基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對接法探尋清宣止咳顆粒治療兒童新型冠狀病毒肺炎活性化合物

宗陽 姚衛(wèi)峰 單進軍 汪受傳

摘要 ?目的：探尋清宣止咳顆粒治療兒童新型冠狀病毒肺炎（COVID-19）的活性化合物。方法：借助中藥系統(tǒng)藥理學(xué)分析平臺（TCMSP）檢索清宣止咳顆粒中桑葉、薄荷、苦杏仁、桔梗、白芍、枳殼，陳皮、紫菀、甘草的化學(xué)成分和作用靶點。通過UniProt、GeneCards等數(shù)據(jù)庫查詢靶點對應(yīng)的基因，進而運用Cytoscape 3.7.2構(gòu)建化合物-靶點（基因）網(wǎng)絡(luò)，通過DAVID進行基因本體（GO）功能富集分析和基于京都基因與基因組百科全書（KEGG）通路富集分析，預(yù)測其作用機制。結(jié)果：化合物-靶點網(wǎng)絡(luò)包含141個化合物和相應(yīng)靶點292個，關(guān)鍵靶點涉及PTGS2、ESR1、HSP90AA1、CALM1、AR等。GO功能富集分析得到GO條目339個（ P <0.05），其中生物過程（BP）條目244個，細(xì)胞組成（CC）條目33個，分子功能（MF）條目62個。KEGG通路富集篩選得到96條信號通路（ P <0.05），涉及小細(xì)胞肺癌、非小細(xì)胞肺癌、T細(xì)胞受體信號通路等。分子對接結(jié)果顯示槲皮素、山柰酚、木犀草素等核心化合物與新冠病毒的親和力與推薦用藥相似。結(jié)論：清宣止咳顆粒中的有效活性成分可能通過作用于PTGS2、HSP90AA1、ESR1等靶點調(diào)節(jié)多條信號通路從而抑制新型冠狀病毒肺炎作用。

關(guān)鍵詞 ?清宣止咳顆粒;新型冠狀病毒肺炎;網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué);分子對接;槲皮素;山柰酚;木犀草素

Discussion on the Active Compounds of Qingxuan Zhike Granule in Treatment of Pediatric Coronavirus Disease 2019 Based on Network Pharmacology and Molecular Docking Method

ZONG Yang1，2，YAO Weifeng3，SHAN Jinjun4，WANG Shouchuan4

（1 Suzhou TCM Hospital Affiliated to Nanjing University of Chinese Medicine，Suzhou 215009，China; 2 Suzhou Academy of Wumen Medical School，Suzhou 215009，China; 3 School of Pharmacy，Nanjing University of Chinese Medicine，Nanjing 210023，China; 4 Key Laboratory of Pediatric Respiratory Diseases （TCM），Nanjing University of Chinese Medicine，Nanjing 210023，China）

Abstract Objective： To explore the active compounds of Qingxuan Zhike Granule for treatment of pediatric Coronavirus disease 2019 （COVID-19）. Methods： With the help of the Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform （TCMSP），the chemical constituents and action targets of mulberry leaf，peppermint，bitter apricot seed，platycodon root，debark peony root，orange fruit，dried tangerine peel，tatarian aster root，liquorice root in Qingxuan Zhike granules were retrieved.The genes corresponding to the target were queried through databases such as UniProt and GeneCards，and then Cytoscape 3.7.2 was used to build a compound-target （gene） network，gene ontology （GO） function enrichment analysis was perform through DAVID，based on the Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes （KEGG ） Path enrichment analysis，its mechanism was predicted. Results： The compound-target network contains 141 compounds and 292 corresponding targets.The key targets are PTGS2，ESR1，HSP90AA1，CALM1，AR，etc.GO function enrichment analysis obtained 339 GO entries （ P <0.05），of which 244 were biological process （BP） entries，33 were cell composition （CC） entries，and 62 were molecular function （MF） entries.The KEGG Path enrichment analysis obtained 96 signal pathways （ P <0.05），involving small cell lung cancer，non-small cell lung cancer，and T cell receptor signaling pathways.The molecular docking results showed that the core compounds such as quercetin，Kaempferol，luteolin and the like had similar affinity to the COVID-19 virus as the recommended drugs. Conclusion： The active ingredients in Qingxuan Zhike granules may regulate multiple signaling pathways by acting on targets such as PTGS2，HSP90AA1，and ESR1，thereby inhibiting COVID-19.

