兩種脫細胞支架原位植入轉歸動物試驗研究

潘騰飛 陶劍 蔣彩云 趙偉 宋兵魁 齊樹亭

摘要 脫細胞支架通常被用于輔助組織再生修復，然而脫細胞支架植入后與宿主組織間的相互作用和植入轉歸機制目前尚不清楚。為此本研究制備了牛心包脫細胞支架（S1）和牛皮脫細胞支架（S2）兩種材料，通過體外性能測定和體內動物試驗，研究脫細胞支架植入后與宿主組織之間的相互作用和其植入轉歸過程。試驗結果顯示，兩種支架材料植入1個月后均能夠與比格犬自體硬腦膜組織融合生長，但是S2植入3個月被完全降解，而硬腦膜缺損位置未見新生硬腦膜組織生成，說明脫細胞支架與宿主組織之間成功整合并不能保證組織再生修復。脫細胞支架植入后會重啟ECM動態(tài)變化過程，脫細胞支架恢復ECM動態(tài)平衡是其能否發(fā)揮組織再生/修復能力的必要條件。

關 鍵 詞 脫細胞支架;ECM動態(tài)變化;修復;再生;重建

中圖分類號 R332 ? ? 文獻標志碼 A

The in situ evolution process of two acellular scaffolds after surgical implantation

PAN Tengfei1，2， TAO Jian 2， JIANG Caiyun2， ZHAO Wei2， SONG Bingkui1， QI Shuting1

（1. School of Chemical Engineering， Hebei University of Technology， Tianjin 300130， China; 2. Tianjin Ouerke Medical Technology Co.， Ltd， Tianjin， 300000， China）

Abstract Acellular scaffold is usually used to assist tissue repair and regeneration. However， many problems remained. For instance， the interactions between acellular scaffolds and host tissues and the mechanism of tissue repairing and regeneration. Therefore， two kinds of acellular scaffolds were prepared， including sample 1 （S1， decellularized bovine pericardium） and sample 2 （S2， decellularized bovine skin）. The in vitro characteristics and in vivo performance in Beagles model were measured. The results showed that both of the two scaffolds were successfully integrated with beagles autologous dura after one month implantation. S1 remained its original shape after 3 months implantation， However， S2 were completely degraded after 3 months implantation. There were no newly regenerated dura tissues. The result indicated that successful integration could not guarantee tissue regeneration. The ECM dynamics would restart after surgical implantation. The ECM dynamics balance in acellular scaffolds should also be established. The restoration of ECM dynamics in acellular scaffold was necessary for tissue repairing/regeneration.

Key words acellular scaffold; ECM dynamics; repairing; regeneration; remodeling

0 引言

哺乳動物的基質受到嚴重損傷后不能再生[1-3]。為了輔助組織再生修復，臨床上經(jīng)常采用動物源性脫細胞支架材料模擬受損組織的細胞外基質（ECM），輔助組織再生修復[4-5]。動物源性脫細胞支架已經(jīng)在臨床上得到廣泛應用[6]，脫細胞豬角膜基質在臨床的成功應用表明脫細胞支架在組織修復過程中的重要潛力[7]。

軟組織修復過程通常被分解為連續(xù)又相互重疊的4個階段，包括凝血階段、炎癥階段、增生階段和重構階段[8-10]。脫細胞支架作為ECM的模擬物，植入后會被卷入組織修復過程中，經(jīng)歷與機體自身ECM相似的生理過程。ECM一直處于降解-重構動態(tài)變化過程中（ECM動態(tài)變化），作為細胞的主要微環(huán)境，ECM動態(tài)過程參與眾多細胞行為包括細胞增殖、黏附、遷移、分化和死亡過程[11]，理解ECM動態(tài)變化及其規(guī)律是組織工程和再生醫(yī)學的精髓[12]。

