CypB在4NQO誘導(dǎo)SD大鼠頰黏膜癌變過(guò)程中的表達(dá)研究

陳雨荷 陳瀟 聶敏海 余麗 劉旭倩

親環(huán)素族(cyclophilins, Cyps)存在于原核生物至人類各種生物體中，表現(xiàn)肽酰-脯氨酸順/反異構(gòu)酶(peptidyl-prolylisomerases, PPIase)生物學(xué)活性，充當(dāng)分子伴侶。CypB(peptidyl-prolylcis-transisomerase B)是親環(huán)素家族中發(fā)現(xiàn)的第二個(gè)親環(huán)素蛋白，因 CypB具有PPIase活性，積極參與體內(nèi)氧化應(yīng)激反應(yīng)并且對(duì)炎癥具有趨化作用，我們考慮CypB在口腔鱗狀細(xì)胞癌(oral squamous cell carcinoma, OSCC)中發(fā)揮重要的作用。本文通過(guò)實(shí)驗(yàn)檢測(cè) CypB在口腔黏膜正常組織、惡變各期組織的表達(dá)情況，研究 CypB的表達(dá)與 OSCC發(fā)展過(guò)程的相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)對(duì)象

隨機(jī)選取本課題組前期以4NQO誘導(dǎo)SD大鼠癌變建模后凍存的頰黏膜組織49 例，各切取約0.2 cm×0.2 cm×0.2 cm固定、石蠟包埋后切片進(jìn)行HE染色，由兩位有經(jīng)驗(yàn)的病理科醫(yī)生確定病理分級(jí)后分組，共收集到 SD大鼠正常頰鱗癌組(對(duì)照組)7 例，輕度上皮異常增生組(輕度組)6 例，中度上皮異常增生組(中度組)11 例，重度上皮異常增生組(重度組)9 例，頰鱗狀細(xì)胞癌組(鱗癌組)16 例。

1.2 實(shí)驗(yàn)材料

兔抗鼠CypB單克隆抗體(武漢三鷹生物公司)； 兔抗鼠GAPDH單克隆抗體(北京Abway抗體技術(shù)公司)；免疫組化染色試劑盒和DAB試劑盒(北京中杉金橋生物公司)；總RNA提取試劑盒(北京TIANGEN公司)；qPCR反轉(zhuǎn)錄試劑盒和SYBR?Green real time PCR master mix(TOYOBO，日本)；BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒(北京Solarbio公司);ECL化學(xué)發(fā)光底物試劑盒(ABI，美國(guó))；大鼠CypB引物(上海生工生物工程有限公司)；大鼠GAPDH引物(Invitrogen，美國(guó))。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 HE染色 脫蠟至水，分別置入蘇木素、鹽酸酒精、氨水、伊紅中染色，梯度酒精浸泡，最后置于二甲苯中，中性樹(shù)膠封片，由兩位有經(jīng)驗(yàn)病理科醫(yī)師讀片，根據(jù)2005 年WHO標(biāo)準(zhǔn)確定組織的病理分級(jí)。

1.3.2 IHC染色 脫蠟至水， 95 ℃ 0.1 mol/L檸檬酸緩沖液中抗原修復(fù)，按照免疫組化染色試劑盒、DAB試劑盒操作步驟染色，中性樹(shù)膠封片。

1.3.3 RT-qPCR 引物序列見(jiàn)表1。根據(jù)總RNA提取試劑盒提取各組組織中總RNA，測(cè)定各組RNA溶液濃度。65 ℃條件下變性5 min，根據(jù)RT-qPCR反轉(zhuǎn)錄試劑盒逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，使用SYBR?Green real time PCR master mix試劑盒配制反應(yīng)液，實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀上機(jī)擴(kuò)增，擴(kuò)增條件：Hold Stage： 50 ℃， 2 min； 95 ℃， 10 min； PCR Stage(40 cycles)： 95 ℃， 20 s； 57 ℃， 20 s； 72 ℃， 31 s； Melt Curve Stage： 95 ℃， 15 s； 60 ℃， 1 min； 95 ℃， 30 s； 60 ℃， 15 s。根據(jù)公式計(jì)算2-△△CT，可視為4 組病變組織相較于對(duì)照組織中CypB mRNA表達(dá)量的對(duì)變化倍數(shù)。

