一種新型彈性仿生人工血管修復大鼠血管缺損的應用研究

張晏源 黃鑫 呂前欣 侯燕 靳丹 高曄 劉富偉 蔡卜磊 孔亮

血管移植常用于口腔頜面部創(chuàng)傷后組織修復重建，自體血管移植是血運重建的“金標準”，但使用自體血管會造成供區(qū)損傷，且個體也無法提供足夠的血管量來滿足臨床需求[1-2]。因此人工血管替代自體血管已成為趨勢。目前人工血管雖然已被用于臨床，但常因動脈瘤、動脈破裂、血管內(nèi)膜過度增生等情況導致移植失敗。其主要原因是人工血管力學性能低和生物學性能差[3]。

本研究利用靜電紡絲技術，使用PCL和PU逐層構建彈性仿生人工血管，內(nèi)層、外層均采用PCL微納米紡絲提高生物學性能[4]，中層采用PCL/PU(W/W, 1/3) 微納米紡絲增強力學性能，提高血管彈性[5]。隨后，構建SD大鼠腹主動脈缺損模型，并使用該PCL/PU血管修復缺損，并檢測其在體內(nèi)的血管重建效果，為PCL/PU血管的臨床應用提供實驗依據(jù)和理論基礎。

1 材料與方法

1.1 PCL/PU血管構建

聚己內(nèi)酯(PCL)、聚氨酯(PU, Sigma-Aldrich, 美國)； 二氯甲烷(DCM)、N，N-二甲基甲酰胺(DMF)、四氫呋喃(THF)(北京化學試劑有限公司)。 采用靜電紡絲，層層組裝制備PCL/PU血管，接收紡絲的為直徑2 mm的金屬滾軸，滾軸勻速轉動，使紡絲均勻纏繞并逐漸增厚，內(nèi)層為PCL微納米纖維，中層為PCL/PU(W/W，1/3)混合微納米纖維，外層為PCL微納米纖維，連續(xù)紡絲至形成PCL/PU血管，成通風干燥，備用。

1.2 大鼠腹主動脈與PCL/PU血管微觀結構比較

掃描電鏡(SEM)(Hitachi, S-4800, 日本)觀察，大鼠腹主動脈與PCL/PU血管分別剪裁出長度0.5 cm，戊二醛固定24 h后，梯度乙醇脫水，無水乙醇脫水2次，加入鋨酸，干燥，噴金，SEM觀察。

1.3 爆破壓力測試

將PCL/PU血管(4 cm)固定至爆破壓測量儀上，在管腔內(nèi)注入蒸餾水，一端連接電子氣壓計，另一端連接氣瓶，逐漸增加PCL/PU血管管腔內(nèi)壓力，并記錄壓力值，直至PCL/PU血管發(fā)生滲漏。

1.4 模量測試

獲取大鼠腹主動脈和PCL/PU血管，利用萬能力學儀(BOSE 3220,美國)測量，設定拉升速度為1 cm/min，重復測量5 次。

1.5 動物模型建立

選取200～230 g， 8 周齡 SD雄性大鼠10 只，第四軍醫(yī)大學實驗動物中心提供。采用戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉(0.167 g/100 g)，腹正中切口，用濕棉棒輕柔推開腸道，暴露腹主動脈，夾閉腹主動，剪斷并用肝素鈉沖洗管腔，使用8-0縫線在顯微鏡下操作縫合，建立SD大鼠腹主動脈移植PCL/PU血管模型，術前、術后均不使用任何抗凝藥物，并在1 個月后進行取材。

1.6 組織學切片制作

取材后，用PBS沖洗組織，OCT包埋，在-20 ℃下冷凍切片厚度為7 μm，然后進行HE染色、Masson染色，并于正置顯微鏡下拍攝記錄。免疫熒光染色采用CD31(R&D)、 α-SMA(Abcam)， BSA封閉， 4 ℃孵育過夜，F(xiàn)luor594(CST)避光孵育1 h，封片，激光共聚焦顯微鏡(CLM, OLYMPUS, FV1000, 日本)下拍攝記錄。

2 結 果

2.1 血管斷面觀察對比

SEM顯示大鼠腹主動脈(n=5)厚度約為(180±32) μm，呈現(xiàn)典型三層結構，內(nèi)層為菲薄的ECs層；中層為結構致密的SMCs層；外層為結構較為疏松的結締組織層。PCL/PU血管(n=5)厚度較大鼠腹主動脈略厚，約為(250±24) μm，也呈明顯的三層結構，內(nèi)層為PCL微納米纖維層；中層為PCL/PU微納米纖維層，外層為PCL微納米纖維層(圖 1)。

圖1 大鼠腹主動脈和PCL/PU血管結構 (SEM, ×300)

Fig 1 Structure of rat abdominal aorta and PCL/PU aorta graft (SEM, ×300)

2.2 爆破壓測試效果

測量儀器最大壓力值120 kPa≈900 mmHg，本實驗中隨機抽取PCL/PU血管(n=5)，反復充壓30 次，充壓時膨脹，降壓時收縮，該PCL/PU血管均能夠保持彈性，期間PCL/PU血管未出現(xiàn)滲漏，其爆破壓力值超過900 mmHg，可以耐受正常生理血壓(圖 2)。

