外源茉莉酸對稻瘟病菌引起褐點型壞死斑的水稻防御響應的影響

李春琴 段桂花 馬笑晴 劉文倩 唐萍 楊靜

摘要：【目的】解析外源茉莉酸（JA）對JA合成/響應、水楊酸（SA）合成/受體及防御相關基因表達的影響，為進一步揭示JA調控稻瘟病菌侵染引起褐點型壞死斑的水稻抗病作用機制提供基礎數據。【方法】以接種稻瘟病菌菌株Y92-66b后形成褐點型壞死斑的地方中抗水稻月亮谷為研究材料，分別利用400 μmol/L JA和200 μmol/L JA抑制劑（IBU）外源處理接種稻瘟病菌后引起褐點型壞死斑（72 h）的水稻月亮谷，調查水稻稻瘟病癥狀，同時利用實時熒光定量PCR（qRT-PCR）檢測JA合成/響應、SA合成/受體、防御和蔗糖/果糖合成酶基因的表達?！窘Y果】外源JA有效減輕了水稻稻瘟病癥狀。同時，JA誘導水稻JA合成基因OsLOX1、OsOPR1、OsOPR7、OsJIMT、OsHPL3和OsAOS2在72 h時上調表達，至96和120 h時，只有OsAOS2、OsOPR7和OsLOX1上調表達，其余3個基因下調表達;外源JA未誘導OsLOX3表達;JA誘導水稻JA響應基因OsCOI1a、OsMYC2、OsJAZ1、OsJAZ9和OsbHLH35在72 h時上調表達，至120 h時，只有OsCOI1a和OsJAZ1上調表達，其余3個基因均下調表達;外源JA未誘導OsCOI1b和JiOsPR10表達。JA誘導SA受體基因OsNPR4在72 h時顯著上調表達（P<0.05，下同），96 h時下調表達，至120 h時又上調表達但不顯著（P>0.05）。JA誘導SA合成相關基因OsPAD4在72 h時顯著上調表達，OsEDS1在120 h時顯著上調表達。外源JA誘導防御基因OsPR5在72 h時開始上調表達，至96 h時顯著上調表達;外源JA未誘導OsPR4a表達。外源JA誘導參與細胞壁合成的蔗糖合成酶基因OsRSUS1和果糖合成酶基因OsFRK-2表達，IBU則加重了水稻稻瘟病癥狀，同時抑制大部分JA合成/響應、蔗糖/果糖合成酶和防御基因的表達?！窘Y論】外源JA主要通過誘導稻瘟菌引起的褐點型壞死斑的水稻JA合成/響應基因、參與細胞壁合成的蔗糖/果糖合成酶及防御基因表達參與水稻防御響應。

關鍵詞： 水稻;稻瘟病菌;茉莉酸;防御響應;褐典型壞死斑

中圖分類號： S435.111.41? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?文獻標志碼： A 文章編號：2095-1191（2020）05-1053-09