1.3.4 Western blot 各組稱取100 mg剪碎于液氮研磨，加入1 ml組織裂解工作液，獲得各組CypB蛋白溶液。根據(jù)BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒測(cè)定各組蛋白濃度。制備分離膠及濃縮膠，上樣后電泳轉(zhuǎn)膜，脫脂奶粉封閉液封閉1 h后，滴加CypB一抗液(1∶1 000)，TBST處理后滴加二抗液(1∶2 000)，避光，按照ECL化學(xué)發(fā)光底物試劑盒，滴加工作液上機(jī)顯影。

表 1 CypB、GAPDH引物序列

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件，檢驗(yàn)5 組數(shù)據(jù)是否符合正態(tài)分布、方差齊性。行 one-way ANOVA，各組間比較行SNK-q檢驗(yàn)。P<0.05為有差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 組織中CypB免疫組化結(jié)果

CypB主要在細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)， 陽(yáng)性表達(dá)染色呈棕黃。在正常頰黏膜組中輕微著色，蛋白低、弱表達(dá)。隨病變程度增加，著色明顯，癌巢中呈強(qiáng)陽(yáng)性(圖 1)。

2.2 正常及病變組織中CypB mRNA的表達(dá)

各組間比較，CypB mRNA相對(duì)表達(dá)量差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與正常頰黏膜組比較，輕度異常增生組 CypB mRNA的相對(duì)表達(dá)量上調(diào)1.16 倍，中度異常增生組上調(diào)1.33 倍，重度異常增生組上調(diào)1.53 倍，鱗狀細(xì)胞癌組上調(diào)1.93 倍。其相對(duì)表達(dá)量趨勢(shì)變化與SD大鼠誘癌后病變程度趨勢(shì)基本一致(圖 2)。

2.3 正常及病變組織中CypB蛋白的表達(dá)

CypB在病變組織中蛋白相對(duì)表達(dá)含量均比正常頰黏膜高(P<0.05)。輕度異常增生組CypB的蛋白相對(duì)表達(dá)量與中度異常增生組、重度異常增生組、鱗狀細(xì)胞癌組相比也具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)， 中度上皮異常增生組與重度上皮異常增生組中無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(圖 3～4)。 隨著SD大鼠誘癌后病變程度的進(jìn)展，CypB蛋白相對(duì)表達(dá)量呈逐漸上升的趨勢(shì)，這與 RT-qPCR結(jié)果基本一致。

圖1 SD 大鼠頰黏膜組織免疫組化結(jié)果 (HE, ×100)

Fig 1 Immunohistochemical staining of buccal mucosa of SD rats (HE, ×100)

圖 2 SD 大鼠頰黏膜 CypB mRNA 的相對(duì)表達(dá)量

圖 4 Western blot 檢測(cè) CypB 蛋白的表達(dá)

3 討 論

CypB常定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，CypB存在可切割的N端信號(hào)序列， 能夠引導(dǎo)合成中的蛋白質(zhì)進(jìn)入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，保護(hù)細(xì)胞抵抗內(nèi)質(zhì)網(wǎng)生理應(yīng)激[1]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)CypB在OSCC中高表達(dá)，并主要存在于細(xì)胞質(zhì)中。這一結(jié)論與CypB在多種腫瘤中表達(dá)量增加一致， Choi 等[2]研究發(fā)現(xiàn)在結(jié)腸癌組織中 CypB mRNA和蛋白水平上也都呈過(guò)表達(dá)，且CypB高表達(dá)的患者的預(yù)后明顯較差。 Li 等[3]發(fā)現(xiàn)胃癌中CypB表達(dá)明顯高于非癌組織，這與Meng等[4]的研究結(jié)果一致，且CypB高表達(dá)與腫瘤的侵襲性顯著相關(guān)，在胃癌患者血清CypB濃度也明顯高于健康人。有研究發(fā)現(xiàn)多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中CypB的表達(dá)最高，高于原代人星形膠質(zhì)瘤細(xì)胞， 而非腫瘤腦的CypB表達(dá)最低[5]。也有學(xué)者發(fā)現(xiàn)肝癌患者組織CypB呈中高表達(dá)，正常肝組織中也存在表達(dá)但明顯降低[6]。本實(shí)驗(yàn)又進(jìn)一步行RT- qPCR、Western blot發(fā)現(xiàn)CypB相對(duì)表達(dá)含量的增長(zhǎng)與癌變過(guò)程中組織惡性發(fā)展的趨勢(shì)一致，且在基因?qū)用婕暗鞍讓用婢靡哉撟C。

