基于線粒體COI基因和D-Loop區(qū)序列的7個鯉群體遺傳差異分析

鄒輝 韋玲靜 黃杰 甘寶江 莫潔琳 楊著山 滕忠作 劉康 葉香塵

摘要：【目的】從分子水平探究不同鯉群體的遺傳進化差異，明確金邊鯉線粒體基因的遺傳進化多樣性，為深入開展其遺傳資源保護及綜合利用提供理論依據(jù)?！痉椒ā坎捎肞CR直接測序分析金邊鯉、曬江鯉、太湖鯉、福瑞鯉、建鯉、興國紅鯉和黑龍江野鯉等7個鯉群體的線粒體CO I基因和D-Loop區(qū)序列，通過MegAlign 7.0和DnaSP 5.0對多態(tài)位點數(shù)（S）、單倍型數(shù)（H）、核苷酸多樣度（Pi）、單倍型多樣度（Hd）、平均核苷酸差異（K）及群體內(nèi)和群體間的遺傳距離等遺傳信息進行分析，運用Arlequin 3.5進行基因AMOVA分析，并以MEGA 7.0的鄰接法（NJ）構(gòu)建遺傳進化樹?！窘Y(jié)果】獲得7個鯉群體的CO I基因序列長787 bp和D-Loop區(qū)序列長878 bp。7個鯉群體間的CO I基因平均遺傳距離為0.0035，其中金邊鯉與曬江鯉的群體遺傳距離最大（0.0011），與建鯉的群體遺傳距離最?。?.0004）;D-Loop區(qū)序列平均遺傳距離為0.0292，其中金邊鯉與黑龍江野鯉的群體遺傳距離最大（0.0269），與福瑞鯉和建鯉的群體遺傳距離最小，均為0.0102。在161份樣品中，CO I基因共檢測到12種單倍型，以單倍型HAP2最多;D-Loop區(qū)序列共檢測到41種單倍型，其中HAP1、HAP2、HAP3、HAP4、HAP6、HAP7、HAP13和HAP15為金邊鯉的特有單倍型。CO I基因的群體間變異貢獻率為19.27%，群體內(nèi)變異貢獻率為80.73%;D-Loop區(qū)序列的群體間變異貢獻率為20.29%，群體內(nèi)變異貢獻率為79.71%。從基于K2P遺傳距離構(gòu)建的遺傳進化樹可看出，建鯉、福瑞鯉和太湖鯉3個群體的親緣關(guān)系最近，且同時與金邊鯉聚為一小支。【結(jié)論】金邊鯉的遺傳多樣性處于較高水平，可進一步選育獲得金邊鯉獨有的優(yōu)良性狀品系，或通過基因輔助技術(shù)與其他鯉品種進行雜交而獲得更優(yōu)秀的新品系。

關(guān)鍵詞： 金邊鯉;CO I基因;D-Loop區(qū);遺傳多樣性;遺傳變異

中圖分類號： S965.116? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?文獻標(biāo)志碼： A 文章編號：2095-1191（2020）05-1209-08