Abstract：【Objective】To analyze the effects of exogenous jasmonic acid（JA） on endogenous JA synthesis/response， salicylic acid（SA） synthesis/receptor and defense related gene expression were studied to provide reference? for in-depth research on the JA regulation in rice defense mechanism during the formation of brown necrotic spots caused by Magnaporthe oryzae infection. 【Method】In this study， medium resistant rice cultivar Yuelianggu was inoculated with blast strain Y92-66b and treated with 400 μmol/L JA and 200 μmol/L JA depressor（IBU） during the formation of brown necrotic spots（72 h）， the symptom of rice blast were investigated. And expression level of JA synthesis/response， SA synthesis/receptor， defense related and cell-wall synthesis relatedsucrose/fructose synthetase genes were detected by real-time fluorescence quantitative PCR（qRT-PCR）. 【Result】Exogenous JA effectively reduced the symptoms of rice blast disease. Simultaneously， JA induced up-regulation of JA-synthesis genes of OsLOX1，OsOPR1，OsOPR7，OsJIMT，OsHPL3 and OsAOS2 at 72 h，only expression of OsAOS2，OsOPR7 and OsLOX1 were up-regulated at 96 and 120 h，and the other three genes were down-regulated. The expression of OsLOX3 was not induced by exogenous JA. Exogenous JA induced JA-response genes such as OsCOI1a，OsMYC2，OsJAZ1，OsJAZ9 and OsbHLH35 at 72 h，only OsCOI1a and OsJAZ1 were up-regulated at 120 h， and the other three genes were down-regulated. Exogenous JA did not induce expression of OsCOI1b and JiOsPR10. The SA receptor gene of OsNPR4 appeared significantly up-regulated at 72 h induced by exogenous JA（P<0.05， the same below）， down-regulated at 96 h and up-regulated at 120 h but insignificantly（P>0.05）. JA induced SA synthesis related gene OsPAD4 was significantly up-regulated at 72 h and OsSED1 was significantly up-regulated at 120 h.OsPR5， a defense gene induced by JA， was up-regulated at 72 h and significantly up-regulated at 96 h. Exogenous JA did not induce OsPR4a expression， but induced the expression of sucrose synthetase gene of OsRSUS1 and fructose synthetase gene of OsFRK-2， which were involved in cell wall synthesis. While IBU aggravated the symptoms of rice blast and inhibited expression of most JA synthesis/response， sucrose/fructose synthetase and defense genes. 【Conclusion】Exogenous JA mainly participate rice defense response by inducing expression of JA synthesis/response genes，sucrose/fructose synthetase and defense genes that are involved in cell wall synthesis during the formation of brown necrotic spots caused by M. oryzae infection.

Key words： rice; Magnaporthe oryzae; jasmonic acids; defense response; brown necrotic spots

Foundation item： National Natural Science Foundation of China（31860483，31400073）; Program for Innovative Research Team in Science and Technology in Universities of Yunnan（2019）

0 引言

【研究意義】稻瘟病菌屬于半活體寄生真菌，能侵染水稻植株的各部位引起葉瘟、穗頸瘟、谷粒瘟等，是造成水稻減產的主要病害之一，每年可造成10%～30%的水稻產量損失（Nalley et al.，2016;曹慧娟等，2019）。目前，稻瘟病防治主要通過選育抗病品種及化學防治，生產上使用的抗病品種大多抗譜較窄，因而在水稻抗病育種實踐上的應用價值不高（Dangl et al.，2013），加之稻瘟病菌毒性小種變異速度較快，抗病品種種植3～5年后易被新的毒性小種克服，導致抗性喪失（Hasan et al.，2017）;化學防治一直是生產上廣泛使用的防治措施，但隨之帶來的環(huán)境污染及稻瘟病菌毒性小種耐藥性增強等問題嚴重限制了化學防治的持久大規(guī)模應用，也是最不可取的防治方法（Gurjar et al.，2012; Law et al.，2017）。因此，非常有必要尋找更加安全有效的稻瘟病菌綠色防控方法?！厩叭搜芯窟M展】目前農業(yè)生產上以植物激素在內的許多激發(fā)子已逐漸應用于植物病害防治，如外源茉莉酸（Jasmonic acid，JA）噴霧處理大麥等植物后顯著提高了植株抗性（Oka et al.，2013;Cao et al.，2016）。Shang等（2011）報道水楊酸（Salicylic acid，SA）預先噴施煙草后再噴施JA，能有效防控煙草病毒病害，是一種綠色安全有效的防控方法。JA處理水稻后誘導芳樟醇等醇類抗菌物質合成（Taniguchi et al.，2014）及許多PR基因如OsPR1a、OsPR1b、OsPR2、OsPR5和OsPR10等上調表達，激活水稻免疫響應（Agrawal et al.，2000a，2000b;王云鋒等，2018）。因此，JA在植物病害防治方面具有極佳的應用潛力。稻瘟病菌孢子在稻瘟病菌侵染循環(huán)中起核心作用，當稻瘟病菌孢子接觸水稻葉片表面（0 h）后開始發(fā)芽（2 h）并形成附著胞（8 h），附著胞穿透寄主角質層侵入細胞（16～20 h），隨后侵染菌絲長滿侵入的第一個細胞（20～36 h），并向臨近細胞擴展定殖（36～48 h）（Koga，1994），屬于稻瘟病菌活體營養(yǎng)階段;72 h時水稻開始顯現褐點型壞死斑，隨后進入死體營養(yǎng)階段（Bhadauria et al.，2013）。由于部分半活體寄生真菌在侵染早期無法檢測，加之田間狀態(tài)下觀察不到任何癥狀（García-Guzmán and Heil，2014），以至于無法確定最佳的防控時期，與上述半活體寄生真菌有所區(qū)別的是，稻瘟病菌侵染72 h時的水稻葉片上開始顯現肉眼可見的褐點型壞死斑，為生產上制定稻瘟病防控措施提供了非常重要的契機。據此，本課題組前期利用外源JA處理稻瘟病菌侵染72 h時的高感水稻品種麗江新團黑谷，發(fā)現外源JA激活了高感水稻防御相關基因及JA途徑相關基因上調，有效控制了稻瘟病發(fā)生，表明外源JA處理稻瘟病菌侵染72 h時的高感水稻是稻瘟病防控的最佳時間（王云鋒等，2018）?！颈狙芯壳腥朦c】雖然前期研究已明確JA在高感水稻與稻瘟病菌強致病菌株互作體系中能有效控制稻瘟病的發(fā)生，但關于外源JA在抗病水稻與稻瘟病菌強致病菌株互作體系中對水稻抗瘟性及JA合成/響應和防御體系的影響尚未開展相關研究?！緮M解決的關鍵問題】以外源JA和JA抑制劑IBU（Ibuprofen）處理接種稻瘟病菌后褐點型壞死斑形成時期（接種后72 h，下同）的地方抗病水稻月亮谷，解析外源JA對JA合成/響應、SA合成/受體、防御和蔗糖/果糖合成酶基因表達的影響，以明確JA對月亮谷抗瘟性及防御體系的影響，為進一步揭示JA調控稻瘟病菌侵染引起褐點型壞死斑的水稻抗病作用機制提供基礎數據。

