TGF-β1在放射性頜骨骨髓炎發(fā)病過程中對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的影響及其分子機(jī)制的體外研究

賈駿麒 趙路 陳媛麗 張哲儒 宗春琳 田磊

放射性頜骨骨髓炎(osteoradionecrosis of jaws, ORNJ)是頜面部惡性腫瘤放射治療的最嚴(yán)重并發(fā)癥之一，發(fā)病率高達(dá)5%～40%[1-2]，并在放療后拔牙的患者中發(fā)病率顯著升高[3]。ORNJ可導(dǎo)致創(chuàng)口不愈、死骨形成、骨面外露、皮膚黏膜瘺道形成等后果；且病變不具有自限性，一旦發(fā)生遷延不愈進(jìn)而造成病理性骨折，影響頜面部功能和容貌，嚴(yán)重者甚至造成死亡[4]。ORNJ的發(fā)病機(jī)制至今尚未完全闡明，近年來較為廣泛接受的放射性纖維萎縮學(xué)說[5]認(rèn)為其是一種放射所導(dǎo)致的以局部組織肌成纖維細(xì)胞(myofibroblasts,MFB)分化、膠原基質(zhì)分泌等為主要特征的放射性纖維化疾病[6]。

在前期研究中我們發(fā)現(xiàn)下頜骨局部骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)，BMSCs是ORNJ中MFB的來源之一，轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)可能在這一過程中起到一定作用[7-8]，TGF-β1表達(dá)的升高與組織纖維化具有重要關(guān)系[9]。還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NADPH)氧化酶NOX家族亞型NOX4在肝纖維化疾病過程中可介導(dǎo)成纖維細(xì)胞向MFB發(fā)生分化[10]。本實(shí)驗(yàn)圍繞放射線對(duì)BMSCs的作用，以TGF-β1為研究靶點(diǎn)，對(duì)TGF-β1在ORNJ發(fā)病過程中的作用及其與NOX4表達(dá)合成之間的關(guān)系進(jìn)行研究，為ORNJ的防治提供理論參考。

1 資料與方法

1.1 細(xì)胞來源、鑒定及分組

原代BMSCs取自2 周齡雄性SD大鼠，麻醉處死后分離股骨，剪斷兩端骨骺后用加壓沖洗骨髓腔，細(xì)胞待傳至P3代后備用。顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài),并用流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞表面標(biāo)志物CD34、CD44、CD45進(jìn)行鑒定。

接種細(xì)胞至6 孔板中，待生長(zhǎng)穩(wěn)定后設(shè)置細(xì)胞分組為：空白對(duì)照組：P3代BMSCs不做任何干預(yù)； 實(shí)驗(yàn)組1：BMSCs+輻照； 實(shí)驗(yàn)組2：BMSCS+TGF-β1中和抗體(sigma,美國(guó))+輻照； 實(shí)驗(yàn)組3：BMSCS+外源性TGF-β1(BioVision，美國(guó))； 實(shí)驗(yàn)組4：BMSCs+siNOX4+輻照；實(shí)驗(yàn)組5：BMSCs+siNOX4+外源性TGF-β1。

1.2 射線來源及參數(shù)設(shè)置

放射線來源于陜核工業(yè)咸陽第二一五醫(yī)院放療科CX5762型放射治療機(jī)(VARIAN，美國(guó))，射線性質(zhì)屬高能X射線，設(shè)置射線能量為6 MeV，劑量率為4 Gy/min，單次照射劑量為4 Gy。

1.3 siNOX4轉(zhuǎn)染及效率鑒定

構(gòu)建對(duì)NOX4的轉(zhuǎn)錄具有沉默作用的小分子RNA(small interfering RNA, siRNA)siNOX4： 5′-GCUUCUACCUAUGCAAUAA-3′(正義鏈)、 3′-CGAAGAUGGAUACGUUAUU -5′(反義鏈)(廣州銳博生物)。對(duì)P3代BMSCs細(xì)胞按試劑盒說明書，進(jìn)行轉(zhuǎn)染24 h后進(jìn)行qPCR檢測(cè)NOX4基因表達(dá)水平，并加入外源性TGF-β1， 7 d后免疫熒光法檢測(cè)NOX4合成水平鑒定轉(zhuǎn)染效率。