Abstract：【Objective】The genetic and evolutionary variation of different carp populations were explored at the molecular level to clarify the genetic and evolutionary diversity of the mitochondrial genes of Jinbian carp， which would provide a theoretical basis for the further protection and comprehensive utilization of genetic resources on Jinbian carp. 【Method】Partial sequence of mitochondrial DNA CO I gene and D-Loop region of seven carp populations， including Jinbian carp， Shaijiang carp， Taihu carp， Furui carp， Jian carp， Xingguohong carp， and Heilongjiang wild carp， were determined by PCR direct sequencing. Genetic information such as number of polymorphic loci（S）， haplotypes（H）， nucleotide diversity（Pi）， haplotype diversity（Hd）， mean nucleotide difference（K）， and genetic distance within and between populations were analyzed by MegAlign 7.0 and DnaSP 5.0 software， Arlequin 3.5 was used for gene AMOVA analysis， and MEGA 7.0 neighbor joining method （NJ） was used to construct the genetic tree. 【Result】As a result， a total of 7 populations of CO I gene 788 bp and D-Loop gene 874 bp fragment sequences were obtained. The average genetic distance of CO I gene in 7 carp groups was 0.0035， among which genetic distance between Jinbian carp and Shaijiang carp was the maximum（0.0011）， and the genetic distance between Jinbian carp and Jian carp was the minimum（0.0004）. The average genetic distance of D-Loop region sequence was 0.0292， in which the genetic distance of Jinbian carp was maximum compared with Heilongjiang wild carp（0.0269）， and was the minimum compared with Furui carp and Jian carp（0.0102）. Among 161 samples， 12 haplotypes were detected in CO I gene， of which HAP2 was the maximum. A total of 41 haplotypes were detected in D-loop region sequence， and haplotypes HAP1，HAP2， HAP3， HAP4， HAP6， HAP7， HAP13 and HAP15 were unique haplotypes in Jinbian carp population. The interpopulation variation contribution rate of CO I gene was 19.27%， and the intra-population variation contribution rate was 80.73%. The inter-population variation contribution rate of D-Loop region sequence was 20.29%， and the intra-population variation contribution rate was 79.71%. According to the genetic trees constructed by K2P genetic distance， it showed that the three groups of Jian carp， Furui carp and Taihu carp had the closest genetic relationship， and then they clustered into a small branch with Jinbian carp. 【Conclusion】The genetic diversity of Jinbian carp is at a high level. The strain with fine traits of Jinbian carp can be obtained through further breeding， or new strains can be obtained through cross breeding with other carps via genetic assisted technology.

Key words： Jinbian carp; CO I gene; D-Loop region; genetic diversity; genetic variability

Foundation item： Project of National Bulk Freshwater Fish Industry Technology System Construction（CARS-45）; Self-financing Project of Guangxi Agricultural Science and Technology（Z2019124）