作為異種支架材料，脫細胞支架材料免疫原性去除通常被作為研究的重點，而脫細胞支架植入后與周圍組織的相互作用過程尚不清楚且常常被忽略。為了研究脫細胞支架與宿主組織之間相互作用規(guī)律以及影響脫細胞支架能否發(fā)揮組織修復作用的主要因素，我們采用體外及體內動物試驗，檢測脫細胞支架體外性能，觀察脫細胞支架植入轉歸過程，希望能夠找到影響脫細胞支架與宿主組織整合的主要因素，評價ECM動態(tài)變化對脫細胞支架輔助組織再生修復過程的影響。

1 材料和方法

1.1 樣品制備

本研究制備了兩種脫細胞支架，一種為牛心包脫細胞支架（樣品1，S1），另一種為牛皮脫細胞支架（樣品2，S2）。樣品1制備過程大致如下：從屠宰場取材牛心包，帶回實驗室，用鑷子去除牛心包糙面脂肪，用生理鹽水沖洗去除牛心包的組織液和血液。然后進行脫細胞處理，牛心包脫細胞處理過程由天津歐爾克醫(yī)藥科技有限公司進行。牛心包脫細胞處理完成后不進行化學交聯(lián)或化學修飾，然后將脫細胞樣品裁切為6 cm×8 cm矩形，生理鹽水濕態(tài)保存于塑料袋中，最后用25 kGy 鈷60γ射線輻照滅菌。

樣品2（S2）為脫細胞牛皮，其制備過程大致如下：將新鮮牛皮取回實驗室，去除毛發(fā)和脂肪組織，用片皮機將牛皮切割成薄層，然后進行脫細胞處理，牛皮脫細胞處理由天津歐爾克醫(yī)藥科技有限公司進行，制備完成后將牛皮用冷凍干燥機凍干，凍干過程防止塌陷。樣品裝袋后用25 kGy 鈷60γ射線滅菌。

1.2 體外理化性能

1.2.1 DNA殘留

DNA殘留量測定采用PicoGreen 熒光染色法[13-14]。簡單來說測定過程主要包括3個步驟，分別為蛋白酶K消化、DNA提取和DNA測定。將S1及其原始組織（3個重復）用純化水沖洗3次去除氯化鈉殘留，用凍干機將樣品凍干。將各試樣剪碎，稱取大約10 mg樣品，放入DNA free試管，用蛋白酶K消化至樣品溶解。用PreSEQTM雙鏈DNA檢測試劑盒提取樣品和DNA標準品的DNA。提取的樣品用熒光燃料染色，用熒光酶標儀檢測各個樣品的熒光強度。DNA標準品的回收率應超過50%，r2應大于0.95。DNA殘留量通過DNA標準品方程和回收率方程測量得出。

1.2.2 熱皺縮溫度

熱皺縮溫度可用于反映樣品的熱穩(wěn)定性。通常來說，脫細胞支架的熱穩(wěn)定性越高，其膠原蛋白分子內部的交聯(lián)度越高。熱皺縮溫度測定方法采用JM Lee的方法[15]，測定方法如下：將樣品裁切為3 mm×30 mm（3個重復），然后將樣品兩端連接到熱皺縮測定儀上，向燒杯中加入適量水，用燒杯將樣品浸沒，升高燒杯內水體的溫度，溫升速率約2 ℃/min，密切觀察指針偏轉情況，當支架材料熱變性時，樣品發(fā)生皺縮，帶動指針偏轉，記錄此時水體溫度即為該樣品的熱皺縮溫度。

1.2.3 抗膠原酶酶解能力

抗膠原蛋白酶酶解能力采用細菌膠原蛋白酶（Sigma-Aldrich >125 CDU/mg）酶解樣品，通過酶解所需時間反應試樣的抗酶解能力。測定過程如下，無菌操作將樣品裁切為1 cm×1 cm 矩形，將樣品（3個重復）放于0.1 mg/mL 膠原蛋白酶溶液（0.01 mol/L Tris-HCL，pH 7.2， 50 mmol/L CaCl2）中浸泡0～200 h。膠原酶溶液使用前須用0.22 μm濾膜過濾除菌。每2 h檢查樣品外觀，當樣品完全溶解于溶液中時，記錄樣品完全溶解所需時間。

