吡咯喹啉醌對(duì)舌鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的抑制作用研究

吳南 李斌

1.永州職業(yè)技術(shù)學(xué)院醫(yī)學(xué)院 永州 425000；2.湖南醫(yī)藥學(xué)院口腔醫(yī)學(xué)院 懷化 418000

舌鱗狀細(xì)胞癌（tongue squamous cell carcinoma，TSCC）是頭頸部最常見的惡性腫瘤之一，易發(fā)生周圍浸潤及早期淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，嚴(yán)重影響患者的生存周期和生活質(zhì)量[1]。上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）被認(rèn)為與腫瘤的侵襲和遷移密切相關(guān)[2]。吡咯喹啉醌（pyrroloquinoline quinone，PQQ）是一種新有機(jī)輔酶，從微生物到人體組織均有廣泛的分布，人體可通過飲食獲取以滿足機(jī)體的需要。目前已有研究[3-4]證實(shí)，PQQ具有保護(hù)神經(jīng)和心血管系統(tǒng)的作用。隨著研究的深入，PQQ亦被發(fā)現(xiàn)有良好的抗腫瘤作用[5]，但目前對(duì)鱗狀細(xì)胞癌，特別是TSCC的EMT作用報(bào)道較少，其相關(guān)機(jī)制也未明確。本研究選用TSCC細(xì)胞作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，探討PQQ對(duì)TSCC細(xì)胞EMT的作用及可能機(jī)制，為PQQ抗腫瘤作用的研究提供理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 細(xì)胞系

TSCC細(xì)胞株CAL27由上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院口腔醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室惠贈(zèng)。

1.2 試劑

PQQ（Sigma公司，美國）；DMEM/F12培養(yǎng)液（北京索萊寶科技有限公司）；活性氧（reactive oxygen species，ROS）試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司）、上皮鈣黏蛋白（E-cadherin）、波形蛋白（Vimentin）、鋅指轉(zhuǎn)錄因子Snail、核因子-κB（nuclear factor-κB，NF-κB）以及單克隆抗體（CST公司，美國）；β-actin一抗、LaminB多克隆抗體、二抗山羊抗兔等（北京康為世紀(jì)生物科技有限公司）；ROS清除劑N-乙酰基-L-半胱氨酸（N-acetyl-L-cysteine，NAC；Selleck公司，美國）；NF-κB激動(dòng)劑佛波醇酯（phorbol-12-myristate-13-acetate，PMA；MCE公司，美國）。本實(shí)驗(yàn)所需實(shí)驗(yàn)及設(shè)備由湖南醫(yī)藥學(xué)院生物研究中心提供。

1.3 方法

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng) CAL27細(xì)胞接種于含10%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基中，置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，取對(duì)數(shù)期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.3.2 MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖情況 取對(duì)數(shù)期生長細(xì)胞，以每孔8×103個(gè)細(xì)胞的密度接種于96孔板內(nèi)，培養(yǎng)過夜，設(shè)置PQQ不同濃度（0.5、2、4、8、16 μmol·L-1）處理組和空白對(duì)照組，每組5個(gè)復(fù)孔，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，每孔加入5g·L-1的MTT溶液10μL，孵育2h后棄上清液，加入100μL二甲基亞砜，避光振蕩30min后于酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀492nm下測(cè)定各孔吸光度值，計(jì)算PQQ的半數(shù)抑制濃度（half maximal inhibitory concentration，IC50）。

