang1

（1 The Third Affiliated Hospital of Beijing University of Chinese Medicine，Beijing 100029，China; 2 Dongzhimen Hospital of Beijing University of Chinese Medicine，Beijing 100700，China）

Abstract Objective： To observe the effect of Fuzheng Jiedu Huayu Decoction on the NLRP3 inflammasome pathway and related inflammatory factors in rats′ lung macrophages induced by LPS. Methods： Original liquid of Fuzheng Jiedu Huayu Decoction was prepared and applied on LPS-induced NR8383 rat cells.They were divided into blank group，model group，F(xiàn)uzheng Jiedu Huayu Decoction group，piperacillin-tazobactam（TZP）group and combination group.The qPCR and western-blot were used to detect the expression of mRNA and protein level of the NLRP3 inflammasome pathway，respectively.ELISA was used to detect levels of inflammatory factors before and after the intervention. Results： Both Fuzheng Jiedu Huayu Decoction and TZP could significantly reduce the mRNA expressions of NLRP3，Caspase-1 and ASC.The protein levels of NLRP3 and ASC in the 2 groups were decreased significantly.The protein levels of Caspase-1 and IL-1β also showed a decreasing trend.Both Fuzheng Jiedu Huayu Decoction and TZP could significantly reduce the levels of IL-18 and IL-1β inflammatory factors.And the combination of drugs produced a synergistic effect. Conclusion： Fuzheng Jiedu Huayu Decoction has a certain effect on NLRP3 inflammasome，which may delay immune inflammatory injury of the body through the NLRP3 inflammasome pathway.

Keywords? Fuzheng Jiedu Huayu Decoction; Multidrug-resistant pseudomonas aeruginosa（MDRPA）; NLRP3 inflammasome; Innate immunity; LPS

中圖分類號：R254;R289.5 文獻標(biāo)識碼：A? doi： 10.3969/j.issn.1673-7202.2020.04.012

老年人基礎(chǔ)疾病較多，機體免疫功能低下，是老年人易發(fā)生細菌耐藥的關(guān)鍵[1]。耐藥菌感染致病菌以革蘭陰性桿菌為主，尤以銅綠假單胞菌（Pseudomonas Aeruginosa，PA）多見。耐藥PA感染顯著增加ICU患者的死亡率，數(shù)據(jù)表明，13% ～18%的患者死因歸于敏感PA感染，而54.4%的死亡與多重耐藥銅綠假單胞菌（Multiple-drug Resistant Pseudomonas Aeruginosa，MDRPA）感染有關(guān)[2]。PA感染可以激活機體固有免疫系統(tǒng)的TLRs、NODs等受體，促發(fā)炎性級聯(lián)反應(yīng)而引起免疫炎性損傷。PA引起肺部感染的毒力因子眾多，其中通過分泌脂多糖（Lipopolysaccharide，LPS）等不同方式與TLRs或NODs結(jié)合從而激發(fā)免疫炎性反應(yīng)是主要的致病機制[3-4]。同時，NOD2參與PA感染致機體免疫炎性損傷的過程與TLR4/NF-κB通路聯(lián)系緊密[5]。NLRP3炎性體是NOD2的典型代表，NF-κB、TNF-α、IL-1β能夠引起NLRP3炎性體的表達，促進半胱天冬酶-1（Caspase-1）的活化[6]。活化的Caspase-1促進IL-1β或IL-18的成熟和釋放，引起機體的炎性反應(yīng)。

老年人肺炎屬于老年風(fēng)溫肺熱病范疇，王成祥教授認為其基本病機為“正氣虧虛，毒瘀互結(jié)”[7]。據(jù)此核心病機設(shè)立的扶正解毒化瘀方由西洋參、黃芩、連翹、漏蘆、敗醬草、赤芍、瓜蔞、生薏苡仁組成，“十一五”國家科技支撐計劃項目表明，與標(biāo)準(zhǔn)抗感染治療比較，聯(lián)合扶正解毒化瘀方能夠改善病程達2周以上老年患者的肺部影像學(xué)征象，并減輕臨床癥狀[8-9]。同時，扶正解毒化瘀方能夠通過敏化抗菌藥物和破壞細菌細胞壁，降低PA的耐藥性，并且可減少IL-1β的分泌，降低PA誘導(dǎo)的炎性損傷。本課題組已從TLRs胞外識別系統(tǒng)的角度，探索了扶正解毒化瘀方延緩免疫炎性損傷的機制。本研究從該方對NLRP3炎性體通路及有關(guān)細胞因子的影響入手，觀察其對NODs胞內(nèi)識別系統(tǒng)的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞株 大鼠NR8383細胞（上海中喬新舟Cat.ZQ0142），用含20%的胎牛血清的F12培養(yǎng)基于37 ℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.1.2 藥物