1 材料與方法

1. 1 試驗材料

供試水稻品種為月亮谷（月亮谷是云南元陽縣種植了上百年的傳統地方中抗稻瘟病品種，本課題組早期研究發(fā)現該品種具有很多優(yōu)良的農藝性狀基因），供試稻瘟病菌株為Y92-66b（強致病性菌株），均由云南生物資源保護與利用國家重點實驗室保存提供。

1. 2 試驗方法

1. 2. 1 水稻育苗及稻瘟病菌產孢培養(yǎng) 播種前將水稻土和腐殖土按2∶1混合均勻，滅菌后裝于育苗盤中備用。水稻種子先用1.5%次氯酸鈉消毒5 min，清水沖洗3～5遍，置于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中催芽至露白后播種于育秧盤中。水稻長至三葉一心期（約21 d）時用于稻瘟病菌接種試驗。

配制PDA培養(yǎng)基（馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、瓊脂粉15 g、蒸餾水1000 mL）用于稻瘟病菌株活化。挑取保存的Y92-66b菌種于PDA固體培養(yǎng)基上，置于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中活化培養(yǎng)，將活化菌絲移至PDA液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)4～5 d有大量菌絲產生。將菌絲涂布于西梅汁培養(yǎng)基（西梅汁40 mL、酵母提取物1 g、乳糖5 g、瓊脂粉15 g、蒸餾水定容至1000 mL，pH 6.5）上，置于28 ℃光照培養(yǎng)箱（12 h黑暗和12 h光照交替）中培養(yǎng)至培養(yǎng)基表面長滿菌絲，刮去培養(yǎng)基表面的菌絲后再持續(xù)光照培養(yǎng)5 d，即可產生大量分生孢子。