1.3.3 Transwell侵襲實(shí)驗(yàn) 實(shí)驗(yàn)分為空白對(duì)照組（不添加PQQ）和PQQ組（1、2、4 μmol·L-1）。Matrigel膠與無血清培養(yǎng)基按質(zhì)量比1：5混合，取50μL均勻鋪在Transwell小室底面，置于培養(yǎng)箱中，待其成凝膠狀后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，無血清培養(yǎng)基稀釋PQQ使終濃度分別為1、2、4 μmol·L-1，調(diào)整CAL27細(xì)胞密度約為每毫升4×105個(gè)，取500μL接種于小室上室，下室中加入含20%胎牛血清的培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，取出小室，用棉簽擦去上室細(xì)胞和Matrigel膠，4 ℃預(yù)冷PBS沖洗，甲醇固定15min，再以0.1%的結(jié)晶紫染色30min，清洗殘余結(jié)晶紫，于倒置相差顯微鏡隨機(jī)選擇4個(gè)視野計(jì)數(shù)細(xì)胞，重復(fù)3次，拍照，統(tǒng)計(jì)分析。

1.3.4 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn) CAL27細(xì)胞接種于6孔板內(nèi)，繼續(xù)培養(yǎng)待細(xì)胞鋪滿80%，用200μL的細(xì)胞刮做劃痕，換液拍照。以無血清培養(yǎng)基稀釋PQQ，使終濃度為1、2、4 μmol·L-1，加入培養(yǎng)板繼續(xù)培養(yǎng)24 h，換液拍照。

1.3.5 電子熒光顯微鏡下檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)ROS水平 以每孔1×104個(gè)細(xì)胞的密度接種于96孔板，PQQ（0、1、2、4 μmol·L-1）處理細(xì)胞24 h后，用5μmol·L-1的2,7-二氯-二氫熒光素二醋酸酯孵育30min，然后棄上清液，用PBS反復(fù)清洗3次，對(duì)照組及實(shí)驗(yàn)組分別加入200μL PBS，于電子熒光顯微鏡下，激發(fā)波長為488 nm、發(fā)射波長為525nm檢測(cè)細(xì)胞熒光強(qiáng)度，采用Image J軟件進(jìn)行分析。

1.3.6 Western blot法檢測(cè)NAC對(duì)PQQ調(diào)控相關(guān)蛋白表達(dá)的影響 CAL27細(xì)胞以每毫升1×106個(gè)的密度接種于6孔板，采用以下不同條件進(jìn)行處理?？瞻讓?duì)照組（培養(yǎng)基處理24 h）、PQQ組（2μmol·L-1PQQ處理細(xì)胞24 h）、PQQ+NAC組（1.0mmol·L-1NAC預(yù)處理細(xì)胞1h后，再加入2μmol·L-1PQQ處理細(xì)胞24 h）、NAC組（1.0mmol·L-1NAC預(yù)處理細(xì)胞1h，培養(yǎng)基處理細(xì)胞24 h）。收集各組細(xì)胞，加入細(xì)胞裂解液，離心收集細(xì)胞總蛋白，測(cè)定EMT相關(guān)蛋白（E-cadherin、Vimentin和Snail）的表達(dá)情況，收集細(xì)胞核蛋白以檢測(cè)NF-κB通路活化情況。經(jīng)蛋白定量后以10%～12%的聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白，5%的牛奶室溫封閉2h，用E-cadherin（1：1000）、Vimentin（1：1000）、Snail（1：800）、NF-κB蛋白（1：500）與聚偏二氟乙烯膜一起4 ℃孵育過夜，次日二抗孵育1h，化學(xué)發(fā)光法顯色，于Image Quant LAS-4000mini曝光成像儀中進(jìn)行分析。

1.3.7 Western blot法檢測(cè)PMA對(duì)PQQ調(diào)控相關(guān)蛋白表達(dá)的影響 CAL27細(xì)胞以每毫升1×106個(gè)的密度接種于6孔板，采用以下不同條件進(jìn)行處理?？瞻讓?duì)照組（培養(yǎng)基處理24 h）、PQQ組（以2μmol·L-1PQQ處理細(xì)胞24 h）、PQQ+PMA組（以100nmol·L-1PMA預(yù)處理細(xì)胞1h后，再加入2μmol·L-1PQQ處理細(xì)胞24 h）、PMA組（100nmol·L-1PMA預(yù)處理細(xì)胞1h后，培養(yǎng)基處理細(xì)胞24 h）。Western blot法檢測(cè)E-cadherin、Vimentin和Snail的表達(dá)情況，步驟與1.3.6相同。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

