絕對(duì)定量分析不同條銹病抗性小麥品種根際細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)

李菲 李欲軻 洪鯤 張宇斌 湯小辛

摘要：【目的】分析不同條銹病抗性小麥品種根際細(xì)菌群落的結(jié)構(gòu)和功能差異，為開(kāi)發(fā)防治小麥條銹病的環(huán)境友好方案提供理論基礎(chǔ)和創(chuàng)新思路?！痉椒ā恳酝坏貕K中對(duì)條銹病具有不同抗性的4個(gè)小麥品種（抗病品種貴農(nóng)19和華麥1223，感病品種002和I19）為研究材料，采集不同抗性小麥品種根際土壤樣品，采用絕對(duì)定量擴(kuò)增子分析技術(shù)，研究抗病和感病小麥品種根際細(xì)菌的群落結(jié)構(gòu)和功能。【結(jié)果】同一地塊的4個(gè)小麥品種條銹病病情指數(shù)具有明顯差異。4個(gè)小麥品種根際土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)絕對(duì)定量分析表明，感病與抗病小麥品種的根際細(xì)菌群落分別聚類(lèi)成獨(dú)立的兩類(lèi)。感病小麥品種根際細(xì)菌群落豐度和多樣性顯著高于抗病小麥品種根際細(xì)菌群落（P<0.05）。坐標(biāo)分析（PCoA）表明，所有小麥品種根際細(xì)菌群落按照抗病性不同分為兩組;細(xì)菌群落功能分析表明，抗病小麥品種根際細(xì)菌群落具有更多的氨基酸和抗生素分泌功能?！窘Y(jié)論】條銹病抗性對(duì)小麥根際細(xì)菌群落的影響超過(guò)小麥不同品種間遺傳變異的影響。通過(guò)分析和挖掘不同條銹病抗性小麥品種的根際細(xì)菌群落，可開(kāi)發(fā)出環(huán)境友好的小麥條銹病生物防治菌劑。

關(guān)鍵詞： 小麥;條銹病;根際細(xì)菌群落;絕對(duì)定量

中圖分類(lèi)號(hào)： S435.121.43? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號(hào)：2095-1191（2020）05-1115-07

Abstract：【Objective】The structural and functional differences of rhizosphere bacterial communities of wheat cultivars with different stripe rust resistance levels were analyzed， which provided theoretical basis and innovative ideas for the development of environmentally friendly ways for the control of wheat stripe rust. 【Method】Four wheat cultivars（resistant cultivars Guinong 19 and Huamai 1223， susceptible cultivars 002 and I19） with different resistance levels to stripe rust in the same plot were collected. Rhizosphere soils samples were collected， and absolute quantitative amplicon analysis techniques was used to study the differences in rhizosphere bacterial community structure and function of resistant cultivars and susceptible cultivars. 【Result】There was obvious difference in stripe rust disease index among the four wheat cultivars in the same plot. The absolute quantitative analysis on rhizosphere bacterial community structure of the four wheat cultivars indicated that the rhizosphere bacterial community of resistant cultivars and susceptible cultivars clustered into two groups. Compared with the resistant varieties， the abundance and diversity of rhizosphere bacterial communities of stripe rust susceptible wheat were significantly higher（P<0.05）. Coordinate analysis（PCoA） analysis showed that the wheat cultivars could be divided into two groups according to the resistance. Functional analysis showed that the rhizosphere bacterial community of resistant wheat cultivars had more amino acids and antibiotic secretion functions. 【Conclusion】The effect of stripe rust resistance on the rhizosphere bacterial community of wheat cultivars exceed the genetic varia-tion among different wheat cultivars. Through analyzing rhizosphere bacterial community of wheat cultivars with different resistances can develop environmentally friendly biological control agent for wheat stripe rust.