1.2.4 體外細胞毒性

體外細胞毒性采用ISO10993.5—2009附錄C中MTT方法進行測定[16]。體外細胞毒性可用來反映支架材料的可濾瀝物。樣品浸提液制備方法參照ISO10993.12—2012制備[17]，具體來說，按照樣品表面積/萃取液為3 cm2/mL、（ 37±1） ℃浸泡（24±2） h制備檢驗液。采用康寧細胞培養(yǎng)瓶碎片顆粒作為陰性對照。采用含有5%二甲基亞砜的RPMI 1640培養(yǎng)基作為陽性對照。復蘇L929小鼠成纖維細胞，待細胞處于指數(shù)生長期時，用胰蛋白酶酶解，制備得到1×104 個/mL細胞懸液。取細胞懸液加入至96孔板中，于37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，此時細胞沉底，貼附于孔板底表面，吸棄培養(yǎng)基更換為樣品浸提液，繼續(xù)培養(yǎng)72 h，加入20 μL、5 mg/mL的MTT溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h。吸棄培養(yǎng)基，每孔加入150 μL的DMSO，震蕩均勻后于570 nm測定吸光度。細胞增殖率（V，%）按照下式計算：

式中：A570e和A570b為試驗品和空白對照品的吸光度。細胞增殖率越低，表明樣品的細胞毒性越強。根據(jù)標準規(guī)定，細胞增殖率高于90%時，認為樣品無細胞毒性，細胞毒性為1級。

1.3 體內動物試驗研究

兩種脫細胞支架材料與硬腦膜組織在結構上相似[18]，且都是由Ⅰ型膠原蛋白組成[19]，因此本研究通過比格犬硬腦膜修復試驗，研究兩種脫細胞支架對硬腦膜組織缺損的修復過程。

動物原位植入試驗設置1個月、2個月和3個月3個植入期，每個時間點植入4只試驗動物。植入期結束后處死試驗動物，通過大體解剖和病理制片評價試樣與比格犬硬腦膜組織之間的相互作用，評價脫細胞支架的整合、降解、再生以及試樣與周圍組織的病理反應情況。

動物原位植入試驗植入過程如下：采用鹽酸氯胺酮（50 mg/kg）和速眠新Ⅱ（50 mg/kg）肌肉注射全麻試驗動物，麻醉后將比格犬呈俯臥位綁于手術臺上，頭皮備皮后用碘伏充分消毒，鋪無菌巾。沿頭頂正中縱向切開頭皮和頭部肌肉組織，雙極電灼止血，用骨膜分離器分離肌肉組織，暴露顱骨。用電動高速磨鉆于顱骨中線旁約1 cm處分別磨開2個大小約4 cm × 3 cm的骨窗，骨蠟止血。取下骨組織，暴露比格犬自體硬腦膜（圖1a）），用眼科剪制造硬腦膜缺損（圖1b）），雙極電凝徹底止血，避免腦積水等并發(fā)癥發(fā)生。

將樣品裁剪為對應形狀，光面朝內貼附于大腦硬腦膜缺損處（圖1c）），樣品與比格犬硬腦膜缺損邊緣重疊約0.3 cm。手術結束后將動物放回飼養(yǎng)室，肌肉注射慶大霉素（4 000 U/kg）預防手術創(chuàng)口感染。飼養(yǎng)員定期觀察動物術后有無正常進食、飲水及有無中樞神經(jīng)損傷引起的運動障礙等。

飼養(yǎng)期到期后，對試驗動物執(zhí)行安樂死。解剖觀察手術創(chuàng)口愈合，試樣降解吸收，并發(fā)癥以及黏連情況等。將解剖取下的硬腦膜替代物及周圍組織用福爾馬林固定，病理制片，通過組織病理制片評價脫細胞支架與比格犬自體硬腦膜整合情況，觀察比格犬自體硬腦膜是否有降解或再生，評價脫細胞支架與其周圍組織的植入病理狀況。