所有實(shí)驗(yàn)結(jié)果均為3次獨(dú)立試驗(yàn)，數(shù)據(jù)采用均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，用SPSS 19.0軟件中單因素方差分析進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，采用GraphPad Prism 6.0軟件繪圖，檢驗(yàn)水準(zhǔn)為雙側(cè)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 PQQ對(duì)CAL27細(xì)胞增殖的影響

CAL27細(xì)胞增殖的MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖1。0.5、2、4、8、16 μmol·L-1的PQQ作用24 h后，隨著作用濃度的增加，細(xì)胞存活率逐漸下降，提示PQQ對(duì)CAL27細(xì)胞的增殖有不同程度的抑制作用，PQQ作用24 h的IC50=6.69 μmol·L-1。

圖1 PQQ對(duì)CAL27細(xì)胞存活率的影響Fig 1 Effect of PQQ on CAL27cell proliferation

2.2 PQQ對(duì)CAL27細(xì)胞侵襲和遷移能力的影響

Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖2、3。與空白對(duì)照組（0μmol·L-1）比較，分別以1、2、4 μmol·L-1PQQ作用CAL27細(xì)胞24 h后，細(xì)胞數(shù)量明顯減少（P＜0.001），說明PQQ可以抑制CAL27細(xì)胞的侵襲性。細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)見圖4、5：1、2、4 μmol·L-1PQQ處理24 h后，與空白對(duì)照組（0μmol·L-1）比較，CAL27細(xì)胞的遷移同樣受到明顯抑制（P＜0.05）。

圖2 Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果 倒置相差顯微鏡 × 200Fig 2 The results of Transwell assay inverted phase contrast microscope × 200

圖3 不同濃度PQQ對(duì)CAL27細(xì)胞侵襲能力的影響Fig 3 Effect of PQQ at different concentrations on invasiveness of CAL27cells

圖4 不同濃度PQQ對(duì)CAL27細(xì)胞遷移能力的影響Fig 4 Effect of PQQ at different concentrations on migration of CAL-27cells

圖5 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果 倒置相差顯微鏡 × 40Fig 5 The results of wound healing test inverted phase contrast microscope × 40

2.3 PQQ對(duì)CAL27細(xì)胞內(nèi)ROS表達(dá)的影響

電子熒光顯微鏡下CAL27細(xì)胞內(nèi)ROS的表達(dá)見圖6。0、1、2、4 μmol·L-1的PQQ分別作用細(xì)胞24 h后，各組的平均熒光強(qiáng)度分別為3.80±0.57、15.90±4.13、55.00±6.16、88.10±4.61。與空白對(duì)照組比較，2μmol·L-1PQQ作用細(xì)胞24 h后，CAL27細(xì)胞內(nèi)平均熒光強(qiáng)度顯著增強(qiáng)，提示2μmol·L-1PQQ即可有效地誘導(dǎo)CAL27細(xì)胞內(nèi)ROS的產(chǎn)生（P＜0.001）。

圖6 不同濃度PQQ誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)ROS的產(chǎn)生狀況 電子熒光顯微鏡 × 200Fig 6 Production of intracellular ROS induced by PQQ at different concentrations electron fl uorescence microscope × 200

