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    河南地方豬mtDNA D-loop序列遺傳多樣性及系統(tǒng)進(jìn)化分析

    2020-07-09 10:51:16李新建薛亞輝王明宇段棟棟劉賢喬瑞敏韓雪蕾王克君李秀領(lǐng)
    關(guān)鍵詞:約克夏豬種黑豬

    李新建,薛亞輝,王明宇,段棟棟,劉賢,喬瑞敏,韓雪蕾,王克君,李秀領(lǐng)

    (1.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)牧醫(yī)工程學(xué)院,河南 鄭州 450002; 2.河南省畜牧總站,河南 鄭州 450002)

    哺乳動物線粒體DNA(Mitochondrial DNA,mtDNA)是目前已知的唯一核外遺傳物質(zhì),具有相對分子質(zhì)量小、進(jìn)化速度快、結(jié)構(gòu)簡單、呈母系遺傳等特點(diǎn)。其中,D-loop區(qū)是線粒體DNA的非編碼區(qū),也稱控制區(qū),負(fù)責(zé)調(diào)控線粒體DNA的轉(zhuǎn)錄和復(fù)制,是線粒體DNA中序列和長度變異程度最高的地區(qū),進(jìn)化速度較其他區(qū)域高5~10倍,現(xiàn)已被廣泛應(yīng)用于哺乳動物群體遺傳多樣性、物種親緣關(guān)系和系統(tǒng)發(fā)生等方面的研究。王繼英等[1]研究了山東各豬種的線粒體DNA D-loop區(qū),發(fā)現(xiàn)山東地方黑豬血統(tǒng)單一、遺傳關(guān)系較復(fù)雜。李正杰等[2]研究了藏豬的線粒體DNA D-loop區(qū)的遺傳多樣性,發(fā)現(xiàn)諾爾蓋地區(qū)藏豬遺傳多樣性較高、受人工選擇強(qiáng)度低。趙忠海等[3]對貴州地方豬種的線粒體DNA D-loop區(qū)分析后發(fā)現(xiàn)宗地花豬的遺傳多樣性最為豐富。南陽黑豬、確山黑豬、淮南豬、豫西黑豬是河南省優(yōu)良地方豬品種,具有繁殖力強(qiáng)、肉品質(zhì)高、適應(yīng)性強(qiáng)等特點(diǎn)[4]。20世紀(jì)80年代以來,隨著社會經(jīng)濟(jì)的發(fā)展,消費(fèi)者對高瘦肉率豬肉的需求不斷提升,致使中國引進(jìn)了生長迅速、瘦肉率較高的西方豬種,這直接導(dǎo)致了河南地方豬數(shù)量的急劇下降,使許多優(yōu)秀基因在尚未研究其價(jià)值之前從豬基因庫消失。因此,研究河南省地方豬種的遺傳多樣性和進(jìn)化關(guān)系,對于正確認(rèn)識和評價(jià)地方豬種質(zhì)資源及科學(xué)合理地利用地方豬資源具有重要意義。但目前對河南地方豬種的研究報(bào)道還較少。本研究測定分析了河南各地方豬種mtDNA D-loop區(qū)序列,并結(jié)合GenBank數(shù)據(jù)庫中的序列,在分子水平探討了其遺傳資源多樣性及進(jìn)化關(guān)系,為地方豬種的保種和利用提供依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 樣品采集及保存

    河南及鄰省6個(gè)豬種(南陽黑豬、確山黑豬、豫西黑豬、淮南豬、萊蕪豬、二花臉豬)和野豬的樣品采集信息見表1。采集到的耳組織樣品,置于1 mL 75%乙醇中保存。3個(gè)國外豬種(杜洛克豬、約克夏豬、長白豬)的mtDNA D-loop序列從GenBank下載,序列號為杜洛克豬:AM040623-AM04632、EU660148-EU660151、GQ141897、KF767444,約克夏豬:AM040633-AM040638、GQ141893、GQ169777,長白豬:AM040613-AM040622、GQ141895、GQ169780,共計(jì)38條序列。

    表1 樣品信息Table 1 Sample information

    1.2 基因組DNA的提取及檢測

    采用組織基因組DNA提取試劑盒(DP304,天根生化科技有限公司)提取DNA。利用微量核酸定量儀(Nanodrop2000)和1%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的濃度和質(zhì)量。

