鎂表面載地塞米松DNA凝膠促成骨細胞分化研究

閆寧 宋文 李哲 張玉梅

金屬鎂由于其良好的生物相容性和生物可降解性，可以彌補常規(guī)不可吸收引導骨再生(GBR)屏障膜需二次手術取出的不足，以及可吸收膜機械性能差的缺點[1-2]。然而鎂表面成骨誘導能力不足，用鎂膜作為GBR膜難以發(fā)揮足夠的引導作用[3]。大量研究在鎂表面加載生物活性涂層或者活性藥物、因子提高誘導成骨作用，增強GBR膜材料成骨效能[4]。地塞米松(DEX)是一種常用作體外誘導骨髓間充質(zhì)干細胞成骨分化的抗炎糖皮質(zhì)激素，具有誘導細胞堿性磷酸酶(ALP)表達的能力[5]，近年來熱門的DNA水凝膠在生物相容性優(yōu)異，有著良好的藥物負載能力，可以作為藥物的輸送載體[6]。本研究在鎂表面加載含有DEX的DNA水凝膠涂層，提升鎂表面成骨誘導能力。

1 材料與方法

1.1主要材料、試劑與儀器

方形純鎂片(邊長1 cm，廣州鎂業(yè));碳化硅砂紙400～3 000 目(勇士,德國); 丙酮、無水乙醇、氫氧化鈉(北京國藥)；鮭魚精DNA、地塞米松、4%多聚甲醛(北京索萊寶)；納米硅酸鹽(nSi，Laponite XLG，Nanocor，美國)；成骨細胞前體細胞MC3T3-E1 (ATCC，美國)，ɑ-MEM培養(yǎng)基、胎牛血清(Hyclone，美國)；CCK-8試劑盒(上海七海生物)；BCIP/NBT 堿性磷酸酶顯色試劑盒、ALP定量試劑盒(北京碧云天)；Prime ScriptTMRT Mater Mix、TB GreenTMPremix Ex TaqTM(Takara，日本)。

陽極氧化電源(香港龍威)；全波長酶標儀(BioTek，美國)；渦旋混勻儀主動(廣州科適特)；冷凍干燥機(SIM，美國)；場發(fā)射掃描電鏡(Hitachi，日本)；CFX96實時熒光定量 PCR儀 (Bio-Rad，美國)。

1.2 實驗方法

1.2.1 鎂基底的預處理 對純鎂片依次使用400～3 000 目的砂紙逐級打磨拋光，并依次在丙酮、無水乙醇和去離子水中超聲清洗。在電解液為120 g/L的NaOH溶液中進行恒定電壓40 V，時間為1 h的陽極氧化反應，后進行450 ℃、恒溫6 h的退火處理。

1.2.2 DNA凝膠的制備 將鮭魚精DNA常溫溶解于超純水中，制備成濃度為4%w/v的DNA溶液，37 ℃恒溫保持2 d，使其充分溶解，后將DNA溶液加熱至90 ℃， 1 min后置于37 ℃環(huán)境下冷卻2 h來形成預凝膠。將納米硅酸鹽(nanosilcate,nSi)與DEX分散體混合添加至DNA預凝膠中，混合渦旋5 min，使nSi與DEX終濃度達到0.5%與0.5 mg/ml。各取200 μl混合物均勻滴加在預處理的鎂基底表面， 37 ℃過夜以完全凝膠化。使用掃描電鏡觀測冷凍干燥表面噴金后的DNA預凝膠與添加nSi的DNA終凝膠表面形貌，以及復合材料縱切后的截面形貌。

1.2.3 地塞米松釋放 用 PBS配置含有不同DEX濃度(0.01、 0.05、 0.1、 0.5、 1.0 mg/ml)的標準液，檢測240 nm波長的吸光度，線性擬合出DEX濃度的標準曲線。將涂覆有200 μl的0.5 mg/ml DEX濃度的DNA預凝膠與終凝膠裝入15 cm透析袋中，兩端密封后，浸入50 ml PBS溶液的離心管中， 37 ℃恒溫振蕩，在第1～15 天內(nèi)每天取 1 ml透析液，測量240 nm波長處的吸光度，計算DEX釋放量與總釋放比率，后補充等量 PBS，整個實驗持續(xù)到釋放水平達到穩(wěn)定。