2.4 ROS清除劑NAC對(duì)PQQ調(diào)控EMT相關(guān)蛋白和NF-κB蛋白表達(dá)的影響

Western blot法檢測(cè)PQQ和NAC對(duì)CAL27細(xì)胞表達(dá)EMT相關(guān)蛋白和NF-κB通路蛋白的作用結(jié)果見圖7、8。與空白對(duì)照組比較，2μmol·L-1PQQ作用CAL27細(xì)胞24 h，上皮標(biāo)志蛋白E-cadherin表達(dá)上調(diào)，間質(zhì)標(biāo)志蛋白Vimentin表達(dá)下調(diào)，轉(zhuǎn)錄因子Snail表達(dá)下調(diào)，NF-κB通路活化水平受抑制，以上差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001）。PQQ組與PQQ+NAC組比較，PQQ+NAC組E-cadherin表達(dá)降低，而Vimentin、Snail表達(dá)上升，NF-κB活化水平也升高。該結(jié)果提示，經(jīng)NAC作用后，PQQ原本上調(diào)E-cadherin的作用減弱，下調(diào)Vimentin和Snail的作用也減弱，類似的，原本抑制NF-κB通路活化水平的作用也減弱（P＜0.01）。

2.5 NF-κB激動(dòng)劑PMA對(duì)PQQ調(diào)控EMT相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

Western blot法檢測(cè)PQQ和PMA對(duì)CAL27細(xì)胞表達(dá)EMT相關(guān)蛋白的結(jié)果見圖9、10。與空白對(duì)照組比較，PQQ組E-cadherin表達(dá)上調(diào)，Vimentin和Snail表達(dá)下調(diào)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001）。PQQ組與PQQ+PMA組比較，PQQ+PMA組E-cadherin表達(dá)降低，而Vimentin、Snail表達(dá)上升，提示PMA作用后，PQQ原本上調(diào)E-cadherin的作用減弱，下調(diào)Vimentin和Snail的作用也減弱（P＜0.05）。

圖7 PQQ和NAC作用下，CAL27細(xì)胞中EMT相關(guān)蛋白和NF-κB表達(dá)的Western blot電泳圖Fig 7 Under the treatment of PQQ and NAC, Western blot results of EMT-related proteins and NF-κB expression in CAL27cells

圖8 PQQ和NAC作用下，CAL27細(xì)胞中EMT相關(guān)蛋白和NF-κB表達(dá)的統(tǒng)計(jì)圖Fig 8 Under the treatment of PQQ and NAC, statistical results of EMT-related proteins and NF-κB expression in CAL27cells

圖9 PQQ和PMA作用下，CAL27細(xì)胞中EMT相關(guān)蛋白表達(dá)的Western blot電泳圖Fig 9 Under the treatment of PQQ and PMA, Western blot results of EMT-related proteins expression in CAL27cells

3 討論

PQQ在動(dòng)物、植物以及人體組織中廣泛存在，是一種重要的維生素類物質(zhì)。目前的研究主要集中在PQQ作為心臟和神經(jīng)保護(hù)劑[3]以及對(duì)造血系統(tǒng)的放射防護(hù)作用等方面[6]。在腫瘤研究方面，PQQ已經(jīng)證實(shí)對(duì)胰腺癌、惡性黑色素瘤等惡性腫瘤有明顯的抑制作用[7-8]，但是關(guān)于PQQ對(duì)TSCC的侵襲和轉(zhuǎn)移的報(bào)道尚不多見，也未見相關(guān)機(jī)制的闡述。本研究以TSCC細(xì)胞株CAL27為研究對(duì)象，探討PQQ的作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，隨著PQQ作用濃度的增加，CAL27細(xì)胞增殖能被有效抑制，且PQQ處理后，CAL27細(xì)胞的侵襲和遷移能力均受到抑制。此外，本研究還發(fā)現(xiàn)，PQQ能夠調(diào)控EMT相關(guān)蛋白的表達(dá)，包括上調(diào)上皮標(biāo)志蛋白E-cadherin，下調(diào)間質(zhì)標(biāo)志蛋白Vimentin和鋅指轉(zhuǎn)錄因子Snail的表達(dá)，提示PQQ能抑制TSCC的EMT進(jìn)程。

圖10 PQQ和PMA作用下，CAL27細(xì)胞中EMT相關(guān)蛋白表達(dá)的統(tǒng)計(jì)圖Fig 10 Under the treatment of PQQ and PMA, statistical results of EMT-related proteins expression in CAL27cells