扶正解毒化瘀方由黃芩、連翹、漏蘆、赤芍、瓜蔞、西洋參、敗醬草和生薏苡仁組成，以上藥物由北京康仁堂藥業(yè)有限公司制備成顆粒劑。中藥原液制備：使用去離子水配制，濃度為1.56 g/mL，過濾后4 ℃保存。對照組使用注射用哌拉西林他唑巴坦鈉（TZP）（惠氏，AKGD/11）。

1.1.3 試劑與儀器

F12基礎(chǔ)培養(yǎng)基（中喬新舟，ZQ400），F(xiàn)BS胎牛血清（Gibco，10099133），IL-1β（成志科為，Su-B30206）及IL-18 ELISA試劑盒（成志科為，Su-B30204）;NLRP3兔抗（博士德生物，BM4490）、ASC兔抗（正能生物，340097）、Caspase-1兔抗（Gibco，Ab109362）和IL-1β兔抗（Gibco，ab9722）;生物倒置顯微鏡（日本OLYMPUS，CKX41）、細胞培養(yǎng)箱（Thermo Fisher，HERAcell 150i）、離心機（Thermo Fisher，ST16）、熒光定量PCR儀（ABI，7500）。

1.2 方法

1.2.1 分組與模型制備

使用F12培養(yǎng)基（胎牛血清含量20%），于37 ℃、CO2含量5%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)NR8383細胞。倒置顯微鏡下觀察細胞生長，每隔2～3 d換液。待培養(yǎng)瓶中細胞生長到80%左右，收集細胞并轉(zhuǎn)移至無菌離心管，離心4 min，（1 000 r/min）棄上清，并轉(zhuǎn)移至新的無菌培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)，比例為1∶ 3。收集對數(shù)生長期細胞，在完全培養(yǎng)基中重新懸浮，調(diào)整濃度至1×105細胞/mL，隨后接種至6孔板中，每孔2 mL。依干預(yù)措施不同，分為空白組、模型組、扶正解毒化瘀方組、哌拉西林他唑巴坦（TZP）組以及中藥+TZP組。

1.2.2 干預(yù)方法

空白組以含胎牛血清（FBS）的F12培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng);模型組則加入終濃度為10 μg/mL的LPS;扶正解毒化瘀方組中加入扶正解毒化瘀方原液以及終濃度10 μg/mL的LPS;哌拉西林他唑巴坦（TZP）組加入4.5 μg/mL的哌拉西林他唑巴坦鈉（TZP）溶液以及終濃度為10 μg/mL的LPS;聯(lián)合用藥組加入終濃度為10 μg/mL的LPS、中藥原液及4.5 μg/mL的TZP。繼續(xù)培養(yǎng)48 h，離心，收集細胞上清及沉淀，分別用于酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）檢測細胞因子和qPCR及Western-blot實驗。

1.2.3 檢測指標(biāo)與方法

1.2.3.1 qPCR檢測NLRP3炎性體各因子的mRNA表達水平

通過qPCR檢測NLRP3、Caspase-1等mRNA表達水平，引物序列見表1。

取上述方法處理的細胞沉淀，提取總RNA。75%乙醇洗滌后，加入20 μL無RNA酶的水溶解RNA，進行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。配制反應(yīng)體系：、PCR上游引物2.0 μL、PCR下游引物2.0 μL、cDNA 2.0 μL、50×Rox參比染料0.4 μL、ddH2O 3.6 μL。PCR擴增條件：預(yù)變性，95 ℃ 10 min，1個循環(huán);95 ℃ 10 s，55 ℃ 20 s，72 ℃ 35 s，40個循環(huán)。循環(huán)結(jié)束后溫度升高至95 ℃獲取熔解曲線。

1.2.3.2 Western blotting檢測NLRP3炎性體蛋白表達

裂解細胞，收集總蛋白溶液，通過BCA法測定樣品蛋白濃度。按照4：1的比例加入5×SDS上樣緩沖液并混勻，置于沸水中5 min后立即置于冰上3 min。電泳：10% SDS-PAGE凝膠電泳（濃縮膠電壓75 V，分離膠電壓120 V），至溴酚藍剛跑出時終止;200 mA條件下轉(zhuǎn)膜1 h。免疫反應(yīng)：將轉(zhuǎn)好的膜于5%脫脂牛奶中室溫封閉1 h;稀釋一抗（TBST溶解的5%脫脂牛奶，磷酸化蛋白使用TBST溶解的5% BSA），4 ℃過夜;TBST清洗3次，每次5 min脫色;5%脫脂牛奶稀釋二抗，室溫孵育30 min。暗室曝光、顯影、定影。Image J軟件獲取圖像、處理分析目標(biāo)帶的吸光度A值。