2 結果

2.1 DNA殘留量

由于核酸（DNA）具有黏性，最難從組織中去除[20]，因此采用DNA殘留量來定量反映動物組織的脫細胞處理效率。

動物組織及其脫細胞后DNA殘留量結果如圖2所示。牛心包組織（脫細胞處理前）的DNA殘留量為（845.0±144.6） ng/mg干重，牛心包脫細胞支架（S1）的DNA殘留量為（4.31±0.13） ng/mg。牛皮組織（脫細胞處理前）的DNA殘留量為（687.8±82.0） ng/mg干重，其脫細胞支架（S2）的DNA殘留量為（44.04±1.07） ng/mg。據(jù)報道DNA殘留量小于50 ng/mg時，機體對脫細胞支架不會產(chǎn)生明顯細胞或組織排異反應[21]。兩種脫細胞支架的DNA殘留量均在可接受范圍內，所以兩種脫細胞支架的抗原成分均已經(jīng)得到有效去除，理論上來說，植入后不會產(chǎn)生明顯免疫排斥反應。

2.2 熱皺縮溫度和抗酶解性能

膠原蛋白的特征性三螺旋結構對于其生物活性具有重要影響，S1（牛心包）和S2（牛皮）的熱皺縮溫度分別為（60±1.2） ℃和（61±0.9） ℃，兩種材料的熱皺縮溫度均較高，說明2種脫細胞支架的膠原蛋白均沒有發(fā)生變性，兩種脫細胞支架材料均保留著基于膠原蛋白三螺旋結構的生物活性。

本試驗采用細菌膠原蛋白酶浸泡兩種脫細胞支架，通過測量試樣從浸泡開始至其完全被酶解的時間，定量表征試樣的抗酶解能力。本試驗結果顯示，S1樣品的抗酶解時間為56 h，S2的抗酶解時間是24 h，2種樣品的細菌膠原蛋白酶酶解試驗顯示，在體外降解試驗中，S2比S1更易于被酶解，根據(jù)體外酶解試驗，推測S2原位植入后比S1更加易于被酶解。

熱皺縮溫度結果表明兩種脫細胞支架具有相似的熱穩(wěn)定性，然而它們的抗酶解能力差異較大，樣品2更易于被酶解。

2.3 體外細胞毒性

體外細胞毒性結果顯示S1（牛心包）和S2（牛皮）的細胞增殖率分別為（93.4±2.5）% 和 （90.2±3.1）%（3個重復）。陰性對照和陽性對照的細胞增殖率分別為（95.1±4.1）% 和 （10.9±1.6）%（圖3）。陽性對照和陰性對照結果顯示細胞毒性測試試驗結果成立，兩種脫細胞支架的細胞增殖率都高于90%，細胞毒性分級均為1級，說明兩種脫細胞支架基本無有毒有害可瀝濾物析出，脫細胞支架在組織生化處理過程中無有毒有害化學物質殘留。

2.4 掃描電鏡結果

兩種樣品的掃描電鏡結果如圖4所示，從圖4a）與圖4b）、圖4c）與圖4d）的對比可明顯看出，S1（牛心包）的孔徑較S2（牛皮）致密，S1的平均孔徑大小約為2 μm，低于大多數(shù)哺乳動物細胞直徑，此外S1的兩面在孔徑和外觀方面有較大差異，光滑面相比粗糙面膠原纖維結構更加規(guī)則和致密。與S1試驗結果相反，S2的孔徑大約有15 μm，略高于細胞平均直徑，因此大部分細胞可自由遷移進入S2脫細胞支架內部。

2.5 體內動物實驗結果

試驗動物均存活至指定時間節(jié)點，所有動物無術中和術后死亡。動物手術后2 ～ 5 d后恢復常規(guī)飲食，未見有炎癥、出血、腦脊液滲漏、水腫、癲癇等不良反應。