1. 2. 2 稻瘟病菌接種及JA和IBU處理接種稻瘟病菌后引起褐點型壞死斑的水稻 無菌水制備孢子懸浮液，顯微鏡下調節(jié)孢子濃度為1×105個/mL。孢子懸浮液噴霧于三葉一心期的水稻苗，將接種后的水稻苗置于培養(yǎng)箱中黑暗保溫（28 ℃）保濕（95%以上）24 h。于噴霧稻瘟病菌接種后0、24、48、72、96和120 h分別取樣，每個樣品進行3次生物學重復，每次重復6株水稻苗。

JA濃度配制按王云鋒等（2018）的方法，JA溶于100%乙醇中配制成300 mmol/L的母液，再用滅菌ddH2O稀釋為400 ?mol/L的工作液。IBU溶于100%乙醇配制成300 mmol/L的母液，再用滅菌ddH2O稀釋為100、200和300 ?mol/L的工作液。為確定IBU的濃度，利用100、200、300和400 ?mol/L的IBU分別處理接種稻瘟菌72 h的水稻，以無菌水處理接種稻瘟菌72 h的水稻為對照（CK），觀察水稻發(fā)病癥狀和調查病情指數。將400 ?mol/L JA和200 ?mol/L IBU分別噴霧處理接種稻瘟病菌引起褐點型壞死斑的水稻，于JA和IBU噴霧處理后72、96和120 h分別取樣。每個樣品進行3次生物學重復，每次重復6株水稻苗。于接種7 d時進行病害調查，病級分級標準參照許志剛（2002）的方法。

病情指數=∑（各級病葉數×各級代表值）/（調查

總葉數×最高一級代表值）×100

1. 2. 3 水稻JA合成/響應、SA合成/受體及防御相關基因表達分析 水稻基因表達分析參照王云鋒等（2018）的方法，并稍作修改。采用TransZol UP（北京全式金生物技術有限公司）試劑盒提取水稻總RNA，利用反轉錄試劑盒TransScript All-in-One First-Strand cDNA Synthesis SuperMix for qPCR（One-Step gDNA Removal）-AT341（北京全式金生物技術有限公司）將RNA反轉錄合成cDNA。根據JA合成/響應、SA合成/受體及防御相關基因的核酸序列設計引物，引物名稱及序列見表1。采用TransStart Top Green qPCR SuperMix-AQ131（北京全式金生物技術有限公司）試劑盒進行實時熒光定量PCR（qRT-PCR），反應體系20 ?L：上、下游引物各1 ?L，cDNA模板1 ?L，熒光染料10 ?L，ddH2O補足至20 ?L;擴增程序：95 ℃預變性3 min;95 ℃ 20 s，60 ℃ 20 s，進行45個循環(huán)。60 ℃升高到98 ℃獲取溶解曲線。試驗重復3次。

1. 3 統計分析

所有數據采用IBM SPSS Modeler 17.0進行處理，運用SigmaPlot 10.0作圖。

2 結果與分析

2. 1 不同濃度IBU處理接種稻瘟菌后引起褐點型壞死斑的水稻稻瘟病癥狀調查結果

調查結果顯示，4個IBU濃度處理接種稻瘟病菌72 h時的水稻稻瘟病癥狀較對照嚴重（圖1-A），100、200、300和400 ?mol/L IBU處理接種稻瘟菌72 h時的水稻病情指數分別為1.23、1.32、1.22和1.26，均高于對照的病情指數（1.20），但差異不顯著（P>0.05，下同），而4個IBU濃度處理受侵染水稻間的病情指數差異也不顯著（圖1-B）。依據4個IBU濃度處理受侵染水稻的稻瘟病病情指數，選取200 ?mol/L IBU開展后續(xù)試驗。

2. 2 JA和IBU處理接種稻瘟菌后引起褐點型壞死斑的水稻稻瘟病癥狀調查結果

200 ?mol/L IBU處理接種稻瘟病菌72 h的水稻稻瘟病癥狀較對照和JA處理的受侵染水稻稻瘟病癥狀嚴重（圖2-A），病情指數為1.42，顯著高于對照（1.04）和JA處理（0.34）（P<0.05，下同），表明IBU處理加重了接種稻瘟菌72 h時的水稻稻瘟病癥狀，而JA則減輕受侵染水稻稻瘟病癥狀。