0 引言

【研究意義】鯉（Cyprinus carpio）隸屬于輻鰭魚綱（Actinopterygii）鯉形目（Cypriniformes）鯉科（Cyprinidae），是我國淡水養(yǎng)殖的重要經(jīng)濟魚類之一，其環(huán)境耐受力強、生長快、品種繁多（鐘小群等，2018），且富含蛋白質(zhì)、維生素和礦物質(zhì)，在人體內(nèi)的消化吸收率高（黃鸞玉等，2018）。近年來，廣西水產(chǎn)引育種中心以融水田鯉為基礎(chǔ)群體，針對稻田養(yǎng)殖培育出的金邊鯉，具有體型短小、膚黃腹圓、性情溫順、起捕率高、魚肉品質(zhì)優(yōu)及不易隨洪水游走等優(yōu)點，備受養(yǎng)殖戶青睞，現(xiàn)已陸續(xù)覆蓋至云南、貴州、四川及廣東等地。雖然金邊鯉在我國稻田立體養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)中已得到推廣，但該品種的種質(zhì)資源鑒定尚不成熟，導(dǎo)致商業(yè)養(yǎng)殖生產(chǎn)中的糾紛時有發(fā)生。線粒體對動物的品種鑒定及群體遺傳分化具有重要意義，因此，基于線粒體細胞色素C氧化酶亞基 I（CO I）基因和線粒體調(diào)控區(qū)（D-Loop）序列分析金邊鯉與其他鯉群體的遺傳差異，可為金邊鯉遺傳進化關(guān)系的確定提供參考依據(jù)?！厩叭搜芯窟M展】線粒體DNA（mtDNA）是母系遺傳的基礎(chǔ)，具有分子量小、結(jié)果簡單及進化快等特點（Kochzius and Blohm，2005），是研究動物起源進化和群體遺傳分化的理想對象。Bessho等（1992，1997）通過推導(dǎo)得出CO I基因具有獨特的遺傳密碼，并證實該基因與細胞的核型及生殖存在密切關(guān)系，進一步說明基于CO I基因開展魚類遺傳多樣性分析對揭示其群體進化規(guī)律具有重要意義。向燕等（2013）對38尾清水江鯉個體CO I基因進行遺傳多樣性分析，發(fā)現(xiàn)清水江鯉CO I基因序列變異明顯，遺傳多樣性較豐富。Mabuchi和Song（2014）對日本觀賞鯉線粒體全基因組進行測序，發(fā)現(xiàn)其基因組序列有65%與中國甌江彩鯉相同，故推斷出日本觀賞鯉起源于中國甌江彩鯉，也提示線粒體的遺傳研究對揭示物種起源與分化具有重要意義。王磊等（2018）研究發(fā)現(xiàn)5個黃河鯉線粒體群體的CO I基因遺傳變異率較小，但在不同的群體間相對差異明顯，該結(jié)論為利用CO I基因差異進行鯉種質(zhì)資源鑒定提供了參考依據(jù)。黃小林等（2018）通過對黃斑籃子魚的D-Loop區(qū)序列進行遺傳變異分析，發(fā)現(xiàn)黃斑籃子魚經(jīng)歷了種群擴張事件，并推測擴張時間在1.38萬～4.60萬年前，即可通過線粒體序列推測種群的歷史演變過程及預(yù)測其演變趨勢。張晨等（2018）通過線粒體全基因組對白甲魚屬8個種類進行分析，填補了我國在白甲魚屬系統(tǒng)發(fā)育學(xué)研究上的空白，也說明線粒體全基因組對于系統(tǒng)發(fā)育學(xué)研究具有重要作用。Kamaluddin等（2018）基于D-Loop區(qū)序列對物種進行鑒定，并在亞種水平上區(qū)分了物種和地理起源，說明D-Loop區(qū)序列對于品種區(qū)分具有重要意義。基于線粒體基因序列與種屬遺傳多樣性的密切關(guān)系，目前已有較多學(xué)者通過線粒體基因序列研究進一步揭示魚類的遺傳學(xué)關(guān)系，并探討線粒體變異與魚類種群結(jié)構(gòu)進化的相關(guān)性（Prakhongcheep et al.，2018;Spiridonova and Surmach，2018）。【本研究切入點】CO I是線粒體氧化呼吸鏈的重要成員，其結(jié)構(gòu)簡單、進化速度快、重組率低，且進化信息量大（Verheyen et al.，2003），因此通過CO I基因序列可迅速、準(zhǔn)確地進行物種鑒定及種間親緣關(guān)系分析。D-Loop是線粒體基因序列中進化速率最快的區(qū)域，特別適合群體遺傳分析（王偉偉等，2015;李夢榮等，2018）?？梢?，線粒體CO I基因和D-Loop區(qū)序列對研究動物起源進化及群體遺傳分化具有重要意義，但至今鮮見有關(guān)鯉線粒體CO I基因和D-Loop區(qū)序列的研究報道?！緮M解決的關(guān)鍵問題】以金邊鯉和其他6個我國常見鯉群體為研究對象，采用PCR直接測序分析線粒體CO I基因和D-Loop區(qū)序列片段，研究其遺傳進化關(guān)系，通過線粒體基因找出不同鯉群體在分子水平上的遺傳進化差異，明確金邊鯉線粒體基因的遺傳進化多樣性，為深入開展其遺傳資源保護及綜合利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1. 1 試驗材料

7個鯉群體樣品的采集時間、采樣地點和樣品數(shù)量詳見表1。采樣方式為隨機采樣，采集鰭條組織置于無水酒精中保存。試驗所用的分子生物學(xué)試劑均購自北京全式金生物技術(shù)有限公司。

1. 2 基因組總DNA提取

采用高鹽法提取基因組DNA（楊楊等，2018），并以1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測基因組DNA質(zhì)量。