Key words： wheat; stripe rust; rhizosphere bacterial community; absolute quantification

Foundation item： National Natural Science Foundation of China（U1812401）

0 引言

【研究意義】小麥（Triticum spp.）是世界上種植面積最大的糧食作物，2018年種植面積約2.2億ha，產(chǎn)量約7.6億t，全球產(chǎn)量在玉米之后，排名第二（United States Department of Agriculture-Foreign Agricultural Service，2019）。小麥條銹病是影響小麥產(chǎn)量的重要因素，病原菌是擔(dān)子菌門(mén)條形柄繡菌（Puccinia striiformis f. sp. tritici條形柄銹菌小麥專(zhuān)化型，簡(jiǎn)稱(chēng)Pst）。Pst是專(zhuān)性活體營(yíng)養(yǎng)的真菌，生長(zhǎng)在寄主細(xì)胞間隙中，通過(guò)吸器從小麥細(xì)胞吸取養(yǎng)分。目前防治小麥條銹病主要依靠化學(xué)藥劑和種植抗病品種?？箺l銹病小麥品種由于對(duì)條銹菌具有小種的專(zhuān)化抗性，如過(guò)度集中使用，即長(zhǎng)期大面積種植單一抗性品種，常會(huì)促使條銹病菌生理小種產(chǎn)生定向變異，進(jìn)而產(chǎn)生新的毒力小種并克服品種的抗性，最后導(dǎo)致新的毒性小種大面積暴發(fā)流行，造成小麥產(chǎn)量損失，加大農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的風(fēng)險(xiǎn)。因此，開(kāi)發(fā)環(huán)境友好的高效小麥條銹病控制方案，是小麥生產(chǎn)可持續(xù)發(fā)展的迫切需求?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】植物根系吸收水分和無(wú)機(jī)養(yǎng)分，并分泌各種有機(jī)質(zhì)到土壤中（Hacquard et al.，2015）。植物根際的每克土壤中約含有數(shù)十億個(gè)微生物，形成數(shù)萬(wàn)個(gè)不同的種類(lèi)，因此，植物根際土壤被認(rèn)為是一個(gè)高度復(fù)雜和動(dòng)態(tài)的生態(tài)系統(tǒng)（Bulgarelli et al.，2013;Mendes et al.，2013;Phili-ppot et al.，2013）。目前已知植物共生微生物在植物應(yīng)對(duì)病菌侵染中具有重要作用（Berg et al.，2016;Castrillo et al.，2017）。有學(xué)者從玉米（Planchamp et al.，2014）等農(nóng)作物的根際分離篩選出根際菌株，并證明部分菌株可用于防治農(nóng)作物病害。番茄品系對(duì)青枯病菌的不同抗性，部分原因是根際微生物不同所致（Kwak et al.，2018）。研究表明，植物根際促生細(xì)菌（Plant growth promoting rhizobacteria，PGPR）能抑制植物根際有害微生物生長(zhǎng)（Hu et al.，2018）。此外，PGPR還能誘導(dǎo)植物產(chǎn)生系統(tǒng)抗性，從而提高宿主植物整體的抗病能力（Pieterse et al.，2014）。目前常規(guī)16S擴(kuò)增子測(cè)序在分析樣本微生物組成時(shí)僅考慮微生物的相對(duì)豐度（比例），但微生物的相對(duì)豐度只表征了一個(gè)樣本中微生物類(lèi)群的相對(duì)比例。以往大多數(shù)研究用相對(duì)豐度來(lái)進(jìn)行跨樣本微生物豐度的比較，當(dāng)樣本間總微生物絕對(duì)含量存在差異時(shí)，可能會(huì)得出與事實(shí)相反的結(jié)論，所以通過(guò)一定手段獲得微生物絕對(duì)豐度信息能為反映微生物群落結(jié)構(gòu)及其動(dòng)態(tài)變化提供更多有價(jià)值的參考信息（Smets et al.，2016）。Tkacz等（2018）比較了多個(gè)環(huán)境下相對(duì)定量和絕對(duì)定量擴(kuò)增子分析的結(jié)果，發(fā)現(xiàn)會(huì)存在某一微生物種類(lèi)絕對(duì)數(shù)量上升，而相對(duì)數(shù)量下降的情況。說(shuō)明只有絕對(duì)定量分析才能反映樣本每種微生物的真實(shí)數(shù)量變化和各組間樣本的真實(shí)差異，絕對(duì)定量分析是微生態(tài)研究的首選方法（Smets et al.，2016;Tkacz et al.，2018）。【本研究切入點(diǎn)】根際微生物對(duì)宿主植株抗病能力的影響已有較多研究，但根際微生物對(duì)小麥條銹病抗性的影響目前尚無(wú)文獻(xiàn)報(bào)道?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】采用絕對(duì)定量擴(kuò)增子測(cè)序的方法，對(duì)在同一地塊中對(duì)條銹病表現(xiàn)不同抗性的小麥品系的根際微生物進(jìn)行比較分析，研究小麥、條銹病菌和根際微生物群落之間的相互作用，為開(kāi)發(fā)小麥條銹病防治的環(huán)境友好方案提供理論基礎(chǔ)和創(chuàng)新思路。