1.2.3.3 ELISA檢測炎性反應(yīng)遞質(zhì)水平

設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)品孔、樣本孔及空白孔。標(biāo)準(zhǔn)品孔加入不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品50 μL，樣本孔加入待測樣本50 μL，之后各孔加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的抗體100 μL，封孔，37 ℃孵育60 min。重復(fù)洗滌5次后，每孔加入底物50 μL，37 ℃避光孵育15 min。加入終止液50 μL，15 min內(nèi)于450 nm波長處測定各孔A值。將標(biāo)準(zhǔn)品及樣本值減去空白孔數(shù)值后繪制曲線。以標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)，A450數(shù)值為縱坐標(biāo)，使用ELISACalc軟件制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算樣品濃度。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 21.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行處理，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（? ±s ）表示，組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，方差不齊時，使用方差單變量分析。以 P <0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 qPCR檢測NLRP3炎性體mRNA水平

與空白組比較，模型組NLRP3、Caspase-1以及ASC的mRNA水平明顯升高。與模型組比較，扶正解毒化瘀方組和TZP組NLRP3的mRNA水平明顯降低（ P <0.05），但中藥和TZP作用差異無統(tǒng)計學(xué)意義（ P =0.173），中藥+TZP組優(yōu)于扶正解毒化瘀方組或TZP組（ P <0.05）。模型組ASC表達明顯升高，扶正解毒化瘀方組和TZP組較模型組明顯降低（ P <0.05），但扶正解毒化瘀方組和TZP組作用差異無統(tǒng)計學(xué)意義（ P =0.223），中藥+TZP組優(yōu)于扶正解毒化瘀方組或TZP組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（ P <0.05）。TZP組對Caspaes-1的作用優(yōu)于扶正解毒化瘀方組（ P <0.05），中藥+TZP組優(yōu)于扶正解毒化瘀方組或TZP組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（ P <0.05）。見圖1和圖2。

模型組IL-1β mRNA表達明顯升高，扶正解毒化瘀方組能夠降低IL-1β的mRNA水平，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（ P >0.05）。TZP組及中藥+TZP組IL-1β的表達較模型組降低（ P <0.05），且中藥+TZP組優(yōu)于扶正解毒化瘀方組（ P =0.024），但與TZP組差異無統(tǒng)計學(xué)意義（ P =0.608）。見圖2。

2.2 Western-blot檢測NLRP3炎性體蛋白水平

與空白組比較，模型組NLRP3蛋白水平明顯升高（ P <0.05）。扶正解毒化瘀方組和TZP組較模型組NLRP3蛋白水平降低，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（ P >0.05），扶正解毒化瘀方+TZP組則能明顯降低NLRP3水平（ P =0.014）。模型組ASC水平明顯升高（ P <0.05），扶正解毒化瘀方組、TZP組以及扶正解毒化瘀方+TZP組均能降低ASC蛋白水平，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（ P <0.05），但3組相互之間作用差異無統(tǒng)計學(xué)意義（ P >0.05）。模型組Caspase-1和IL-1β蛋白水平有所升高，扶正解毒化瘀方組、TZP組以及扶正解毒化瘀方+TZP組均能降低Caspase-1和IL-1β的蛋白水平，但各組差異無統(tǒng)計學(xué)意義（ P >0.05）。見圖3～4。

各組蛋白水平灰度條帶如圖5。

2.3 各組炎性細胞因子水平

模型組IL-1β細胞因子水平明顯升高，扶正解毒化瘀方組、TZP組以及扶正解毒化瘀方+TZP組均能夠有效降低IL-1β水平，TZP組作用優(yōu)于扶正解毒化瘀方組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（ P <0.05）。扶正解毒化瘀方+TZP組優(yōu)于扶正解毒化瘀方組（ P <0.05），但與TZP組差異無統(tǒng)計學(xué)意義（ P =0.407）。模型組IL-18水平明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（ P <0.05），扶正解毒化瘀方組、TZP組以及扶正解毒化瘀方+TZP組均能有效降低IL-18水平，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（ P <0.05），TZP組作用優(yōu)于扶正解毒化瘀方組（ P =0.033）。扶正解毒化瘀方+TZP組優(yōu)于扶正解毒化瘀方組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（ P <0.05），但與TZP組差異無統(tǒng)計學(xué)意義（ P =0.347）。見圖6。