Keywords ?Qingxuan Zhike granules; Coronavirus disease 2019; Network pharmacology; Molecular docking ; Quercetin; Kaempferol; Luteolin

中圖分類號：R272.5;R512.99 文獻標(biāo)識碼：A? doi： 10.3969/j.issn.1673-7202.2020.04.001

2019年底湖北省武漢市出現(xiàn)新型冠狀病毒肺炎疫情。2020年2月11日，世界衛(wèi)生組織總干事譚德塞在瑞士日內(nèi)瓦宣布，將新型冠狀病毒感染的肺炎命名為“Coronavirus Disease 2019（COVID-19）”[1]，結(jié)構(gòu)由上?？萍即髮W(xué)饒子和/楊海濤課題組測定的新冠病毒3CL水解酶（Mpro）的高分辨率晶體結(jié)構(gòu)（PDB ID：6LU7）。見圖1。COVID-19患者的臨床表現(xiàn)為：以發(fā)熱、乏力、干咳為主要表現(xiàn)，鼻塞、流涕等上呼吸道癥狀少見[2]。2020年2月19日，國家衛(wèi)健委發(fā)布了《新型冠狀病毒肺炎診療方案（試行第六版）》，以下簡稱第六版診療方案。針對COVID-19的治療目前尚無特效藥，第六版診療方案中采取了中西醫(yī)結(jié)合治療的方案針對于輕、中、重度患者進行了分類治療。中醫(yī)藥作為我國傳統(tǒng)的文化瑰寶，它不僅有著完整的理論體系指導(dǎo)而且在歷朝歷代重大疾病尤其是特殊新疾病中都發(fā)揮著不可替代的作用，如何從中醫(yī)藥寶庫中尋找出治療COVID-19的中藥處方以及活性化合物成為當(dāng)下中醫(yī)藥科研工作者的當(dāng)務(wù)之急。

針對COVID-19患兒，多個省份（湖南、廣西、河南和遼寧等）出臺了專門的兒童中醫(yī)治療方案，其中清宣止咳顆粒作為中期肺胃熱盛者的推薦用藥。清宣止咳顆粒由桑葉、薄荷、桔梗、白芍等9味中藥組成的復(fù)方制劑，具有疏風(fēng)清熱、宣肺止咳的功效，用于小兒外感風(fēng)熱咳嗽，證見：咳嗽，咯痰，發(fā)熱或鼻塞，流涕，微惡風(fēng)寒，咽紅或痛[3]。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是基于系統(tǒng)生物學(xué)的原理闡釋疾病發(fā)展的過程，進一步利用網(wǎng)絡(luò)平衡的整體觀來認(rèn)識藥物與機體相互作用的一門學(xué)科，具有“多基因、多靶點”的特點[4]。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)強調(diào)疾病的發(fā)生發(fā)展是一個長期、復(fù)雜的動態(tài)過程，并認(rèn)為疾病的本質(zhì)是復(fù)雜生物網(wǎng)絡(luò)的失衡，亦即網(wǎng)絡(luò)中的基因或其產(chǎn)物等多個靶點處于功能失衡狀態(tài)，網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)開創(chuàng)了一種多靶點與多種疾病間復(fù)雜網(wǎng)狀關(guān)系的新型模式，在復(fù)雜疾病發(fā)病機制及治療靶標(biāo)的研究方面具有重要的應(yīng)用價值[5]。分子對接是利用計算機技術(shù)研究小分子間配體和受體生物大分子相互作用，預(yù)測其結(jié)合模式和親和力進而實現(xiàn)基于結(jié)構(gòu)的藥物設(shè)計的一種重要的方式[6]。本研究擬通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)篩選出清宣止咳顆粒作用靶點進行聚類分析，得出清宣止咳顆粒中核心活性化合物，進而運用分析軟件對化合物-靶點進行分子對接以及代謝通路分析等，為后期的深入研究以及新藥開發(fā)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料 本研究實驗材料為數(shù)據(jù)庫和分析軟件，數(shù)據(jù)庫包括中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫和分析平臺TCMSP[7]（http：//tcmspw.com/tcmsp.php）、人類基因數(shù)據(jù)庫GeneCards[8]（https：//www.genecards.org/），蛋白質(zhì)靶點數(shù)據(jù)庫Uniprot[9]（https：//www.uniprot.org/）、信號通路分析數(shù)據(jù)庫DAVID[10]（https：//david.ncifcrf.gov/）和蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫PDB[11]（https：//www.rcsb.org）;分析軟件包括網(wǎng)絡(luò)分析工具Cytoscape 3.7.2[12]、化合物結(jié)構(gòu)繪制軟件ChemBio Draw Ultra 14.0、分子對接軟件Auto Dock Vina和分子對接作圖軟件PyMOL。