2.5.1 大體解剖

植入1個月大體解剖結果顯示，S1（牛心包）和S2（牛皮）均與宿主硬腦膜組織整合生長（圖5 a）， b））。兩種樣品與比格犬自體硬腦膜整合位置連續(xù)、緊密，無滲漏。植入物周圍無組織炎癥或壞死，兩種支架與腦組織間有輕微黏連，可用鑷子輕易分離。

植入2個月，兩種脫細胞支架的大體解剖結果與植入1個月結果相似，兩種樣品均與比格犬硬腦膜整合生長，S1（牛心包）植入2個月外觀呈乳白色，未見降解，此外S1內部無明顯血管化（圖5 c））。從整合效果上來看，S1與比格犬自體硬腦膜融合生長位置光滑，連接緊密，鑷子難以撕裂，說明S1與比格犬自體硬腦膜融合生長部位已經(jīng)被較好重構，相反S2雖然也顯示與比格犬自體硬腦膜融合生長，但是其機械性能大幅度降低，在解剖過程中，即使非常謹慎，仍然造成樣品撕裂（圖5 d））。

植入3個月，S1（牛心包）大體外觀無明顯改變，樣品無明顯降解，樣品與比格犬自體硬腦膜融合生長位置連接緊密強度高，難以用鑷子撕裂（圖5 e））。相比S1完整的外形結構和較高的機械強度，S2（牛皮）植入3個月已經(jīng)完全不可見，材料已經(jīng)被完全降解。S2降解后留下一個空洞，植入位置未見新生硬腦膜組織，可見植入時取下又放回的顱骨瓣（圖5 f）），顱骨瓣與硬腦膜組織之間形成纖維瘢痕組織，難以與比格犬自體硬腦膜分離。

2.5.2 組織病理結果

與大體解剖結果相對應，植入1個月病理結果顯示，兩種樣品均與比格犬自體硬腦膜融合生長，兩種樣品均保持原結構，周圍均無纖維包裹，無明顯降解，試樣與周圍組織無明顯炎癥反應和免疫反應（圖6 a），b））。S1（牛心包）較比格犬自體硬腦膜厚度更厚，S1表層可見細胞浸潤，內部無細胞浸潤，也無血管化。S2全層可見細胞浸潤（圖6b）），整合區(qū)域可見類似肉芽組織結構。

植入2個月病理結果顯示，S1與周圍硬腦膜組織及大腦組織間無炎癥反應，成纖維細胞浸潤S1樣品厚度的一半，基本無毛細血管（圖6c））。植入2個月，S2全層可見宿主細胞浸潤，樣品組織病理顯示原始結構被改變，顯示材料被部分降解（圖6d））。S2（牛皮）植入2個月結果可見局部鈣化，樣品1中未見。

植入3個月，S2的H&E病理染色圖（圖6f））結果中未見其特征性的纖維結構，病理結果與大體解剖結果一致，說明補片已經(jīng)被降解。S1的全層已經(jīng)被成纖維細胞浸潤，補片保持原來形狀，S1未見明顯降解（圖6e）），結合大體解剖結果，補片整合生長部位已經(jīng)被重構為光滑的結締組織，組織周圍也無炎癥反應，說明S1已經(jīng)進入穩(wěn)定狀態(tài)。

3 討論

3.1 體外性能與體內植入性能之間的聯(lián)系

脫細胞支架的體外性能對其體內生物學相容性、組織再生修復活性有重要影響，通過本試驗中S1和S2的體外性能能夠推測的重要的體內性能如表1所示。

膠原蛋白的生理活性是基于其特征性三螺旋結構實現(xiàn)的，熱皺縮溫度能夠反映膠原蛋白是否已經(jīng)發(fā)生變性。本試驗中，兩種支架材料的熱皺縮溫度高于膠原蛋白分子的變性溫度，說明兩種脫細胞支架均保留了膠原蛋白三螺旋結構，兩種材料保留了膠原蛋白的生物活性。