    1.3 PCR擴(kuò)增及測序

    利用Primer5.0根據(jù)NCBI上長白豬參考序列(NC_000845)設(shè)計(jì)引物,上游引物為:5′-AGGAGACTAACTCCGCCAT-3′,下游引物為:5′-CGCGGATACTTGCATGTGT-3′,引物由上海生工生物有限公司合成。PCR反應(yīng)體系(25μL):包括40 ngDNA、12.5 μL 2×ES Taq MasterMix(康為世紀(jì)CW2214M)、10 pmol正反向引物、8.5 μL水。擴(kuò)增條件為:預(yù)變性94℃,5 min;變性94℃,30s;退火51.3℃,30 s;延伸72℃,50 s,25個(gè)循環(huán),最后延伸72℃,10 min。PCR產(chǎn)物采用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物,檢測合格后進(jìn)行Sanger雙向測序。

    1.4 序列比對及數(shù)據(jù)分析

    利用Mega7.0軟件進(jìn)行序列的核對編輯和拼接及統(tǒng)計(jì)各序列堿基的組成,采用鄰接法(Neighbor-Joining,NJ法),Kimura 2-parameter模型,重復(fù)抽樣1000次構(gòu)建單倍型NJ系統(tǒng)發(fā)育樹。使用DNAsp6.12軟件統(tǒng)計(jì)單倍型數(shù)量、單倍型多樣度、核苷酸多樣度、平均核苷酸差異數(shù),計(jì)算歧點(diǎn)分布。使用Popart1.7軟件繪制單倍型網(wǎng)絡(luò)圖。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 mtDNA D-loop區(qū)序列分析

    用DNAsp 6.12軟件統(tǒng)計(jì)所測豬種的D-loop區(qū)序列的堿基組成,結(jié)果見表2。由表2可知,T、C、A、G四種堿基的平均比例分別為24.92%、26.42%、32.57%、16.03%。A+T的含量為57.49%,大于G+C的含量42.45%,說明所測豬D-loop區(qū)為A-T富集區(qū)。在本研究中,河南4個(gè)豬種mtDNA D-loop中串聯(lián)重復(fù)單位均為GCGTACACGT,在不同個(gè)體中串聯(lián)重復(fù)次數(shù)的不同是造成D-loop序列長度差異的主要原因。

    2.2 mtDNA遺傳多樣度分析

    用DNAsp 6.0軟件統(tǒng)計(jì)所測豬種的D-loop區(qū)序列的遺傳多樣性參數(shù),結(jié)果見表3。由表3可知,所測得河南3個(gè)豬群體(南陽黑豬、確山黑豬、豫西黑豬)的單倍型多樣度(Hd)均大于0.7,核苷酸多樣度(Pi)均大于0.003,平均核苷酸差異數(shù)(K)均大于2.5,而淮南豬的單倍型多樣度、核苷酸多樣度、平均核苷酸差異數(shù)分別只有0.788、0.001 56、1.818,相對較低,表明淮南豬群體遺傳差異相對貧乏。萊蕪豬與二花臉豬的群體遺傳變異較豐富。對6個(gè)群體的mtDNA D-loop區(qū)序列用Tajima’s D值進(jìn)行中性檢驗(yàn),經(jīng)檢驗(yàn)均不顯著(P>0.05),符合中性突變。

    表2 不同豬種mtDNA D-loop序列堿基組成Table 2 Base composition of mtDNA D-loop sequences in different pig breeds

    2.3 mtDNA D-loop區(qū)序列變異分析

    將本研究測定的豫西黑豬、南陽黑豬、確山黑豬、萊蕪豬、淮南豬、二花臉豬、野豬282條序列,結(jié)合從GenBank下載的3個(gè)國外豬種38條序列共計(jì)320條序列進(jìn)行了比對,共發(fā)現(xiàn)37個(gè)多態(tài)位點(diǎn)。以單倍型H1為標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行了比較分析,界定了42種單倍型,群體間共享單倍型15個(gè)、某個(gè)群體所獨(dú)有單倍型27個(gè)(南陽黑豬5個(gè)、豫西黑豬10個(gè)、確山黑豬4個(gè)、淮南豬2個(gè)、萊蕪豬3個(gè)、二花臉豬1個(gè)、野豬2個(gè)),各單倍型變異位點(diǎn)見表4。

    表3 不同豬種mtDNA D-loop序列多態(tài)性、單倍型及其多樣性Table 3 The polymorphism,haplotypes and genetic diversity of mtDNA D-loop sequence in different pig breeds