1. 3 線粒體CO I基因和D-Loop區(qū)序列擴增及測序

根據(jù)GenBank中已發(fā)表的鯉線粒體全長序列（登錄號JN105357），利用Oligo 7.0設(shè)計2對引物，以提取的7個鯉群體總DNA為模板，通過設(shè)計的引物分別擴增CO I基因和D-Loop區(qū)序列片段，其中，用于擴增CO I基因的上游引物為5'-GCCCTTCAAGC TTTAAGTAG-3'、下游引物為5'-AGGGGTGTTTG GTATTGAGAG-3';用于擴增D-Loop區(qū)序列的上游引物為5'-TATTCTGAGCCCTAGTAGC-3'、下游引物為5'-CTA GAGAAGATATATTATGC-3'。PCR反應(yīng)體系30.0 ?L：2×Taq MasterMix 15.0 ?L，擴增引物各1.0 ?L，DNA模板2.0 ?L，加ddH2O補足至30.0 ?L。擴增程序：94 ℃預(yù)變性5 min;94 ℃ 30 s，退火30 s，72 ℃ 2 min，進行35個循環(huán);72 ℃延伸5 min，4 ℃保存。分別取5.0 ?L PCR擴增產(chǎn)物，用1.5%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，并通過凝膠成像系統(tǒng)拍照記錄。選取與預(yù)期結(jié)果一致的PCR擴增產(chǎn)物片段送至深圳華大基因股份有限公司進行雙向測序，以保證測序的準(zhǔn)確性。

1. 4 數(shù)據(jù)分析

采用ClustalX對測序結(jié)果進行排列并檢測，以MegAlign 7.0對核苷酸序列進行比對;利用DnaSP 5.0計算單倍型多樣度、核苷酸多樣度及單倍型間的遺傳距離;采用Tajima及Fus和Lis統(tǒng)計量方法檢測群體內(nèi)部的DNA水平自然選擇作用;運用Arlequin 3.5進行基因AMOVA分析，并通過MEGA 7.0中的鄰接法（Neighbor-joining，NJ）構(gòu)建遺傳進化樹。

2 結(jié)果與分析

2. 1 7個鯉群體CO I基因和D-Loop區(qū)序列及堿基組成分析結(jié)果

經(jīng)PCR擴增獲得的產(chǎn)物片段與預(yù)期條帶大小一致，測序結(jié)果經(jīng)比對矯正后，獲得7個鯉群體的CO I基因序列長787 bp和D-Loop區(qū)序列長878 bp。其中，CO I基因的A+T含量為68.50%、G+C含量為31.50%;D-Loop區(qū)序列的A+T含量為58.17%、G+C含量為41.83%。

2. 2 7個鯉群體CO I基因和D-Loop區(qū)序列的遺傳多樣性

在7個鯉群體中，金邊鯉的CO I基因序列核苷酸多態(tài)性居中，以太湖鯉和黑龍江野鯉的核苷酸多樣度最高，而建鯉的最低;金邊鯉的D-Loop區(qū)序列核苷酸多態(tài)性也居中，以黑龍江野鯉的核苷酸多樣度最高，而福瑞鯉的最低（表2）。Tajima及Fus和Lis檢驗發(fā)現(xiàn)，僅福瑞鯉的CO I基因和D-Loop區(qū)序列中性檢驗結(jié)果均為負值且顯著偏離中性（P<0.05），可能是福瑞鯉群體規(guī)模放大和定向選擇的結(jié)果。

7個鯉群體間的CO I基因平均遺傳距離為0.0035。其中，金邊鯉與曬江鯉的群體遺傳距離最大，為0.0011，與建鯉的群體遺傳距離最小，為0.0004;建鯉與金邊鯉、太湖鯉和福瑞鯉的群體遺傳距離均為0.0004（表3）。7個鯉群體間的D-Loop區(qū)序列平均遺傳距離為0.0292。其中，金邊鯉與黑龍江野鯉的群體遺傳距離最大，為0.0269，與福瑞鯉和建鯉的群體遺傳距離最小，均為0.0102（表4）。

AMOVA分析結(jié)果（表5）表明，CO I基因的群體間變異貢獻率為19.27%，群體內(nèi)變異貢獻率為80.73%，固定指數(shù)為0.2029;D-Loop基因的群體間變異貢獻率為20.29%，群體內(nèi)變異貢獻率為79.71%，固定指數(shù)為0.1927。單倍型分析結(jié)果表明，CO I基因共檢測到12種單倍型（表6），其中，金邊鯉有3種，太湖鯉有3種，福瑞鯉有4種，建鯉有2種，興國紅鯉有2種，黑龍江野鯉有4種，曬江鯉有3種。各單倍型中以HAP2最多。D-Loop區(qū)序列共檢測到41種單倍型（表7），其中，金邊鯉有9種，太湖鯉有6種，福瑞鯉有4種，建鯉有4種，興國紅鯉有6種，黑龍江野鯉有17種，曬江鯉有11種。各單倍型中，以HAP9的數(shù)量最多，HAP11在不同鯉群體出現(xiàn)的頻率最高，除金邊鯉外，在其他6個鯉群體中均有分布。除HAP5外，HAP1、HAP2、HAP3、HAP4、HAP6、HAP7、HAP13和HAP15均為金邊鯉的特有單倍型。