1.2 清宣止咳顆粒中化學(xué)成分收集 借助中藥系統(tǒng)藥理學(xué)分析平臺，以“桑葉”“薄荷”“苦杏仁”“桔?！薄鞍咨帧薄拌讱ぁ薄瓣惼ぁ薄白陷摇薄案什荨睓z索清宣止咳顆粒中的化合物組成和靶點等信息。

1.3 清宣止咳顆粒中活性化合物級靶點的篩選?? ?口服利用度（OB）是藥代動力學(xué)研究中的重要參數(shù)，常用于新藥研究中評價口服藥物的成藥性，類藥性（DL）是指化合物與已知藥物的相似性，是化合物能夠成為藥物的評價指標(biāo)[13-14]。因此，運用TCMSP平臺的OB值和DL值篩選功能，其中OB>30%且DL>0.18，篩選后得到每味藥材的潛在活性成分，并通過ChemOffice軟件繪制其二維結(jié)構(gòu)備用。在此基礎(chǔ)上，得到上述化學(xué)成分的相關(guān)靶點蛋白，并用Uniport數(shù)據(jù)庫查詢靶標(biāo)對應(yīng)的基因名。

1.4 化合物-靶點網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建 運用Cytoscape 3.7.2軟件構(gòu)建“成分-靶點”網(wǎng)絡(luò)，通過Network Analyzer功能對網(wǎng)絡(luò)節(jié)點中心性進行分析，以Degree值為篩選條件，Degree值越高，則該成分與更多的靶點相關(guān)，從而分析清宣止咳顆粒中的核心化合物和核心作用靶點。

1.5 核心靶點通路分析 將清宣止咳顆粒核心作用靶點的基因?qū)隓AVID數(shù)據(jù)庫，以 P <0.05進行GO功能及KEGG通路富集分析，得到清宣止咳顆?；钚曰衔镒饔冒悬c的主要生物功能和通路過程，以及其與新冠肺炎潛在的關(guān)聯(lián)關(guān)系與作用機制中可能性較大的通路，根據(jù)排序繪制條形圖。

1.6 成分-靶點分子對接 ?先用ChemOffice軟件構(gòu)建化合物的3D結(jié)構(gòu)保存為*mol2格式并使其能量最小化。從PDB數(shù)據(jù)下載新冠病毒的3D結(jié)構(gòu)*PDB格式，運用PyMOL軟件對蛋白質(zhì)進行去水、加氫等操作，利用Auto Dock軟件將化合物及靶蛋白格式轉(zhuǎn)換為*pdbqt格式，最后運行Vina進行對接。

2 結(jié)果

2.1 活性化合物和靶點的篩選 通過TCMSP數(shù)據(jù)庫檢索后，符合條件OB≥30%，DL≥0.18的化合物共有199個。其中桑葉中29個，薄荷中10個，苦杏仁中19個，桔梗中7個，白芍中13個，枳殼中5個，陳皮中5個，紫菀中19個，甘草中92個。另外，根據(jù)TCMSP化合物靶點信息，共收錄上述成分的作用靶點292個。清宣止咳顆粒中含有的前40個活性化合物基本信息見表1。

2.2 化合物-靶點網(wǎng)絡(luò)分析 通過Cytoscape 3.7.2 Network Analyzer分析得出，化合物-靶點網(wǎng)絡(luò)總共包括433個節(jié)點（141個化合物節(jié)點、292個靶點節(jié)點）和2 391條邊。見圖2。經(jīng)過Degree打分排序可以得出，化合物-靶點網(wǎng)絡(luò)中，Degree排名前5位的化合物分別是MOL000098-槲皮素、MOL000422-山柰酚、MOL000006-木犀草素、MOL003896-7-甲氧基-2甲基異黃酮、MOL000392-芒柄花黃素，分別能與150、62、57、43、39個靶點蛋白發(fā)生相互作用。從靶點的角度，Degree排名前5位的是PTGS2、ESR1、HSP90AA1、CALM1、AR，分別能與115、88、87、83、78個化合物發(fā)生相互作用。

2.3 清宣止咳顆粒中交集化合物 由2.2可知清宣止咳顆粒中不同的中藥里面存在相同的化合物的情況，通過在線韋恩圖求得，除了桑葉和薄荷沒有交集化合物之外，其他7味藥之間均存在交集現(xiàn)象，尤 其是甘草，苦杏仁與甘草共有7種化合物。見圖3、表2。