1 材料與方法

1. 1 試驗(yàn)材料

田間試驗(yàn)于國(guó)家小麥育種改良中心花溪實(shí)驗(yàn)站進(jìn)行。該實(shí)驗(yàn)站位于我國(guó)西南部貴州省貴陽(yáng)市花溪區(qū)，屬亞熱帶季風(fēng)氣候，四季分明，冬無(wú)嚴(yán)寒、夏無(wú)酷暑，最冷月1月氣溫4～10 ℃，最熱月7月氣溫25～28 ℃;雨量充沛，濕度較大，年均降水量1100～1300 mm。小麥條銹病菌在該地區(qū)過(guò)冬，為翌年在全國(guó)流行提供菌源。

本研究選擇同一地塊中對(duì)條銹病表現(xiàn)出不同抗性的4個(gè)小麥品種，感病和抗病品種各2個(gè)，分別為抗病品種貴農(nóng)19和華麥1223，感病品種002和I19。小麥對(duì)條銹病抗感的病情指數(shù)使用0～9分評(píng)分（Line and Qayoum，1992）：高抗[R，0～3分，葉片無(wú)銹斑（0分）或很少（3分），無(wú)孢子堆（0分）或孢子堆很小（3分）]、中抗（MR，4～5分）、中感（MS，6分）和易感（S，7～9分，9分是指葉片孢子堆大而多，葉片黃色）。灌漿期采集4個(gè)小麥品種的根際土壤，每個(gè)小麥品種設(shè)3個(gè)生物學(xué)重復(fù)，共12個(gè)土壤樣品。每個(gè)樣品包括10～12株長(zhǎng)勢(shì)基本一致的小麥根際土壤。盡可能完整地挖出小麥植株的全部根系，輕柔晃動(dòng)，把浮土甩掉，甩不掉的土壤認(rèn)定為小麥的根際土壤，立即將樣品帶回實(shí)驗(yàn)室，使用滅菌200目篩對(duì)根際土壤進(jìn)行篩慮。剔除篩后粉末中的細(xì)根和石子等，將所得土壤粉末保存于-80 ℃冰箱，待用。

1. 2 試驗(yàn)方法

將采集的根際土壤樣品送至上海天昊生物技術(shù)公司進(jìn)行絕對(duì)定量16S rRNA Miseq的擴(kuò)增子測(cè)序。按照PowerSoil DNA試劑盒說(shuō)明（MoBio，Carlsbad，USA）提取總基因組DNA。將具有至少4種不同濃度（內(nèi)標(biāo)的103、104、105和106個(gè)拷貝）的9種不同加標(biāo)序列添加到樣品DNA庫(kù)中。加標(biāo)序列由選擇的天然16S rRNA基因和人工可變區(qū)相同的保守區(qū)組成，然后通過(guò)擴(kuò)增細(xì)菌16S rRNA基因的V4～V5區(qū)域產(chǎn)生細(xì)菌擴(kuò)增子文庫(kù)。

1. 3 統(tǒng)計(jì)分析

使用TrimGalore 0.5.0（Babraham Bioinformatics，UK）和Mothur1.25.1（https：//www.mothur.org/）從raw reads中去除接頭和引物序列。僅使用平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)大于20且無(wú)模糊堿基的長(zhǎng)度大于200 bp的序列進(jìn)行隨后的分析。這些序列聚類(lèi)成操作分類(lèi)單位（OTU），序列相似性為97%，然后濾出加標(biāo)序列并對(duì)OTUs進(jìn)行計(jì)量。使用Smets等（2016）和Tkacz等（2018）描述的R-3.2.2進(jìn)行根際微生物絕對(duì)定量分析。使用Mothur1.25.1classify.seqs命令和RDP數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行OTUs分類(lèi)（Cole et al.，2014）。熱圖、坐標(biāo)分析圖（PCoA）和平均鏈接層次聚類(lèi)由R-3.2.2執(zhí)行。

使用PICRUSt軟件將條銹病抗病小麥和感病小麥根際土壤細(xì)菌群落的基因家族（功能）豐度表（KEGG）進(jìn)一步匯總到更高水平的功能分類(lèi)上。使用Welchs T-test對(duì)兩個(gè)分組樣本細(xì)菌群落KEGG功能條目的豐度進(jìn)行差異比較，找出兩組中具有顯著差異的KEGG功能通路。