1.4 細(xì)胞生長(zhǎng)活性以及ORNJ相關(guān)蛋白表達(dá)測(cè)定

倒置顯微鏡對(duì)各組細(xì)胞形態(tài)進(jìn)行觀察，在第 1、 2、 3、 4、 5、 6、 7 天進(jìn)行CCK8(Thermo Fisher Scientific，美國(guó))染色，酶標(biāo)儀讀取A值并繪制生長(zhǎng)曲線。Western-blot法檢測(cè)各組中TGF-β1以及MFB特異性標(biāo)志蛋白α-SMA 合成情況。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行ANOVA分析，P<0.05時(shí)認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 細(xì)胞形態(tài)觀察

空白對(duì)照組細(xì)胞呈短梭形，形態(tài)較完整。射線和外源性TGF-β1可造成細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則、密度減小，并可觀察到大量破碎的細(xì)胞結(jié)構(gòu)。TGF-β1中和抗體和siNOX可以明顯減輕細(xì)胞形態(tài)的破壞(圖 1)。

2.2 細(xì)胞生長(zhǎng)能力

繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線(圖 2)觀察細(xì)胞生長(zhǎng)能力變化?？梢娍瞻讓?duì)照組細(xì)胞在接種初期短暫適應(yīng)后于第3 天開始明顯增殖，于第5 天左右生長(zhǎng)明顯放緩，達(dá)到平衡狀態(tài)。射線和外源性TGF-β1在干預(yù)后第3 天開始造成細(xì)胞生長(zhǎng)的明顯抑制，在第7 天細(xì)胞生長(zhǎng)幾乎停滯。TGF-β1中和抗體、siNOX4的應(yīng)用可以在一定程度上保護(hù)細(xì)胞的增殖能力。

2.3 TGF-β1合成水平的檢測(cè)

射線可引起細(xì)胞TGF-β1合成的升高，并無法通過抑制NOX4表達(dá)降低TGF-β1的合成。中和抗體對(duì)TGF-β1具有較好的中和效果(圖 3)。

2.4 NOX4合成的檢測(cè)

射線和外源性TGF-β1可造成細(xì)胞NOX4合成的明顯升高，應(yīng)用TGF-β1中和抗體可部分降低NOX4的合成水平(圖 4)。

2.5 α-SMA合成的檢測(cè)

射線和外源性TGF-β1均可以造成α-SMA合成量的增加，TGFβ1中和抗體和siNOX4的應(yīng)用可以顯著降低α-SMA的合成，但后者的抑制合成作用低于前者(圖 5)。

3 討 論

對(duì)BMSCs施加4Gy劑量的X線照射后出現(xiàn)了MFB特異性蛋白α-SMA合成分泌的增多，以及細(xì)胞增殖能力下降等現(xiàn)象，與ORNJ的疾病行為及病理表現(xiàn)相契合，驗(yàn)證了本實(shí)驗(yàn)所用細(xì)胞輻照模型較強(qiáng)的科學(xué)性與適用性。TGF-β1是一種廣泛存在于多種病理生理過程中的細(xì)胞因子，免疫細(xì)胞化學(xué)研究表明TGF-β1是放射性纖維化中最主要的細(xì)胞因子[11]。NOX家族則是通過過表達(dá)產(chǎn)生大量活性氧從而引起氧化壓力增加，與機(jī)體多種疾病的發(fā)生緊密相關(guān)，誘導(dǎo)了多種疾病的發(fā)生、發(fā)展，其中NOX4 被廣泛認(rèn)為是多種纖維化疾病發(fā)生過程中的重要環(huán)節(jié)[12-13]。本實(shí)驗(yàn)通過對(duì)體外培養(yǎng)的 BMSCs 施加適合劑量的放射線，觀察到TGF-β1和NOX4的合成水平較對(duì)照組顯著升高，進(jìn)一步證實(shí)了TGF-β1是BMSCs 對(duì)放射線電離輻射作用的產(chǎn)物；同時(shí)，NOX4表達(dá)的升高也提示了氧化應(yīng)激損傷可能是導(dǎo)致ORNJ纖維化發(fā)生的重要因素。

圖1 射線、 TGF-β1、TGF-β1中和抗體、 siNOX4對(duì)細(xì)胞形態(tài)的影響 (倒置顯微鏡，×40)

Fig 1 The effects of radiation, TGF-β1, TGF-β1neutralizing antibody and siNOX4 on cell morphology (Inverted microscopy, ×40)

圖2 射線、TGF-β1、TGF-β1中和抗 圖 3 射線、中和抗體及siNOX4對(duì)TGF-β1合成水平的影響體、siNOX4對(duì)細(xì)胞增殖的影響