3 討論

對303例老年人肺炎的證候?qū)W分析表明，“熱毒熾盛、毒瘀互結(jié)、正氣虧虛”的基本病機貫穿老年風(fēng)溫肺熱病始終。扶正解毒化瘀方依據(jù)此核心病機確立，經(jīng)液相色譜-質(zhì)譜分析，扶正解毒化瘀方全方共鑒別出10個化學(xué)成分，分別為槲皮素、芍藥苷、木犀草素、野黃芩苷、連翹酯苷H、異葒草苷、連翹苷、人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1、人參皂苷Re，全方入血發(fā)揮作用的成分主要為芍藥苷、連翹酯苷H、人參皂苷Rb1[10]。芍藥總苷可以通過阻斷TLR4/5信號通路從而減輕免疫介導(dǎo)的炎性反應(yīng)[11]，且芍藥苷有明顯的免疫調(diào)節(jié)作用[12]。連翹酯苷是連翹的主要活性成分，有學(xué)者發(fā)現(xiàn)連翹酯苷對銅綠假單胞菌的黏附性和生物被膜有較強的抑制作用[13]，還可降低LPS誘導(dǎo)的肉雞胸腺內(nèi)的TNF-α和IL-6的含量[14]。人參皂苷Rb1對脂多糖誘導(dǎo)的大鼠腸系膜微循環(huán)障礙有一定保護作用[15]，并且能夠緩解TNF-α引起的動脈粥樣硬化，而這一過程可能與抑制NF-κB通路有關(guān)[16]。可見，扶正解毒化瘀方不僅符合老年風(fēng)溫肺熱病的基本病機，從現(xiàn)代藥理學(xué)角度，其主要成分也具備抗炎、調(diào)節(jié)免疫等作用。

NLRP3炎性體是NOD2的典型代表。PA感染過程中Caspase-1的激活或者是直接通過細菌的植入，或者是通過間接途徑，即通過激活NLRs進而釋放炎性反應(yīng)遞質(zhì)IL-1β和IL-18[17]，誘發(fā)機體的免疫炎性反應(yīng)。炎性體被激活時，NLRP3招募適配器凋亡相關(guān)微粒蛋白（ASC）和Caspase-1，之后NLRP3寡聚體化使pro-caspase-1在空間距離上接近，并通過自身切割形成成熟的Caspase-1。Caspase-1活化促使無活性的IL-1β前體轉(zhuǎn)化為成熟而有活性的形式并分泌到細胞外。IL-1β進一步激活I(lǐng)L-1受體復(fù)合體，促進IL-8、TNF-α和IL-17等多種細炎性反應(yīng)遞質(zhì)活化，引起炎性級聯(lián)反應(yīng)。另外，NLRP3炎性體還可調(diào)控IL-1β的下游加工。NLRP3的mRNA表達增加可導(dǎo)致IL-1β前體的過度合成與釋放，從而誘導(dǎo)大量炎性反應(yīng)遞質(zhì)產(chǎn)生[18-19]。PA感染時，Caspase-1的激活和IL-1β的分泌隨著時間和感染量的增加而增多[20]。

NLRP3炎性體已被證明與哮喘、COPD、肺炎支原體肺炎、急性肺損傷等都有密切關(guān)系，而中藥對以上過程均有一定的調(diào)控作用。黃芩的主要成份黃芩苷能夠抑制NLRP3的表達，減少炎性反應(yīng)因子TNF-α，IL-18和IL-1β的分泌從而發(fā)揮抗炎作用[21]。知母皂苷是知母的主要成分，其能夠下調(diào)NLRP3上游NF-κ BiNOS-NO信號通路從而降低相關(guān)炎性因子的過度表達[22]。另外，中藥薯蕷皂苷可有效抑制NLRP3炎性體的表達，其機制是通過抑制NF-κB信號通路及ROS的釋放而實現(xiàn)[23]。在本研究中，扶正解毒化瘀方能降低NLRP3蛋白水平，與TZP聯(lián)用時作用更為明顯;同時能降低IL-1β的mRNA表達，還能明顯降低ASC蛋白水平。另外，扶正解毒化瘀方聯(lián)合TZP能夠明顯降低炎性因子IL-1β和IL-18的水平。該結(jié)果表明扶正解毒化瘀方能夠通過調(diào)節(jié)NLRP3炎性體的作用從而降低LPS誘導(dǎo)的免疫炎性反應(yīng)，與西藥聯(lián)用或許有增效作用。據(jù)此，通過中藥干預(yù)NLRP3炎性體從而延緩機體的免疫炎性損傷具有一定的指導(dǎo)意義。

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（2019-07-26收稿 責(zé)任編輯：楊覺雄）

基金項目：國家自然科學(xué)基金項目（81573924）作者簡介：崔蘭鳳（1989.02—），女，博士研究生，研究方向：中醫(yī)藥防治呼吸系統(tǒng)感染性疾病，E-mail：xiaocui165@126.com通信作者：王成祥（1963.06—），男，博士，主任醫(yī)師，研究方向：中醫(yī)藥防治呼吸系統(tǒng)感染性疾病，E-mail：wang601@vip.sina.com