2. 3 JA合成/響應基因在JA和IBU處理接種稻瘟菌后引起褐點型壞死斑水稻中的表達分析結果

利用qRT-PCR分析200 ?mol/L IBU和400 ?mol/L JA處理接種稻瘟菌72 h的水稻內源JA合成基因OsLOX1、OsLOX3、OsJMT1、OsOPR1、OsOPR7、OsAOS2和OsHPL3，以及JA響應基因OsCOI1a、OsCOI1b、OsJAZ1、OsJAZ9、OsMYC2、JiOsPR10和OsbHLH35的表達情況。以無菌水處理接種稻瘟菌72 h的水稻為對照。結果表明，外源JA誘導72 h的水稻JA合成相關基因OsLOX1（圖3-A）、OsJIMT（圖3-C）、OsOPR1（圖3-D）、OsOPR7（圖3-E）、OsAOS2（圖3-F）和OsHPL3（圖3-G）上調表達，至96和120 h時，僅OsAOS2、OsOPR7和OsLOX1上調表達，其余3個基因OsORP1、OsJIMT和OsHPL3則下調表達;未誘導OsLOX3（圖3-B）表達。外源JA誘導72 h時的水稻JA響應基因OsCOI1a（圖3-H）、OsJAZ1（圖3-J）、OsJAZ9（圖3-K）、OsMYC2（圖3-L）和OsbHLH35（圖3-M）上調表達，至120 h時，只有OsCOI1a和OsJAZ1上調表達，其余3個基因OsMYC2、OsJAZ9和OsbHLH35均下調表達;未誘導OsCOI1b（圖3-I）和JiOsPR10（圖3-N）表達。IBU則抑制上述基因表達（圖3-A～圖3-N）。因此，外源JA處理接種稻瘟病菌72 h的水稻能誘導水稻植株體內多個JA合成/響應基因表達，而IBU對上述基因表達的影響與外源JA的相反，即IBU抑制外源JA激活基因的表達。

2. 4 SA合成/受體、防御相關、蔗糖/果糖合成酶基因在JA和IBU處理接種稻瘟菌后引起褐點型壞死斑水稻中的表達分析結果

進一步分析200 ?mol/L IBU和400 ?mol/L JA處理接種稻瘟菌72 h的水稻中SA合成基因OsEDS1和OsPAD4、SA受體基因OsNPR4、參與細胞壁合成的蔗糖合成酶基因OsRSUS1和果糖合成酶基因OsFRK-2及防御基因OsPR4a和OsPR5的表達情況，結果發(fā)現JA處理的OsPR5（圖4-B）在72 h開始上調表達，至96 h時顯著上調表達;OsRSUS1（圖4-C）在120 h時顯著上調表達;OsFRK-2（圖4-D）在72、96和120 h時顯著上調表達;OsNPR4（圖4-G）在72 h時顯著上調表達，但96 h時抑制其表達，至120 h時又上調表達但不顯著;OsPAD4（圖4-F）在72 h時顯著上調表達;OsEDS1（圖4-E）在120 h時顯著上調表達。IBU處理的水稻中除OsEDS1（圖4-E）、OsPAD4（圖4-F）在72 h時上調表達外，其余5個基因（OsNPR4、OsRSUS1、OsFRK-2、OsPR4a和OsPR5）均下調表達。外源JA未誘導OsPR4a（圖4-A）上調表達。表明外源JA能誘導OsPR5、OsRSUS1和OsFRK-2上調表達，而IBU抑制JA激活基因的表達。