Fig 2 The effects of radiation, TGF - β1, Fig 3 The effects of radiation, neutralizing antibody and siNOX4 on TGF - β1neutralizing antibody TGF-β1synthesis level and siNOX4 on cell proliferation

圖 4 射線、 TGF-β1對(duì)NOX4合成水平的影響 (×100)

Fig 4 The effects of X-ray and TGF-β1on the synthesis level of NOX4 (×100)

圖 5 射線、TGF-β1及siNOX4對(duì)α-SMA合成量的影響

Fig 5 The effects of radiation, TGF-β1and siNOX4 on α-SMA synthesis

為揭示TGF-β1在ORNJ疾病發(fā)展中的作用，本研究對(duì)BMSCs進(jìn)行外源性TGF-β1的干預(yù)，觀察到與射線對(duì)BMSCs的作用效果相似的NOX4、α-SMA合成的增多、細(xì)胞增殖能力下降等一系列現(xiàn)象，證實(shí)TGF-β1導(dǎo)致BMSCs中α-SMA合成的增多作用與放射線的電離輻射損傷高度類似，且TGF-β1極有可能是導(dǎo)致NOX4表達(dá)升高的重要因素。同時(shí)，用抗體中和TGF-β1的作用，觀察到放射線的促BMSCs中NOX4與α-SMA合成作用以及抑制細(xì)胞增殖的作用減弱。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明TGF-β1合成的增多可能是放射線對(duì)BMSCs的作用中NOX4與α-SMA合成增多、細(xì)胞增殖能力下降的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。用siRNA抑制NOX4表達(dá)后對(duì)細(xì)胞進(jìn)行的照射實(shí)驗(yàn)中，觀察到α-SMA水平較單純照射組有一定下降。說明NOX4在一定程度上參與了射線對(duì)BMSCs向MFB分化的過程。此外，抑制NOX4的表達(dá)還可以緩解射線對(duì)細(xì)胞增殖的抑制作用，提示NOX4也參與了是射線電離輻射對(duì)BMSCs的細(xì)胞損傷作用。

對(duì)siNOX4轉(zhuǎn)染后的BMSCs進(jìn)行輻照，其TGF-β1合成水平較單純照射組無明顯改變，說明NOX4未參與射線對(duì)BMSCs的促TGF-β1合成作用。有研究表明NOX 4可以介導(dǎo)TGF-β1對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡和表型變化[14]，那么對(duì)于ORNJ中的BMSCs是否也有類似的作用？為進(jìn)一步明確TGF-β1與NOX4這兩種重要細(xì)胞損傷產(chǎn)物之間可能存在的關(guān)系，將外源性TGF-β1作用于siNOX4轉(zhuǎn)染的BMSCs。觀察到抑制NOX4表達(dá)合成后，除α-SMA的表達(dá)合成部分下降外，細(xì)胞形態(tài)損傷、生長(zhǎng)抑制等現(xiàn)象均得到一定緩解。上述現(xiàn)象說明NOX4可能是TGF-β1誘導(dǎo)BMSCs中細(xì)胞損傷和增殖抑制的重要分子機(jī)制之一，并部分參與了TGF-β1的促M(fèi)FB分化作用。

綜合上述系列實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以得出結(jié)論：放射線作用于BMSCs后首先誘導(dǎo)了TGF-β1合成水平的升高，進(jìn)而誘導(dǎo)了BMSCs向MFB發(fā)生分化，并導(dǎo)致細(xì)胞結(jié)構(gòu)破壞、細(xì)胞增殖抑制等現(xiàn)象的發(fā)生。在這一過程中，NOX4 作為重要中間環(huán)節(jié)，參與了TGF-β1對(duì)BMSCs的細(xì)胞破壞和增殖抑制作用，并部分參與了TGF-β1的促M(fèi)FB分化作用。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示抑制TGF-β1的表達(dá)和/或合成可能是防治ORNJ的有效途徑。但由于TGF-β1是體內(nèi)的一種關(guān)鍵細(xì)胞因子，其作用廣泛而復(fù)雜，牽涉眾多細(xì)胞和器官的功能。為避免抑制TGF-β1所帶來的全身其他負(fù)面影響，將NOX4作為防治靶點(diǎn)也可有效緩解射線帶來的組織細(xì)胞壞死、纖維化形成等后果，具有較高的臨床指導(dǎo)意義。