抗酶解性能與脫細胞支架材料的交聯(lián)度有密切的關系。在生物體內，原膠原分子之間的交聯(lián)通過賴氨酸氧化酶實現(xiàn)共價交聯(lián)[22]。在體外，可以利用化學交聯(lián)劑如戊二醛、碳化二亞胺（EDC）等實現(xiàn)膠原蛋白分子內交聯(lián)，脫細胞支架的穩(wěn)定性是由其膠原蛋白分子內部交聯(lián)度決定的[23]。一般來講，交聯(lián)度越高其熱穩(wěn)定性越高，抗酶解性能也越強，另外膠原蛋白交聯(lián)度隨年齡增長而增高。細胞外支架的交聯(lián)度越高其抗酶解性能越強，脫細胞支架的降解速度越慢。

孔徑是另一重要的體外性能指標，當脫細胞支架的孔徑大于細胞平均直徑時，細胞能夠自由遷移進入脫細胞支架內部。然而脫細胞支架不具有區(qū)分進入其內部細胞類型的能力。脫細胞支架植入后，周圍宿主組織進入組織修復過程，組織修復過程包括出血、炎癥、增生和重構4個階段，每個階段參與的細胞種類、數(shù)量和其生理功能各不相同，例如出血階段以血小板和紅細胞為主，炎癥階段以中性粒細胞、巨噬細胞和淋巴細胞為主，增生階段和重構階段以成纖維細胞為主[24]。在組織修復過程中，炎癥階段的中性粒白細胞、巨噬細胞、淋巴細胞具有分泌基質金屬蛋白酶的能力，能夠酶解脫細胞支架，對其輔助組織再生修復具有較大影響，如果脫細胞支架孔徑遠大于宿主組織中炎癥細胞的直徑，炎癥細胞可自由進入脫細胞支架內部，容易導致脫細胞支架被過早酶解，造成其組織再生修復過程的失敗。

根據(jù)目前的研究進展，脫細胞支架的一些體外性能對其體內生物學活性有決定性影響，例如脫細胞支架中，保持膠原蛋白的特征性三螺旋結構是促凝血性能的重要保證;保留膠原蛋白的自由氨基是保證其與宿主組織整合的必要條件[25];脫細胞支架中殘留外源DNA含量的高低通常代表了組織脫細胞效率和材料的免疫原性，過量DNA殘留會使材料植入后影響宿主周圍組織的修復過程，延長炎癥反應階段的時間;體外細胞毒性通常代表材料毒性化學物質的殘留，這會影響脫細胞支架的生物學相容性，因此脫細胞支架的體外性能對體內生物活性、生物學性能、組織再生修復活性等有重要影響。因此在制備脫細胞支架時，應首先對制備的脫細胞支架的這些重要的體外性能進行表征，脫細胞支架的體外性能測試是其體內原位輔助組織再生修復功能的重要前提。

綜上所述，根據(jù)體外性能測試結果，兩種脫細胞支架材料的膠原蛋白均未變性;DNA殘留量結果顯示兩種材料抗原成分有效去除;體外細胞毒性通過測定浸提液的方法進行，測定結果表明兩種脫細胞支架材料中無有毒有害化學可濾瀝物釋放。體外測試結果表明兩種材料能夠滿足體內原位植入基本要求。

3.2 脫細胞支架整合與輔助組織再生的關系

根據(jù)組織修復過程的特點，軟組織修復過程分為4個連續(xù)而又重疊的階段。脫細胞支架通過外科方式植入后，勢必引起宿主組織損傷，并開啟組織修復過程。脫細胞支架將會被迫融入宿主組織修復過程中。

脫細胞支架取材于動物源性組織，其生理活性與供體動物組織的生理狀態(tài)相一致。通常脫細胞支架取材于動物源性正常成熟組織。脫細胞支架植入后會融入宿主組織ECM動態(tài)變化過程中，被宿主組織的生理狀態(tài)影響和改變。在凝血階段，由于手術植入損傷，組織觸發(fā)凝血過程。凝血過程形成的血栓一方面有利于止血，防止血液過量流失，另一方面凝血作用形成的血栓能夠通過物理吸附和共價交聯(lián)的方式連接脫細胞支架與宿主組織，脫細胞支架與宿主之間建立的穩(wěn)定連接有助于后續(xù)多種生理活動例如血管形成和整合。