1.2.4 細胞培養(yǎng) 實驗細胞選擇為小鼠成骨細胞系MC3T3-E1細胞，以4×104個/ml的細胞密度接種在12 孔Transwell小室的下室，培養(yǎng)基為10% FBS的α-MEM培養(yǎng)基，隔日換液。各組材料置于上室，在5% CO2孵箱中， 37 ℃條件下恒溫培養(yǎng)。

1.2.5 CCK-8測定細胞毒性 細胞培養(yǎng)后的第3 天用 PBS 漂洗下室細胞，每孔加入550 μl CCK-8檢測混合液，置于37 ℃條件下恒溫孵育3 h后取出，用分光光度計測定450 nm波長處的吸光度，計算平均值。

1.2.6 ALP染色和定量分析 細胞培養(yǎng)24 h后更換為成骨誘導培養(yǎng)液，每2 d換液。在成骨誘導7 d后，PBS漂洗下室細胞3 次后， 4%多聚甲醛固定20 min，使用BCIP/NBT顯色試劑盒進行染色，避光孵育2 h， PBS漂洗3 次后拍照。成骨誘導7 d后，使用50 μl的0.2%Triton X-100對細胞進行低溫裂解充分后，120 00 r/min高速離心15 min，使用ALP活性試劑盒對上清液中酶濃度進行檢測，并測量在520 nm波長處的吸光度數(shù)值，計算平均值。

1.2.7 PCR檢測細胞成骨相關基因 成骨誘導7 d后，使用Trizol裂解提取RNA，按照Prime ScriptTMRT Master Mix和TB GreenTMPremix Ex TaqTM操作說明進行逆轉(zhuǎn)錄，使用CFX96 實時熒光定量 PCR 儀進行RT-qPCR反應，檢測 Runx2和BMP2的mRNA表達水平，GAPDH作為內(nèi)參[7]。

1.3 統(tǒng)計學分析

2 結(jié) 果

2.1 DNA水凝膠的制備與表征

凝膠涂層表面形貌見圖 1A，DNA預凝膠具有高度多孔、孔徑更大的互連結(jié)構； nSi加入后的DNA終凝膠孔徑更小，平均孔徑從216.2 μm顯著降低到了26.8 μm。最終制備的復合材料截面形貌見圖 1B)，鎂基底陽極氧化后產(chǎn)生了分界清晰的MgO氧化層，其通過微裂隙與微孔的機械嵌合作用使最表面多孔的DNA水凝膠涂層結(jié)合更為緊密。

2.2 地塞米松加載和釋放特性

DEX濃度標準曲線見圖 2A，擬合的吸光度線性回歸方程為y=0.4404x+3.458， R2=0.982。DNA預凝膠、終凝膠的體外DEX釋放曲線見圖 2B， 15 d內(nèi)的DNA預凝膠中藥物釋放速率較快，藥物釋放的半衰期大約為2.5 d左右， 最終在12 d左右時藥物釋放完畢。DNA終凝膠由于它更為緊湊的結(jié)構和更小的孔徑，藥物釋放時間延長，半衰期約為5 d左右，而大約需要15 d藥物完全釋放完畢。

2.3 修飾后鎂表面細胞相容性

圖1 DNA預凝膠與終凝膠表面形貌(A)與復合材料截面形貌(B) (×5 000)

Fig 1 Surface morphology of DNA pregel and final gel (A) and cross-sectional morphology of the composite materials(B) (×5 000)

圖2 DEX標準曲線(A)與體外釋放曲線(B) 圖 3 MC3T3-E1的細胞增殖(CCK-8實驗)

Fig 2 DEX standard curve(A)andinvitrorelease curve(B) Fig 3 Proliferation of MC3T3-E1(CCK-8 assay)

圖4 MC3T3-E1 細胞的ALP染色 (ALP, ×100)