采用MEGA 7.0根據(jù)Kimura雙參數(shù)模型，分別基于CO I基因和D-Loop區(qū)序列計算各群體間的K2P遺傳距離并構(gòu)建遺傳進化樹。基于CO I基因K2P遺傳距離構(gòu)建的鯉群體遺傳進化樹（圖1）顯示，建鯉與太湖鯉先聚為一小支，再與福瑞鯉和興國紅鯉聚為一支，然后依次與金邊鯉、黑龍江野鯉和曬江鯉聚為一大支，表明金邊鯉、黑龍江野鯉及曬江鯉與其他4個鯉魚群體的遺傳關(guān)系較遠?；贒-Loop區(qū)序列K2P遺傳距離構(gòu)建的鯉群體遺傳進化樹（圖2）顯示，建鯉與福瑞鯉聚為一小支，再與太湖鯉聚為一支，而金邊鯉與曬江鯉聚為另一小支，然后這兩小支聚為一支再與興國紅鯉聚為一大支。

3 討論

本研究結(jié)果表明，PCR擴增獲得的條帶單一清晰，且經(jīng)測序分析發(fā)現(xiàn)條帶大小與預(yù)期結(jié)果一致。從7個鯉群體CO I基因和D-Loop區(qū)序列的堿基組成分析結(jié)果可知，CO I基因的A+T含量為68.50%，大于G+C含量（31.50%）;D-Loop區(qū)序列的A+T含量為58.17%，大于G+C含量（41.83%）。這與目前已知硬骨魚類物mtDNA序列中A+T含量大于G+C含量（司李真等，2017）的情況相同，也與吳寧等（2010）針對鰻鱺、胡靜等（2012，2014）針對波紋魚的研究結(jié)果一致，說明金邊鯉的線粒體基因測序結(jié)果可靠。

本研究的AMOVA分析結(jié)果表明，7個鯉群體CO I基因的群體間遺傳變異率（19.27%）明顯低于群體內(nèi)遺傳變異率（80.73%），D-Loop區(qū)序列的群體間變異貢獻率（20.29%）也明顯低于群體內(nèi)變異貢獻率（79.71%）。依據(jù)Wright（1978）認(rèn)為群體間變異貢獻率在5%～15%時該群體為中度遺傳分化的判斷標(biāo)準(zhǔn)，本研究中的7個鯉群體屬于高度遺傳分化，可能是養(yǎng)殖過程中非常重視種質(zhì)選擇而導(dǎo)致不同群體間差異明顯;且其群體內(nèi)變異貢獻率也很高，提示不同群體及其內(nèi)部均各自具有相互隔離的遺傳結(jié)構(gòu)。分子進化的中性突變學(xué)說認(rèn)為：分子水平上的隨機遺傳漂變（Random genetic drift）比自然選擇（Natural selection）更重要（韋文惠等，2012）。一般通過Tajima檢驗及Fu?s和Li?s檢驗來檢測種或種群內(nèi)部的自然選擇作用，本研究的Tajima檢測及Fus和Lis檢驗結(jié)果均顯示，福瑞鯉均為負值且顯著偏離中性，說明該群體在近期歷史上出現(xiàn)過種群快速擴張事件，故推測該群體是在瓶頸效應(yīng)后才出現(xiàn)種群數(shù)量擴張;太湖鯉和曬江鯉2個群體均為正值且未顯著偏離中性，表明這2個群體尚未發(fā)生明顯種群擴張，種群數(shù)量相對穩(wěn)定。遺傳多樣性存在于生物個體內(nèi)、單個物種內(nèi)及物種間，是物種適應(yīng)性和進化的基礎(chǔ)，其中種內(nèi)遺傳多樣性與該物種對環(huán)境的適應(yīng)能力呈正相關(guān)（楊慧榮等，2012）。在眾多衡量群體遺傳分化的指標(biāo)中最常用遺傳分化指數(shù)（Fst），當(dāng)Fst在0.15～0.25范圍內(nèi)時表明群體間具有明顯的遺傳分化，綜合金邊鯉與其他6個鯉群體CO I基因和D-Loop區(qū)序列的Fst可知，金邊鯉與太湖鯉、福瑞鯉、興國紅鯉和曬江鯉間的遺傳分化程度較高。