本試驗中，植入1個月的大體解剖和病理染色結果顯示，兩種樣品均能夠與宿主組織整合生長。脫細胞支架與比格犬自體硬腦膜的整合說明脫細胞支架已經(jīng)融入比格犬自體硬腦膜ECM動態(tài)變化過程中，脫細胞支架與比格犬自體硬腦膜之間已經(jīng)通過賴氨酸氧化酶催化形成共價交聯(lián)。ECM動態(tài)變化過程包括ECM成分的合成和降解兩部分，ECM支架合成需要成纖維細胞遷移進入脫細胞支架內部，啟動膠原蛋白合成和分泌。

脫細胞支架孔徑的大小對于其原位重構有重要影響。在炎癥反應階段，當脫細胞支架的孔徑大于細胞平均直徑時，炎癥細胞例如中性粒細胞、巨噬細胞等能夠自由進入脫細胞支架內部，分泌膠原蛋白酶，加速脫細胞支架的降解過程。ECM的體內降解是在基質金屬蛋白酶（Matrix Metalloproteinase， MMP）介導下進行的。在炎癥反應階段，組織內部變化劇烈，凝血階段形成的血栓會逐步轉化為肉芽組織，相應地其ECM支架將由血栓的纖維蛋白轉化為以I型和III型膠原蛋白為主的肉芽組織。ECM的劇烈變化需要高濃度的MMP[26，27]。剛植入的脫細胞支架需要承受炎癥反應過程中過量基質金屬蛋白酶的影響，脫細胞支架中殘留抗原成分、支架膠原損傷、支架內膠原蛋白組成差異以及手術損傷等均會促使宿主組織細胞啟動MMP的合成和分泌。在眾多種類的MMP當中，MMP-1、MMP-8和MMP-13能夠對脫細胞支架起到直接的酶解作用[28-30]。脫細胞支架應具有一定抗酶解性能，例如膠原蛋白海綿皮膚替代物的半降解周期為（2±1）周[31]，否則膠原蛋白海綿不具有輔助皮膚組織再生修復的功能。本試驗中S1孔徑較小，S1全層被細胞浸潤需要3個月時間，S2由于孔徑大于一般細胞直徑，因此其植入1個月即可見全層細胞浸潤?？讖捷^大的脫細胞支架雖然有利于細胞的遷移進入，但是脫細胞支架不具有區(qū)分進入其內部細胞的種類的能力，在炎癥階段，大量炎癥細胞的進入容易導致脫細胞支架被過早酶解，可能導致脫細胞支架被過早酶解失效。

植入1個月時，兩種樣品均能與比格犬硬腦膜組織融合生長，并且脫細胞支架與比格犬自體硬腦膜組織之間無明顯炎癥反應，說明兩種脫細胞支架周圍組織進入組織增生階段。在組織增生階段，組織內部MMP分泌量降低，能夠合成ECM組分的成纖維細胞數(shù)量增多，因此在增生階段，脫細胞支架受到的酶解作用降低，脫細胞支架不易被酶解，然而S2的原位植入試驗結果顯示，即使在樣品植入2個月，比格犬硬腦膜組織已經(jīng)進入了組織增生和重構階段后，S2最終仍然在第3個月被完全降解，說明成功整合并不能保證其組織修復重建性能，脫細胞支架內部還應建立ECM動態(tài)平衡，防止其被過度降解而失效。