2 結(jié)果與分析

2. 1 小麥品種田間條銹病抗性調(diào)查結(jié)果

4個(gè)小麥品種均種植在國(guó)家小麥育種改良中心花溪實(shí)驗(yàn)站，數(shù)十年來(lái)，該地塊種植的小麥均會(huì)發(fā)生條銹病。田間調(diào)查發(fā)現(xiàn)，該地塊各小麥品種條銹病病情指數(shù)具有明顯差異（圖1）。其中貴農(nóng)19和華麥1223表現(xiàn)出極強(qiáng)的抗條銹病能力，田間病情指數(shù)分值分別為2和1分;002和I19兩個(gè)品種則嚴(yán)重感病，田間病情指數(shù)分值分別為8和9分。采集4個(gè)小麥品種的根際土壤進(jìn)行絕對(duì)定量測(cè)序分析。

2. 2 小麥根際土壤細(xì)菌群落擴(kuò)增子測(cè)序結(jié)果

去除模糊、短、低質(zhì)量的reads和單獨(dú)的OTU后，共有3688572個(gè)reads用于12個(gè)土壤樣品的細(xì)菌群落分析。每個(gè)樣本生成的OTU數(shù)量為3838～4735，并由RDP數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)一步分類(lèi)。基于內(nèi)部加標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)及其衍生的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)評(píng)估16S-seq數(shù)據(jù)的絕對(duì)量（如，R1樣品的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)公式為y=1.0342x-1.5416，其中，y表示以對(duì)數(shù)計(jì)的加入加標(biāo)序列的拷貝數(shù)，x表示以對(duì)數(shù)觀察到的OUT讀數(shù);所有擬合系數(shù)R2>0.99）。

微生物的相對(duì)豐度只表征一個(gè)樣本中微生物類(lèi)群的相對(duì)比例。與相對(duì)定量分析相比，絕對(duì)定量分析確定了每個(gè)微生物類(lèi)群的絕對(duì)量，有利于不同樣本間的比較。條銹病感病和抗病小麥品種根際土壤樣本細(xì)菌群落相對(duì)和絕對(duì)定量聚類(lèi)結(jié)果見(jiàn)圖2。相對(duì)定量分析數(shù)據(jù)顯示，小麥各品種間聚類(lèi)較雜亂，感病小麥品種與抗病小麥品種未聚類(lèi)在一起;絕對(duì)定量分析數(shù)據(jù)顯示，感病小麥品種與抗病小麥品種分成獨(dú)立的兩類(lèi)。

條銹病感病和抗病小麥品種根際土壤樣本細(xì)菌群落相對(duì)定量和絕對(duì)定量比較見(jiàn)圖3。與感病小麥品種（S）相比，抗病小麥品種（R）根際土壤中細(xì)菌的總豐度相對(duì)較小。絕對(duì)定量分析顯示，與抗病小麥品種相比，感病小麥品種根際的變形菌門(mén)（Proteobacteria）和擬桿菌門(mén)（Bacteroidetes）均顯著升高（P<0.05，下同）;相對(duì)定量分析顯示，感病小麥根際放線(xiàn)菌門(mén)（Actinobacteria）含量低于抗病小麥，但絕對(duì)定量分析顯示，兩種小麥的根際細(xì)菌群落中Actinobacteria的絕對(duì)量無(wú)顯著差異（P>0.05，下同）。綜上所述，因絕對(duì)定量分析數(shù)據(jù)能更準(zhǔn)確地反映真實(shí)情況，使用絕對(duì)定量測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行后續(xù)分析。

2. 3 小麥根際土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)分析結(jié)果

感病小麥品種和抗病小麥品種的根際細(xì)菌群落具有明顯不同的α多樣性指數(shù)。與感病小麥品種相比，抗病小麥品種細(xì)菌群落OUT數(shù)目較少，Chao1、ACE和Shannon指數(shù)均低于感病小麥品種，群落多樣性較低;感病小麥品種根際細(xì)菌群落具有更多的OUT數(shù)目和更高的群落多樣性（圖4）。