推測(cè)這一現(xiàn)象的原因，CypB具有PPIase活性，有利于蛋白質(zhì)進(jìn)行折疊、翻譯后修飾[7]。研究發(fā)現(xiàn)惡性腫瘤病理生理學(xué)變化可以改變蛋白折疊介導(dǎo)的信號(hào)傳導(dǎo)途徑，功能失調(diào)的蛋白發(fā)生蛋白折疊和重組途徑的改變又在惡性腫瘤中起著重要的作用[8]。

流行病學(xué)調(diào)查證實(shí)，OSCC經(jīng)常受到持續(xù)的高風(fēng)險(xiǎn)行為的影響，如吸煙、飲酒和咀嚼檳榔[9]，這些行為會(huì)產(chǎn)生慢性氧化應(yīng)激反應(yīng)[10]。健康細(xì)胞能夠平衡活性氧(reactive oxygen species, ROS)的形成和消除，保持ROS-穩(wěn)態(tài)[11]。當(dāng)穩(wěn)態(tài)受到干擾，就會(huì)發(fā)生氧化應(yīng)激，引起細(xì)胞損傷，是多種疾病細(xì)胞損傷的機(jī)制[12]。研究表明氧化應(yīng)激與多種癌癥的生長(zhǎng)和侵襲性有關(guān)，適應(yīng)氧化應(yīng)激是腫瘤病理生理學(xué)的主要驅(qū)動(dòng)力之一[13-14]。已明確氧化應(yīng)激反應(yīng)和CypB功能息息相關(guān)。CypB細(xì)胞表面有天然配體細(xì)胞外基質(zhì)金屬蛋白酶誘導(dǎo)因子(extracellular matrix metalloproteinase inducer，CD147)，多種Cyps可與CD 147結(jié)合，啟動(dòng)許多細(xì)胞內(nèi)信號(hào)事件。有研究表明 CD147與 Cyps結(jié)合可促進(jìn)腫瘤的發(fā)展，其介導(dǎo)方式與 ERK1/2通路有關(guān)[15]。過(guò)表達(dá)的 CypB與CD147結(jié)合可以保護(hù)肝癌細(xì)胞免受氧化應(yīng)激，CypB表達(dá)下調(diào)使肝癌細(xì)胞更容易受到 ROS介導(dǎo)的凋亡，這種保護(hù)作用也依賴于CypB的PPIase活性[6]。但是近年也有學(xué)者提出異議，因?yàn)?Cyps中含量第一的CypA，其突變體 CypA/R55A在 PPIase活性上存在缺陷，卻仍能發(fā)揮抗氧化的作用，認(rèn)為 CypA抗氧化的能力與 PPIase無(wú)關(guān)[16]。所以Cyps與氧化應(yīng)激反應(yīng)聯(lián)系密切，但生物學(xué)機(jī)制尚不清楚。

氧化應(yīng)激產(chǎn)生的 ROS還能夠損害招募炎癥細(xì)胞，誘導(dǎo)細(xì)胞增殖或凋亡和致癌基因的表達(dá)。在OSCC的發(fā)生發(fā)展中，大量ROS可攻擊唾液蛋白，改變口腔黏膜結(jié)構(gòu)，引起細(xì)胞周期畸變和細(xì)胞不規(guī)則分化，激活炎癥反應(yīng)，OSCC微環(huán)境下炎癥標(biāo)志物明顯增加[17-18]。CypB與炎癥反應(yīng)也具有密不可分的關(guān)系。有研究證明 CypB可認(rèn)為是炎癥的細(xì)胞間介質(zhì)，CypB是有效的白細(xì)胞趨化因子，能夠通過(guò)聚集白細(xì)胞來(lái)啟動(dòng)、加重炎癥反應(yīng)，通過(guò)與 CD147結(jié)合途徑刺激基質(zhì)金屬蛋白酶( MMP)產(chǎn)生，其相互作用能調(diào)節(jié)如急性肺部炎癥、膿毒癥、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、心血管疾病等炎性疾病[19-22]。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)從基因轉(zhuǎn)錄水平及蛋白水平研究表明在OSCC中CypB表達(dá)量明顯增高，這一結(jié)果與 CypB在多種癌癥中表達(dá)上調(diào)一致。隨著頰黏膜組織惡變程度加重，CypB相對(duì)表達(dá)含量呈逐漸升高。說(shuō)明CypB水平變化與OSCC癌變發(fā)展過(guò)程密切相關(guān)。推測(cè)是由于 CypB的PPIase活性以及在氧化應(yīng)激、炎性反應(yīng)中的重要作用，本課題組考慮后續(xù)從該角度繼續(xù)深入研究CypB在OSCC發(fā)生、發(fā)展中的機(jī)制及作用。