圖 2 PCL/PU血管爆破壓測試

Fig 2 The burst pressure test of aorta graft

2.3 模量測試結果

通過拉伸測試PCL/PU血管模量達到(5.60±0.34) MPa，斷裂伸長率可達到564%±28%；大鼠腹主動脈模量達到(2.06±0.11) MPa，斷裂伸長率可達到170%±20%， PCL/PU血管強度高于大鼠腹主動脈(圖 3)。

2.4 PCL/PU血管愈合

SD大鼠腹主動脈移植PCL/PU血管術后30 d取材(n=10), 其中1 只在術后1 d內(nèi)死亡，探查發(fā)現(xiàn)死亡原因為PCL/PU血管吻合口破裂，腹腔內(nèi)出血致死。其余9 只SD大鼠進食以及運動功能等均未見異常。取材樣本大體觀察可見PCL/PU血管均與自體血管融合良好，在外層形成豐富的滋養(yǎng)血管網(wǎng)，血流通暢(圖 4)，縫線吻合處光滑，無狹窄、無動脈瘤形成(圖 4)。

圖 3 大鼠腹主動脈和PCL/PU血管應力應變曲線

Fig 3 The stress strain curve of rat abdominal aorta and PCL/PU aorta graft

圖 4 PCL/PU血管大體觀察

Fig 4 The gross observation of PCL/PU aorta graft

HE染色可見，大鼠腹主動脈的結構，內(nèi)層為ECs，中層為SMCs，外層為疏松結締組織(圖 5A、 5B)； PCL/PU血管植入30 d內(nèi)，也形成了類似大鼠腹主動脈的管狀結構(EF)。Masson染色觀察，大鼠腹主動脈外層可見大量的膠原包裹(CD)；PCL/PU血管中層和外層內(nèi)可見有豐富的膠原纖維相互融合(GH)。

CD31和a-SMA分別為EC和SMC的標記蛋白，PCL/PU血管免疫熒光觀察可見，內(nèi)層有ECs覆蓋，ECs結構完整連續(xù)，為移植血管提供了良好的封閉性(圖 6A)；中層分布較多的SMCs，由內(nèi)到外逐漸減少，推測PCL/PU血管中層的SMCs來源為血循環(huán)，因此短期內(nèi)呈現(xiàn)由內(nèi)到外逐漸減少的密度梯度；外層可見SMCs呈環(huán)形分布，說明短期內(nèi)周圍組織就有成熟的滋養(yǎng)血管長入(圖 6B)，為PCL/PU血管的改建提供細胞來源。

圖 5 大鼠腹主動脈與PCL/PU血管組織組織學觀察

Fig 5 Histopathological observation of rat abdominal aorta and PCL/PU aorta graft

3 討 論

理想的人工血管需要具備良好的力學性能，能夠耐受血壓的變化，防止血管破裂；還需要具備良好的生物學性能，能夠與自體血管相互融合，防止血管阻塞。模擬天然血管的結構和功能，是一種簡潔、有效的構建人工血管方法。

PCL是一種應用廣泛的生物材料， 已有其運用于組織工程修復受損的表皮、神經(jīng)、骨缺損、軟骨缺損的報道，其具有較好的生物學性能，并且可以完全降解[4-6]。PU是一種柔韌性好具有高度彈性的材料，已有報道使用PU作為人工血管材料，但因其結構致密，限制營養(yǎng)物質(zhì)交換，愈后不佳等原因并未廣泛應用[7]。本研究創(chuàng)新性的結合兩種材料的優(yōu)點，使用靜電紡絲技術來進行PCL/PU血管的制造。首先，我們使用致密的PCL紡絲構建表面較為平整的內(nèi)膜層，從而有效防止血栓形成并同時利于ECs粘附。其次，疏松的PCL紡絲構建外層，模擬天然血管外層的疏松結締組織，靜電紡絲提供的高表面積比和高孔隙率，便于細胞遷入孔隙中。最后，PCL/PU紡絲構建中層，PU和PCL有相似的官能團，按比例混合可使其力學性能協(xié)同增強，模擬天然血管中層平滑肌的支撐功能[5]。PCL/PU血管植入30 d，大體觀察可見，其外表面形成的豐富的滋養(yǎng)血管網(wǎng)，更加利于物質(zhì)交換，內(nèi)層縫合處光滑，無狹窄或血栓；HE染色證實內(nèi)層形成完整平滑的ECs；中層隨著PCL成分的降解，逐漸增大的孔隙更利于SMCs進入紡絲間隙中，Masson染色也證實中層內(nèi)有豐富的膠原纖維的形成，從而利于PCL/PU血管維持足夠的力學性能，也促使PCL/PU血管與自體組織融合；免疫熒光染色顯示血管ECs在PCL/PU內(nèi)表面完整覆蓋，而ECs正是止血和減少血栓形成中起著關鍵細胞[8-9]。SMCs已長入血管中層，其細胞密度由內(nèi)到外逐漸減少，提示SMC的主要來源為外周血循環(huán)，SMCs的遷入也預示著PCL/PU血管后期可能會具有舒張、收縮等血管功能；而PCL/PU血管外膜可見豐富的滋養(yǎng)血管；外層滋養(yǎng)血管長入能進一步促進材料的吸收和功能細胞的遷入[10-12]。

圖 6 PCL/PU血管免疫熒光染色

Fig 6 Immunofluorescent staining of PCL/PU aorta graft

綜上所述，本研究所合成的PCL/PU彈性仿生人工血管具有良好的力學性能和生物學性能，并能在體內(nèi)改建同時維持力學強度，是一種具有優(yōu)良臨床應用潛力的人工血管。