2.4 核心靶點的生物信息學(xué)分析結(jié)果 根據(jù) P <0.05為篩選條件，DAVID中GO功能富集分析得到GO條目339個，其中生物過程（BP）條目244個，細(xì)胞組成（CC）條目33個，分子功能（MF）條目62個。見圖4。

KEGG通路富集篩選得到96條信號通路（ P <0.05），涉及小細(xì)胞肺癌、非小細(xì)胞肺癌、T細(xì)胞受體信號通路等，其中小細(xì)胞肺癌通路涉及 PIK3CG-AKT1-CCND1-CASP9-PTGS2-RXRB-BCL2- RELA-RXRA-TP53-NOS2-CDK4-CDK2;非小細(xì)胞肺癌通路涉及PIK3CG-AKT1-MAPK1-CCND1-CASP9-RXRB-RXRA-TP53-CDK4;T細(xì)胞受體信號通路涉及PIK3CG-AKT1-MAPK1-TNF-MAPK14-RELA-JUN-GSK3B-CDK4。見圖5。

2.5 清宣止咳顆粒中核心活性化合物作用于新冠病毒的分子對接結(jié)果分析 一般認(rèn)為配體與受體結(jié)合的構(gòu)象穩(wěn)定時能量越低，發(fā)生的作用可能性越大。分子對接結(jié)果顯示清宣止咳顆粒中核心活性化合物與新冠病毒的分子對接親和力均小于-20 kJ/mol，由此表明清宣止咳顆粒中核心活性化合物與新冠病毒有較好的結(jié)合活性。見表3、圖6。

3 討論

中醫(yī)認(rèn)為COVID-19屬于“疫病”范疇，源于感受疫癘之氣[16]。第六版診療方案將COVID-19分為醫(yī)學(xué)觀察期、輕型、普通型、重型、危重型和恢復(fù)期。治則治法擬為辟穢化濁，以祛邪為第一要義，以分消濕熱、宣暢氣機為主，把住早期、進展期治療是減少危重癥、降低病死率的關(guān)鍵[17]。從清宣止咳顆粒的適應(yīng)證以及處方組成可以看出，清宣止咳顆粒適用于輕中型COVID-19患者的治療。清宣止咳顆粒源自溫病止咳名方“桑菊飲”，組方用藥以輕藥為主，藥精量少、不傷正氣，口感清甜、可增加兒童服藥依從性，更適合小兒肺臟嬌嫩的生理特點，是治療小兒外感風(fēng)熱咳嗽之良方。既往的實驗研究表明[18]，清宣止咳顆粒對急性支氣管炎模型大鼠的病理損傷有修復(fù)和減輕其損傷作用，能增強大鼠細(xì)胞內(nèi)殺菌作用，增加大鼠的白細(xì)胞移動指數(shù)，提高白細(xì)胞趨向化功能，對氨水刺激小鼠咳嗽具有較強鎮(zhèn)咳作用，增加小鼠氣管酚紅排出量對氣管酚紅排出量。

從網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析結(jié)果可知，清宣止咳顆粒中Degree值最高的5個化合物均屬于黃酮類成分，與目前臨床推薦使用的西藥進行對比，清宣止咳顆粒中核心活性化合物與新冠病毒3CL水解酶的結(jié)合能較為接近尤其是其單體成分山柰酚和木犀草素，結(jié)果與達(dá)原飲篩選的結(jié)果接近[19]。KEGG分析得出的與肺部最為相關(guān)的3條通路中均涉及PIK3CG、AKT1、CCND1和CASP9基因，且均是木犀草素的作用靶點。清宣止咳顆粒中核心活性成分是否通過作用于PIK3CG、AKT1等靶點調(diào)節(jié)小細(xì)胞肺癌通路、非小細(xì)胞肺癌通路和T細(xì)胞受體信號通路從起到抗COVID-19的作用需要進一步研究。

綜上所述，本文利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對接技術(shù)對清宣止咳顆粒中化學(xué)成分、作用靶點和其核心活性化合物以及與新冠病毒結(jié)合能進行了探索性研究，從中可以看出清宣止咳顆粒治療COVID-19是可以通過多成分、多靶點、多通路的協(xié)同作用來發(fā)揮療效的。

參考文獻

[1] Gorbalenya AE，Baker SC，Baric RS，et al.Severe acute respiratory syndrome-related coronavirus：The species and its viruses-a statement of the Coronavirus Study Group [J/OL].BioRxiv，2020，DOI：10.1101/2020.02.07.937862.