3 討論

JA作為多個植物激素的核心組分，參與多個植物激素信號共同調節(jié)植物生長發(fā)育和脅迫響應（Ahmad et al.，2016;Wasternack and Strand，2016;Yang et al.，2019）。外源施用JA提高植物抗性的研究已有較多報道（Taniguchi et al.，2014;Cao et al.，2016）。本課題組前期研究發(fā)現外源JA處理稻瘟病菌強致病菌株接種高感水稻麗江新團黑谷72 h（即褐點型壞死斑開始顯現）時稻瘟病癥狀明顯減輕（王云鋒等，2018）。在此基礎上，本研究進一步發(fā)現JA處理強致病菌株接種地方抗病水稻月亮谷72 h時稻瘟病癥狀也顯著減輕，而IBU處理的結果相反，推測外源JA可能激活水稻JA合成和防御響應。進一步分析發(fā)現，外源JA誘導JA合成基因OsLOX1、OsOPR7、OsAOS2和JA響應基因OsCOI1a、OsJAZ1、OsJAZ9上調表達，表明外源JA激活了JA合成及其信號通路。本研究檢測到JA誘導OsLOX1上調表達而未誘導OsLOX3上調表達，由于OsLOX1和OsLOX3基因結構相似且均參與病原菌防御響應（Maria and Singh，2012），表明JA可能在調控OsLOX1參與JA合成及防御響應中發(fā)揮作用。外源JA誘導96和120 h的OsAOS2顯著上調表達，但未誘導這兩個時間點的OsHPL3上調表達，由于OsAOS2和OsHPL3競爭性地與同一底物結合合成12，13-環(huán)氧—十八碳三烯酸（He et al.，2017），表明外源JA主要誘導OsAOS2和OsOPR7參與稻瘟病菌侵染水稻后期內源JA合成（Tani et al.，2008）。

有研究表明，JA誘導OsCOI1a與OsJAZ1和OsJAZ9結合而提高水稻對干旱和鹽等非生物逆境的耐受性（Wu et al.，2015;Fu et al.，2017），本研究中JA誘導OsCOI1a、OsJAZ1和OsJAZ9上調表達，表明外源JA也可能同時提高水稻對干旱和鹽害等非生物逆境的抗性。OsCOI1b主要參與調控葉片衰老（Yuan and Zhang，2015），外源JA和IBU處理的水稻中OsCOI1b的表達無明顯變化，結合侵染水稻稻瘟病癥狀調查結果，本研究認為外源施用JA并未引起水稻葉片衰老。OsEDS1是受病原菌和SA誘導的防御響應基因（Wiermer et al.，2005;Ke et al.，2019），本研究檢測到JA處理的水稻中OsEDS1在120 h時顯著上調表達，而OsPAD4只在72 h時上調表達，IBU處理的水稻中OsEDS1在72 h時上調表達，表明OsEDS1在72 h時的表達不受JA誘導。外源JA對SA受體基因OsNPR4表達無顯著影響。綜上所述，外源JA可能調控OsLOX1、OsOPR7、OsAOS2、OsCOI1a、OsJAZ1和OsJAZ9參與水稻內源JA合成和防御響應。

病原菌、SA、JA、斑蝥素（Cantharidin，CN）和茵多殺（Endothall，EN）能誘導OsPR5表達（Rakwal et al.，2001）。OsPR4a主要受干旱誘導表達（Wang et al.，2011），本研究鑒定到外源JA誘導OsPR5在72和96 h時上調表達，對OsPR4a表達無影響，而IBU抑制兩個防御基因表達，因此外源JA誘導OsPR5表達參與水稻防御響應。

細胞壁相關激酶在植物防御響應病原真菌侵染方面具有重要作用（Delteil et al.，2016）。其中，蔗糖合成酶的作用之一是引導UDP-葡萄糖合成纖維素等細胞壁多糖（Haigler et al.，2001），果糖合成酶則是磷酸化果糖進入細胞質后成為細胞壁合成的組分，特別是在木質素和導管的細胞壁發(fā)育中起作用（Stein and Granot，2018）。本研究中外源JA誘導蔗糖合成酶基因OsRSUS1在120 h時顯著上調表達，果糖合成酶基因OsFRK-2在72、96和120 h時顯著上調表達，表明外源JA通過誘導蔗糖/果糖合成酶基因表達在參與受侵染水稻后期細胞壁重建中發(fā)揮作用。

4 結論

外源JA主要通過誘導稻瘟菌引起褐點型壞死斑的水稻JA合成/響應基因、參與細胞壁合成的蔗糖/果糖合成酶基因及防御相關基因表達參與水稻防御響應。

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（責任編輯 麻小燕）