ROS與腫瘤的關(guān)系存在兩面性。一方面，低水平的ROS能增加細(xì)胞基因的不穩(wěn)定性，最終誘導(dǎo)腫瘤的發(fā)生和發(fā)展[9]；另一方面，急性、高水平的ROS能夠損傷腫瘤細(xì)胞的DNA，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。腫瘤細(xì)胞自身抗氧化損傷防御系統(tǒng)缺陷和對(duì)ROS存在易感性均提示ROS在殺傷腫瘤方面具有積極的一面[10]。研究[11]表明，PQQ具有良好的抗腫瘤作用與其能誘導(dǎo)癌細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生ROS有關(guān)，升高的ROS能有效殺傷癌細(xì)胞。本研究亦發(fā)現(xiàn)，TSCC經(jīng)PQQ的作用可以有效誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞內(nèi)的ROS產(chǎn)生，而升高的ROS能夠打破腫瘤細(xì)胞內(nèi)的氧化還原平衡，調(diào)控其下游相關(guān)信號(hào)分子。NF-κB通路作為與腫瘤相關(guān)的細(xì)胞因子，廣泛參與腫瘤的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移等[12-13]。研究[14]證實(shí)，NF-κB核轉(zhuǎn)位水平的升高，能促進(jìn)非小細(xì)胞肺癌、胰腺癌等腫瘤的EMT進(jìn)程，促進(jìn)腫瘤的發(fā)展。目前，關(guān)于ROS與NF-κB通路的關(guān)系存在一定的分歧。Wu等[15]的研究發(fā)現(xiàn)，ROS水平升高能夠促進(jìn)NF-κB通路的活化水平；而Shanmugam等[16]則證實(shí)，二甲氨基小白菊內(nèi)酯可誘導(dǎo)胰腺癌細(xì)胞內(nèi)ROS的產(chǎn)生，抑制NF-κB通路的活化水平。本研究在用ROS清除劑NAC處理CAL27細(xì)胞后發(fā)現(xiàn)，NAC+PQQ組與PQQ單獨(dú)處理組比較，PQQ原本上調(diào)上皮標(biāo)志蛋白E-cadherin的作用減弱，下調(diào)間質(zhì)標(biāo)志蛋白Vimentin和鋅指轉(zhuǎn)錄因子Snail的作用也減弱，原本抑制NF-κB通路活化水平的作用同樣也減弱。該結(jié)果提示PQQ產(chǎn)生的ROS能抑制TSCC細(xì)胞的EMT進(jìn)程，其產(chǎn)生的ROS可能通過抑制NF-κB通路的活性發(fā)揮抗癌作用。進(jìn)一步應(yīng)用NF-κB激動(dòng)劑PMA觀察PQQ的作用，經(jīng)PMA處理后，原本PQQ上調(diào)上皮標(biāo)志蛋白E-cadherin的作用減弱，下調(diào)間質(zhì)標(biāo)志蛋白Vimentin和鋅指轉(zhuǎn)錄因子Snail的表達(dá)也減弱，說明PQQ可通過抑制NF-κB通路的活化水平進(jìn)而達(dá)到抑制TSCC細(xì)胞EMT的作用。

綜上所述，PQQ可以誘導(dǎo)TSCC細(xì)胞提高ROS的表達(dá)水平，其產(chǎn)生的ROS可通過下調(diào)NF-κB通路的活化水平而達(dá)到抑制TSCC細(xì)胞EMT進(jìn)程的效果，該結(jié)果為PQQ逆轉(zhuǎn)TSCC細(xì)胞的EMT進(jìn)程提供了理論依據(jù)。因?yàn)镽OS水平對(duì)腫瘤的作用效果存在兩面性，如何調(diào)控PQQ誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞內(nèi)ROS水平，積極利用ROS有益的一面仍是今后需要深入探討的方向。