根據(jù)PCoA（在Weighted UniFrac上計(jì)算，圖5-A）和平均連鎖分層聚類(lèi)（UPGMA，在Bray-Curtis上計(jì)算，圖5-B），感病小麥品種與抗病小麥品種根際細(xì)菌群落在PCo1（67.98%）水平上明顯分開(kāi)。感病和抗病小麥品種內(nèi)部，細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的差異不明顯，說(shuō)明條銹病抗性的差異對(duì)小麥植株根際細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)具有顯著影響，且其影響大于小麥不同品種間基因型差異的影響。

2. 4 抗病相關(guān)細(xì)菌群落功能分析結(jié)果

使用Welchs T-test對(duì)感病小麥品種和抗性小麥品種兩組樣本細(xì)菌群落KEGG功能條目的豐度進(jìn)行差異比較，找出兩組中具有顯著差異的功能。通過(guò)初步分析，發(fā)現(xiàn)134個(gè)KEGG（KO） term在感病小麥品種和抗病小麥品種間存在顯著差異。

在抗病小麥品種的根際細(xì)菌群落中，多個(gè)KEGG功能條目具有更高的豐度值，包括轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、鏈霉素的生物合成、纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸的生物合成等。植物病原體相互作用等KEGG途徑功能條目在感病小麥中具有更高的豐度值（圖6）。

3 討論

植物根際土壤是一個(gè)高度復(fù)雜和動(dòng)態(tài)的生態(tài)系統(tǒng)（Bulgarelli et al.，2013;Mendes et al.，2013;Philippot et al.，2013）。已有充分的研究證明生長(zhǎng)在鹽、旱、熱、重金屬和病菌、害蟲(chóng)侵害等不利環(huán)境中的植物，其對(duì)逆境的適應(yīng)能力部分甚至全部來(lái)自于與其共生的微生物（Zhou et al.，2015;Raza et al.，2016;Wang et al.，2016;Yuan et al.，2016）。溫室和野外試驗(yàn)均證實(shí)，如果去除關(guān)鍵的內(nèi)生菌，某些耐逆境植物不再能夠適應(yīng)原本生存的不利環(huán)境（Redman et al.，2002）。有科學(xué)家提出，自然界中植物的表型是植物基因組和根際/體內(nèi)廣泛存在的微生物協(xié)同作用的產(chǎn)物（Vandenkoornhuyse et al.，2015）。

目前對(duì)小麥條銹病抗性的研究主要集中在抗病種質(zhì)和基因的挖掘，忽略了小麥健康的一個(gè)重要影響因素——根際微生物。高通量測(cè)序技術(shù)極大地方便了人們對(duì)植物根際微生物群落結(jié)構(gòu)和功能的研究。針對(duì)模式植物擬南芥和農(nóng)作物水稻、玉米、小麥的研究發(fā)現(xiàn)，土壤理化性質(zhì)、植物發(fā)育階段和基因型是影響植物根際細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的主要因素（Bulga-relli et al.，2012;Lundberg et al.，2012;Mahoney et al.，2017），但對(duì)不同小麥品種間根際細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的差異尚無(wú)研究報(bào)道。

對(duì)同一地塊不同條銹病抗性小麥品種根際微生物進(jìn)行比較分析發(fā)現(xiàn)，與抗病小麥品種相比，感病小麥品種根際細(xì)菌群落豐度增加，多樣性增加。功能分析表明，抗病小麥根際細(xì)菌群落具有分泌更多氨基酸（包括纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸等）和抗生素（如鏈霉素）的功能?？箺l銹病小麥品種與感條銹病小麥品種的根際細(xì)菌群落存在顯著差異，其影響大于小麥品種基因型的影響。因此，進(jìn)一步挖掘抗病小麥品種根際的有益細(xì)菌，提高小麥根際抗生素分泌功能，應(yīng)可顯著改善小麥植株的抗條銹病能力。這一結(jié)果為開(kāi)發(fā)小麥條銹病防治的環(huán)境友好方案提供了理論基礎(chǔ)和創(chuàng)新思路。

4 結(jié)論

通過(guò)采集同一地塊中對(duì)條銹病具有不同抗性的4個(gè)小麥品種根際細(xì)菌群落進(jìn)行絕對(duì)定量擴(kuò)增子分析，發(fā)現(xiàn)條銹病抗性對(duì)小麥根際細(xì)菌群落的影響超過(guò)小麥不同品種間遺傳變異的影響;通過(guò)分析和挖掘不同條銹病抗性小麥品種的根際細(xì)菌群落，可開(kāi)發(fā)出環(huán)境友好的小麥條銹病生物防治菌劑。

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（責(zé)任編輯 麻小燕）