    2.4 mtDNA D-loop系統(tǒng)發(fā)育分析

    以非洲疣豬的mtDNA D-loop序列(GenBank登錄號:DQ409321)作為外群構(gòu)建河南4個(gè)地方豬種以及萊蕪豬、二花臉豬和3個(gè)國外豬種的mtDNA D-loop序列單倍型NJ系統(tǒng)發(fā)育樹,結(jié)果見圖1。由圖1可知,用于分析的42個(gè)單倍型在NJ樹上明顯分為2個(gè)獨(dú)立的支系。一支包含了所有地方豬和部分大約克夏豬,另一支則全部是3個(gè)國外豬種的單倍型,表明河南4個(gè)地方豬種間的親緣關(guān)系較近,而與國外豬種間親緣關(guān)系相距較遠(yuǎn),河南4個(gè)地方豬種與3個(gè)國外豬種有著兩個(gè)明顯不同的起源。豫西黑豬、南陽黑豬、確山黑豬、淮南豬、萊蕪豬及二花臉豬的單倍型在整個(gè)系統(tǒng)進(jìn)化樹中分布較為緊密,且具有多個(gè)共享單倍型,表明這幾個(gè)群體彼此之間可能有基因交流。國外豬種大約克夏豬有一個(gè)單倍型與地方豬聚在一起,表明大約克夏豬的母源血統(tǒng)部分來自于中國地方豬種。再結(jié)合已登錄GenBank的中國其他地方豬16條序列,重新繪制單倍型NJ系統(tǒng)發(fā)育樹,結(jié)果見圖2。由圖2可知,其拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)與圖1類似,進(jìn)化樹主干明顯分為2個(gè)支系。

    2.5 單倍型網(wǎng)絡(luò)分析

    根據(jù)DNAsp6.12軟件統(tǒng)計(jì)分析并輸出的單倍型結(jié)果,利用Popart1.7軟件構(gòu)建了河南和鄰省6種地方豬mtDNA D-loop單倍型網(wǎng)絡(luò)圖,發(fā)現(xiàn)網(wǎng)絡(luò)分析結(jié)果也明顯分為2支(圖3)。每個(gè)圓代表1種單倍型,圓的面積大小表明其頻率的高低,圓中不同的顏色代表不同類型豬種。由圖3可知,單倍型H12、H13、H18中的豬品種數(shù)較多,呈發(fā)散狀,表明群體可能發(fā)生過群體擴(kuò)張。單倍型H9、H12、H13、H17、H18、H20、H21、H23、H28為不同品種間共享單倍型。

    2.6 種群歷史動態(tài)分析

    使用DNAsp6.12的Population size down模型對河南4個(gè)地方品種單倍型進(jìn)行歧點(diǎn)分布分析,結(jié)果如圖4。由圖4可知,歧點(diǎn)分布實(shí)際值呈多峰分布,與假定期望模型不符,且中性檢驗(yàn)值Tajima’s D為-1.877 21,F(xiàn)u’s Fs為-26.018,經(jīng)檢驗(yàn)差異顯著(P<0.05),表明河南地方豬群體曾經(jīng)歷過群體擴(kuò)張事件。結(jié)合表3可知,各群體內(nèi)Tajima’s D檢驗(yàn)不顯著,河南地方豬累加的突變使中性檢驗(yàn)結(jié)果顯著。

    3 討論與結(jié)論

    3.1 mtDNA D-loop遺傳多樣性分析

    衡量一個(gè)品種(群體)mt DNA變異程度的兩個(gè)重要指標(biāo)是單倍型多樣度(Hd)和核苷酸多樣度(Pi),單倍型多樣度是指樣本中隨機(jī)抽取到2個(gè)不同單倍型的頻率、核苷酸多樣度是指給定群體內(nèi)隨機(jī)選取的mtDNA 序列間的平均每個(gè)位點(diǎn)的核苷酸差異數(shù)目[5]。Hd和Pi值越大,群體的多態(tài)程度越高,其遺傳多樣性越豐富[6]。據(jù)統(tǒng)計(jì)同種動物的個(gè)體之間的平均核苷酸順序奇異值在0.3%~4.0%,有時(shí)甚至可達(dá)10%[7]。