分布最廣泛的單倍型稱為祖先類型（Crandall and Templeton，1993）。在本研究中，從CO I基因單倍型分析結(jié)果可看出HAP2是7個鯉群體的主導(dǎo)單倍型，而D-Loop區(qū)序列單倍型分析結(jié)果表明7個鯉群體不存在非常明顯的主導(dǎo)單倍型，但金邊鯉的所有單倍型（除HAP5外）均為特有單倍型，說明金邊鯉在種間的遺傳分化程度非常高。金邊鯉是以融水田鯉為基礎(chǔ)群體，針對稻田養(yǎng)殖而選育開發(fā)的新品系，該品系大部分膚色呈青灰色，僅頭部頂端上緣一直到尾部上緣的皮膚為金色，連續(xù)或斷續(xù)連成一條金色粗線。自金邊鯉線粒體全基因組序列測定（Ye et al.，2018）以來，尚未研發(fā)出一種能精確鑒別金邊鯉的有效方法，因此，D-Loop區(qū)序列的特有單倍型啟發(fā)今后可通過這些單倍型來鑒別鯉的種類，或通過金邊鯉與其他品種的基因型差異研究揭示金邊鯉的內(nèi)在分子機制。此外，基于CO I基因和D-Loop區(qū)序列對7個鯉群體的單倍型分析結(jié)果表明，除太湖鯉外，其他6個鯉群體均存在特有單倍型，暗示各群體間均有一定程度的遺傳分化，且存在廣泛基因交流。

基于2種基因序列K2P遺傳距離構(gòu)建的遺傳進化樹存在明顯差異，主要體現(xiàn)在7個鯉群體的進化關(guān)系上。其中，基于CO I基因K2P遺傳距離構(gòu)建的鯉群體遺傳進化樹顯示，金邊鯉與曬江鯉的親緣關(guān)系最遠;而基于D-Loop區(qū)序列K2P遺傳距離構(gòu)建的鯉群體遺傳進化樹表明，金邊鯉與曬江鯉的親緣關(guān)系最近。究其原因可能是金邊鯉與曬江鯉存在一定的親緣關(guān)系，二者均為廣西本地魚，但CO I基因和D-Loop區(qū)序列是線粒體上不同位置的序列片段，其中，D-Loop區(qū)序列在遺傳學(xué)上多樣性較豐富，導(dǎo)致金邊鯉與曬江鯉存在明顯差異可能與D-Loop區(qū)序列的變異有關(guān)，但具體原因需通過分子系統(tǒng)研究并結(jié)合形態(tài)特征及解剖結(jié)構(gòu)分析進一步確認(rèn)。從基于2種基因序列K2P遺傳距離構(gòu)建的遺傳進化樹均可看出，建鯉、福瑞鯉和太湖鯉3個群體的親緣關(guān)系最近，且同時與金邊鯉聚為一小支，說明這4個群體在一定程度上具有較近的親緣關(guān)系。可見，金邊鯉與建鯉、福瑞鯉和太湖鯉雖然遺傳分化程度較高，但其親緣關(guān)系最近。

4 結(jié)論

金邊鯉的遺傳多樣性處于較高水平，可進一步選育獲得金邊鯉獨有的優(yōu)良性狀品系，或通過基因輔助技術(shù)與其他鯉品種進行雜交而獲得更優(yōu)秀的新品系。

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（責(zé)任編輯 蘭宗寶）