3.3 脫細胞支架恢復ECM動態(tài)平衡的意義

脫細胞支架植入后，隨著宿主細胞遷移進入脫細胞支架內部，脫細胞支架重啟ECM動態(tài)過程，此時ECM動態(tài)過程尚不平衡。ECM動態(tài)平衡是由細胞精確調控，包括MMP在基因水平以及MMP和TIMP水平的調控。一般來講，系統(tǒng)都有自身調控能力，例如生態(tài)系統(tǒng)具有其自身的調節(jié)控制能力，但是如果系統(tǒng)內或系統(tǒng)外影響過大時，整個系統(tǒng)將失去平衡，例如水體生態(tài)系統(tǒng)具有污染物自凈功能，但是如果影響超過了系統(tǒng)的自身調節(jié)能力，系統(tǒng)將失去自我調節(jié)能力。ECM動態(tài)平衡系統(tǒng)也遵循相同的規(guī)律，當影響ECM動態(tài)平衡的因素超過其自身修復能力，例如脫細胞支架殘留細胞，導致過度免疫原性，脫細胞支架內部無法形成ECM動態(tài)平衡，最終會造成脫細胞支架的徹底降解。

脫細胞植入后，如果被宿主細胞認為“新ECM成分”，脫細胞支架將會在賴氨酸氧化酶等的介導下，被共價交聯(lián)于其自身ECM上，完成脫細胞支架的整合。脫細胞支架與宿主組織的順利整合能夠保證后續(xù)血管化以及組織重構過程的順利進行，所以整合是后續(xù)重構過程的前提。

脫細胞支架與宿主組織的成功整合，為宿主細胞遷移進入脫細胞支架內部，從而重啟脫細胞支架的ECM動態(tài)平衡提供條件。然而脫細胞支架的ECM動態(tài)變化過程會受到炎癥反應階段的強烈干擾，炎癥細胞會分泌基質金屬蛋白酶，對脫細胞支架起到強烈的酶解作用，容易導致脫細胞支架輔助組織再生修復功能的失效。

脫細胞支架經(jīng)過了宿主組織的炎癥反應階段，到達組織增生和重構階段后，也不能保證脫細胞支架ECM動態(tài)恢復平衡，例如本試驗中，S2（牛皮）雖然能夠與宿主整合并通過炎癥反應階段，但是其在植入3個月后仍然被完全降解，而比格犬硬腦膜缺損位置也沒有新生硬腦膜組織，說明S2中始終未能建立起ECM動態(tài)平衡，最終導致脫細胞支架輔助組織再生修復過程的失敗。S1能夠與比格犬自體硬腦膜組織成功整合，且其整合位置光滑，脫細胞支架與比格犬自體硬腦膜之間機械強度較高，整合位置可見成纖維細胞浸潤，無炎癥細胞，說明補片被部分重構，并進入了穩(wěn)定狀態(tài)。

即使脫細胞支架能夠與周圍組織建立起ECM動態(tài)平衡也不能保證組織再生修復，例如在正常皮膚組織的損傷修復過程中，如果皮膚損傷較嚴重，創(chuàng)傷肉芽組織雖然保證ECM動態(tài)平衡，但是其結局通常為疤痕組織形成，無法形成功能性組織。脫細胞支架與宿主組織整合生長之后，脫細胞支架的結局可能為：部分重構、組織再生或疤痕組織形成（圖7）。脫細胞支架植入后，應該首先保證脫細胞支架能夠形成ECM動態(tài)平衡，這是保證其能否發(fā)揮組織再生修復功能的必要條件。

4 結論

脫細胞支架植入后隨著宿主細胞遷移進入其內部，逐漸恢復自身ECM動態(tài)變化過程。脫細胞支架的ECM動態(tài)平衡恢復過程中，炎癥反應階段的炎癥細胞和高MMP表達水平容易導致脫細胞支架的酶解失效。

本試驗結果顯示，脫細胞支架（S2）雖然能夠與比格犬自體硬腦膜組織整合生長，但是其最終仍然被機體降解，因此脫細胞支架與宿主組織成功整合生長不能保證脫細胞支架具有輔助組織再生修復的能力。脫細胞支架輔助組織再生修復功能發(fā)揮還需要在其內部建立ECM動態(tài)平衡，脫細胞支架內部能否恢復ECM動態(tài)平衡是其能否發(fā)揮組織再生/修復能力的必要條件。

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