    本研究的河南4個(gè)地方豬群體中單倍型多樣度和核苷酸多樣度分別為0.788~0.854、0.001 56~0.004 55,4個(gè)豬種的Hd值分別高于萊蕪豬(0.589)、陸川豬(0.640)、東鄉(xiāng)花豬(0.768)、藏豬(0.705)、滇南小耳豬(0.759),低于二花臉豬(0.947)、桂中花豬(0.942)、合作豬(0.883),與保山豬(0.828)、五指山豬(0.838)、巴馬香豬(0.875)處于同等水平;但4個(gè)豬種中除淮南豬核苷酸多樣度(Pi)值較低,為0.001 56,其余3個(gè)豬種Pi值分別高于萊蕪豬(0.002 46)、藏豬(0.002 83)、低于東鄉(xiāng)花豬(0.005 9)、陸川豬(0.007 4)、滇南小耳豬(0.005 21)、合作豬(0.005 49)、與二花臉豬(0.003 73)、桂中花豬(0.003 43)、巴馬香豬(0.003 37)、保山豬(0.003 71)、五指山豬(0.003 34)、巴馬香豬(0.003 37)處于同等水平,表明河南地方豬種遺傳多樣性相對豐富[8-12]。

    從河南地方豬種單倍型分布來看,4個(gè)群體的共享單倍型H12、H13、H18頻率分別為45、41、47,說明這3種單倍型應(yīng)該是河南地方豬共同的祖先單倍型。結(jié)合單倍型網(wǎng)絡(luò)圖分析顯示河南地方豬種至少存在3個(gè)不同母系馴化事件[13]。

    3.2 群體系統(tǒng)發(fā)育分析

    張冬杰等[14]對中國43個(gè)地方豬品種和3個(gè)國外豬種基于mtDNA D-loop序列NJ分子進(jìn)化樹顯示,中國地方豬和國外品種處在2個(gè)不同分支上。黃樹文等[15]構(gòu)建了基于遺傳距離的廣東5個(gè)地方豬種和國外4個(gè)豬種NJ進(jìn)化樹,發(fā)現(xiàn)廣東省地方豬與西方豬種遺傳距離較遠(yuǎn)。本研究結(jié)果表明,用于分析的7個(gè)群體在NJ樹上明顯聚為2個(gè)獨(dú)立支系:一支包含了所有河南及鄰省地方豬群體、野豬群體和部分大約克夏豬的單倍型,另一支則全部是3個(gè)國外豬種的單倍型。這與以上研究結(jié)果基本一致,同時(shí)也支持多數(shù)學(xué)者認(rèn)同的現(xiàn)代家豬起源于歐亞兩大母系的二元論觀點(diǎn)[16-18]。然而,LARSON等[19]通過分析全世界范圍內(nèi)686個(gè)家豬和野豬個(gè)體mtDNA D-loop序列后認(rèn)為家豬的起源在歐亞大陸有多個(gè)獨(dú)立的馴化中心。LUETKEMEIER等[20]通過亞歐家豬和野豬mt DNA基因組分析得出中國豬有多個(gè)馴化中心。王志等[21]通過對黃河流域古代豬mtDNA D-loop序列的分析發(fā)現(xiàn),黃河流域曾是中國家豬馴化中心之一。但YU等[22]在利用mtDNA D-loop區(qū)構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹分析中國地方豬起源時(shí),發(fā)現(xiàn)中國家豬可能起源于長江流域和華南地區(qū)的野豬。河南地方豬具體起源何處,需要進(jìn)一步的研究與證實(shí)。

    本研究發(fā)現(xiàn),約克夏豬部分單倍型與河南地方豬聚為一類,這與張冬杰等[14]研究發(fā)現(xiàn)約克夏豬部分單倍型與梅山豬聚為一類,張冰等[23]研究發(fā)現(xiàn)約克夏豬部分單倍型與廣西地方豬聚為一類,NI等[18]研究發(fā)現(xiàn)約克夏豬和中國地方豬聚為一類,而非歐洲豬。許多研究[14,18,23]結(jié)果都表明約克夏豬部分母源血統(tǒng)來自中國地方豬,據(jù)此推測在約克夏豬培育過程中,可能引入了中國豬種的血統(tǒng)。

    綜上所述,河南省地方豬4個(gè)品種共236條序列,定義了32種單倍型,單倍型多樣度和核苷酸多樣度分別為0.788~0.854、0.001 56~0.004 55,表明遺傳多樣性較豐富。河南地方豬與西方豬種遺傳差異較大,與西方商業(yè)豬種明顯聚為2個(gè)獨(dú)立分支,表明mtDNA D-loop序列可作為研究種內(nèi)系統(tǒng)發(fā)育、起源進(jìn)化的分子標(biāo)記。歧點(diǎn)分布顯示,整個(gè)河南地方豬群體曾經(jīng)歷過群體擴(kuò)張事件。

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