Fig 4 ALP staining of MC3T3-E1 cells (ALP staining, ×100)

第3 天CCK-8測量的MC3T3-E1細胞的活性如圖 3顯示，MgO組的細胞活力高于光滑的Mg組(P<0.01)，而DEX@DNA-MgO組的細胞活性較Mg組與MgO組都有了更為顯著的升高(P<0.01)。

2.4 修飾后鎂表面促進細胞成骨分化

7 d后ALP染色結(jié)果見圖 4， Mg組只有散在ALP結(jié)晶， MgO組染色程度較深，但這2 組無明顯差異， 而DEX@DNA-MgO組染色面積最大，且相互交聯(lián)，該組表達了最高的ALP活性(P<0.01)。

圖5顯示， MC3T3-E1細胞在成骨誘導7 d后MgO組與Mg組的Runx2和BMP2表達水平并未見明顯差異(P>0.05)，DEX@DNA-MgO組表達水平都有顯著性的提高(P<0.01)。

3 討 論

近年來，金屬鎂由于具備良好的機械強度、生物相容性及生物可降解性等優(yōu)勢，被學者們逐漸應用于GBR膜材料中。提升鎂表面主動誘導骨形成的能力，在鎂表面構筑生物活性涂層是研究的主流方向。

圖 5 MC3T3-E1 細胞中Runx2、BMP2的mRNA表達水平

Fig 5 The mRNA expression of Runx2 and BMP2 of MC3T3-E1 cells

本研究對純鎂進行陽極氧化后退火處理，表面形成MgO涂層[8]，其微孔裂隙的存在可以進一步與加載的生物涂層機械嵌合[9]。DNA水凝膠是近些年來發(fā)展迅速的藥物轉(zhuǎn)運載體，具有序列可操縱性和優(yōu)良的生物相容性，可用于智能的藥物遞送[10]。大多數(shù)DNA水凝膠的合成方法中，需要引入額外的官能團或其他聚合物[11]，這可能會帶來生物安全問題。Basu等[12]通過簡單的靜電結(jié)合的相互作用使DNA形成物理交聯(lián)網(wǎng)絡，具有獨特的優(yōu)勢。本實驗采用的成膠過程通過加熱冷卻使DNA變性再雜交，游離的堿基對使相鄰 DNA氫鍵互補形成預凝膠；納米硅酸鹽 nSi表面電荷的各向異性可以與磷酸基團靜電結(jié)合成膠，在掃描電鏡下觀察，成膠后孔徑更小，形成更為致密的交聯(lián)網(wǎng)絡，更有利于藥物的封閉保存，因此在DEX藥物的釋放實驗中，加入nSi的 DNA終凝膠表現(xiàn)出了很好的緩釋作用，證明材料可以在骨缺損修復的進程中發(fā)揮持久的促成骨作用。

在體外細胞培養(yǎng)的CCK-8實驗中，MgO組較Mg組對細胞有一定促增殖作用(P<0.01)，但單純形貌改變的作用十分有限，DNA水凝膠的加載使細胞活性進一步明顯增高(P<0.01)，證明了DNA水凝膠作為人體遺傳物質(zhì)，擁有更好的生物相容性。PCR檢測成骨基因Runx2和BMP2表達、ALP染色和定量分析上，MgO組均未表現(xiàn)明顯的促成骨分化能力(P>0.05)，而DNA水凝膠涂層組別都有著顯著提升(P<0.01)。這說明DEX的加載大幅度提高了輔助誘導成骨的潛能，適合作為鎂應用于GBR膜材料的輔助生物活性藥物。

綜上所述，在純鎂陽極氧化預處理的MgO 基底上，通過靜電結(jié)合形成的DNA納米復合水凝膠有著致密緊湊的結(jié)構與良好的DEX緩釋效果，與MC3T3-E1細胞表現(xiàn)出良好的細胞相容性，可促進ALP的合成以及Runx2與BMP2基因的表達，為鎂材料提供了更好的主動誘導成骨能力，為GBR膜材料的應用打下基礎。