[2]王玉光，齊文升，馬家駒，等.新型冠狀病毒（2019-nCoV）肺炎中醫(yī)臨床特征與辨證治療初探[J].中醫(yī)雜志，2020，61（4）：1-6.

[3]任婧昱，姜文紅，曹飛，等.HPLC測定清宣止咳顆粒芍藥苷、橙皮苷含量[J].黑龍江醫(yī)藥，2014，27（5）：1015-1017.

[4]Liu JF，Hu AN，Zan JF，et al.Network Pharmacology Deciphering Mechanisms of Volatiles of Wendan Granule for the Treatment of Alzheimer′s Disease[J].Evid Based Complement Alternat Med，2019，2019：7826769.

[5]Tang F，Tang Q，Tian Y，et al.Network pharmacology-based prediction of the active ingredients and potential targets of Mahuang Fuzi Xixin decoction for application to allergic rhinitis[J].J Ethnopharmacol，2015，176：402-412.

[6]趙麗琴，肖軍海，李松.分子對接在基于結(jié)構(gòu)藥物設(shè)計中的應(yīng)用[J].生物物理學(xué)報，2002，18（3）：263-270.

[7] Ru J，Li P，Wang J，et al.TCMSP：a database of systems pharmacology for drug discovery from herbal medicines[J].J Cheminform，2014，6：13.

[8]Trends M，Chalifa-Caspi V，Prilusky J，et al.GeneCards：Integrating information about genes，proteins and diseases [J].Trends Genet，1997，13（4）：163.

[9]UniProt CT.UniProt：the universal protein knowledgebase[J].Nucleic Acids Res，2018，46（5）：2699.

[10] Huang dW，Sherman BT，Lempicki RA.Systematic and integrative analysis of large gene lists using DAVID bioinformatics resources[J].Nat Protoc，2009，4（1）：44-57.

[11]Burley SK，Berman HM，Kleywegt GJ，et al.Protein Data Bank（PDB）：The Single Global Macromolecular Structure Archive[J].Methods Mol Biol，2017，1607：627-641.

[12]Smoot ME，Ono K，Ruscheinski J，et al.Cytoscape 2.8：new features for data integration and network visualization[J].Bioinformatics，2011，27（3）：431-432.

[13]Wang X，Shen Y，Wang S，et al.PharmMapper 2017 update：a web server for potential drug target identification with a comprehensive target pharmacophore database[J].Nucleic Acids Res，2017，45（W1）：W356-W360.

[14]Davis AP，Grondin CJ，Johnson RJ，et al.The Comparative Toxicogenomics Database：update 2017[J].Nucleic Acids Res，2017，45（D1）：D972-D978.

[15]宗陽，陳婷，董宏利，等.基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)四逆散治療抑郁癥的作用機制探討[J].中草藥，2019，50（20）：4995-5002.

[16]項瓊，莫鄭波，宋恩峰.新型冠狀病毒肺炎中醫(yī)理論與臨床探討[J/OL].醫(yī)藥導(dǎo)報，[2020-02-12].http：//kns.cnki.net/kcms/detail/42.1293.R.20200212.2049.002.html.

[17]鄭文科，張俊華，楊豐文，等.中醫(yī)藥防治新型冠狀病毒感染的肺炎各地診療方案綜合分析[J].中醫(yī)雜志，2020，61（4）：277-280.

[18]阮斌，胡還甫，余林嵐.清宣止咳顆粒對急性支氣管炎模型大鼠的影響[J].首都醫(yī)藥，2010，17（6）：43-44.

[19]宗陽，丁美林，賈可可，等.基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對接法探尋達(dá)原飲治療新型冠狀病毒肺炎（COVID-19）活性化合物的研究[J].中草藥，2020，51（4）：836-844.

（2020-02-24收稿 責(zé)任編輯：王明）

基金項目：國家自然科學(xué)基金項目（81973445，81573554）;江蘇省“六大人才高峰”高層次人才項目（YY026）;蘇州市“科教興衛(wèi)”青年課題（KJXW2019044）;蘇州市科技局指導(dǎo)性課題（SYSD2019149）;蘇州市中醫(yī)醫(yī)院院級科技計劃項目（YQN2017004）作者簡介：宗陽（1991.07—），男，碩士，中藥師，研究方向：中藥藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究，E-mail：1181835152@qq.com通信作者：姚衛(wèi)峰（1979.12—），男，博士，教授，碩士研究生導(dǎo)師，研究方向：中藥藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究，E-mail：yaowf@njucm.edu.cn