老年大鼠肝臟和腸道自噬水平的變化及其在衰老相關(guān)炎癥中的作用

晁欣，何玉廷，李希，任衛(wèi)英

復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院老年病科，上海200032

炎性衰老是衰老的生物學(xué)標(biāo)志之一，它是指衰老生物體的細(xì)胞和組織中具有較高的炎性標(biāo)志物，從而導(dǎo)致低度慢性無(wú)菌的促炎狀態(tài)[1]。自噬有助于提高免疫效應(yīng)體對(duì)病原體的識(shí)別的功能，同時(shí)減輕炎癥反應(yīng)[2]。肝臟和腸道來(lái)源于同一胚層，肝臟是免疫反應(yīng)的重要器官，腸道因其免疫和營(yíng)養(yǎng)攝入功能，一直被認(rèn)為是介導(dǎo)機(jī)體延長(zhǎng)壽命的重要靶器官[3]。目前對(duì)于肝臟和腸道炎性衰老的機(jī)制還不清楚。本研究旨在通過觀察自噬相關(guān)蛋白和促炎因子在老年大鼠肝臟和不同部位腸道（回腸、結(jié)腸）組織中的表達(dá)變化，研究自噬與炎癥之間的關(guān)系，進(jìn)一步闡明自噬在肝臟與腸道炎性衰老中的作用。

1 材料與方法

1.1.1 主要試劑 Trizol 裂解液（Sigama，美國(guó)），RNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（Takara，日本），PCR 96 孔板（Corning，美國(guó)），SDS-PAGE 凝膠配制試劑盒（碧云天，中國(guó)），GAPDH 一抗（Proteintech，中國(guó)），LC3、P62 一抗（Cell Signaling Technology，美國(guó)），ZO-1、Occludin一抗（Abcam，美國(guó)），蘇木素、伊紅（Sigama，美國(guó)）。

1.1.2 主要儀器 純水儀（Millipore，美國(guó)），PCR 擴(kuò)增儀（ProFlex，美國(guó)）。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和標(biāo)本獲取SPF 級(jí)雄性Wistar大鼠購(gòu)買自上海西普爾必凱實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，8 只12月齡大鼠自2017年9月1日購(gòu)買之日起在復(fù)旦大學(xué)上海醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心繼續(xù)飼養(yǎng)至2019年1月31日，達(dá)到29月齡（老年組），另取8 只3月齡大鼠作為對(duì)照組（成年組）。飼養(yǎng)環(huán)境為濕度40%和8h 照明的無(wú)菌環(huán)境，自由飲用蒸餾水和標(biāo)準(zhǔn)嚙齒動(dòng)物飼料。每周觀察記錄大鼠飲食飲水及生長(zhǎng)情況，采取0.5%的戊巴比妥鈉0.7g/mL 腹腔麻醉后處死實(shí)驗(yàn)大鼠，解剖取材符合相關(guān)動(dòng)物倫理委員會(huì)規(guī)定。用高溫高壓消毒滅菌過的器械快速取部分肝左葉迅速放入凍存管再置于液氮罐中，再取一部分1.5×1×1cm 的肝左葉于3.5mL 4%多聚甲醛中固定；取大鼠回腸末端和結(jié)腸中段3cm于凍存管置于液氮罐暫存，再快速取回腸末端和結(jié)腸中段1.5×1×0.5cm 于4%多聚甲醛中固定。

1.3 肝臟、回腸和結(jié)腸組織形態(tài)學(xué)分析 各組織標(biāo)本經(jīng)過4%多聚甲醛固定24h后進(jìn)行脫水石蠟包埋切取4m 組織切片進(jìn)行蘇木精和伊紅(HE) 染色，在光鏡下進(jìn)行病理學(xué)觀察。

1.4 Western Blot 檢測(cè)肝臟和腸道組織中自噬相關(guān)蛋白LC3II、P62 及炎性小體NLRP3 表達(dá) 用高溫高壓消毒過且4℃預(yù)冷的器械剪取20mg 組織標(biāo)本快速放入配置好的RIPA 裂解液中，勻漿后冰上靜置1.5h，離心后提取上清蛋白，BCA 蛋白定量。配置12%的膠，等質(zhì)量等濃度等體積上樣，電泳恒壓80V 跑膠至溴酚藍(lán)指示線見底，轉(zhuǎn)膜電流30mA，1.5h 濕轉(zhuǎn)，10%脫脂牛奶封閉2 h，1∶1 000 的稀釋比例稀釋一抗GAPDH、P62、LC3II 和NLRP3，4℃搖床（慢）孵育過夜，1×TBST 清洗3 次后孵育二抗1h，1×TBST 清洗3 次，曝光機(jī)前顯影，用Image pro plus 測(cè)量條帶灰度值并用目的基因灰度值比內(nèi)參GAPDH。

1.5 qRT-PCR檢測(cè)肝臟和腸道組織中促炎因子TNF- 、IL-6、IL-1 和MMP-9 mRNA 的表達(dá) 按標(biāo)準(zhǔn)操作提取各組織標(biāo)本RNA（所有過程均置冰且無(wú)酶操作）并測(cè)濃度，逆轉(zhuǎn)錄后實(shí)時(shí)定量PCR：95℃變性60sec 后進(jìn)入PCR 擴(kuò)增循環(huán)，具體參數(shù)為95℃，15sec；60℃，60sec，72℃，45sec×40 個(gè)循環(huán)。擴(kuò)增結(jié)果采用實(shí)時(shí)定量PCR 分析程序測(cè)CT 值，計(jì)算2-△△ct 值，基因序列見表1。

表1 引物序列表

1.6 免疫組化檢測(cè)回腸和結(jié)腸組織中Occludin、ZO-1蛋白的表達(dá)水平 組織經(jīng)固定、脫水、石蠟包埋、切片（4m）、貼片，脫蠟至水，抗原修復(fù)20min，緩慢冷卻至室溫，3%雙氧水37℃孵育10min，室溫封閉1h，滴加一抗，4℃過夜，滴加二抗，室溫孵育1h，顯色、復(fù)染、鹽酸乙醇分化、封片。每張切片各選取6 個(gè)視野，計(jì)算面密度（累計(jì)光密度/組織像素面積），areal density=IOD/AREA。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 21.0 統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較應(yīng)用獨(dú)立樣本 檢驗(yàn)，＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.結(jié)果

2.1 老年大鼠肝臟、回腸和結(jié)腸的組織形態(tài)病理學(xué)改變

2.1.1 肝臟隨增齡組織病理學(xué)改變 成年大鼠肝小葉結(jié)構(gòu)清晰，肝索排列整齊，肝匯管區(qū)正常，胞核大小正常；老年大鼠肝臟出現(xiàn)明顯脂肪變，肝細(xì)胞出現(xiàn)較多脂滴和脂肪空泡，肝匯管區(qū)有膽管增生并伴有炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，見圖1。

2.1.2 回腸與結(jié)腸隨增齡組織病理學(xué)改變 回腸HE 染色病理學(xué)分析顯示成年大鼠黏膜層腸上皮結(jié)構(gòu)完整，單層柱狀上皮細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)正常、排列緊密；固有層腸腺豐富，老年大鼠黏膜層局部可見上皮細(xì)胞脫落，固有層腸腺數(shù)量減少，結(jié)締組織增生并伴有少量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)且下肌層增厚明顯，見圖2。

2.2 老年大鼠肝臟和腸道組織中自噬相關(guān)蛋白LC3、P62表達(dá)的變化Western Blot 結(jié)果顯示，與成年組大鼠相比，老年組大鼠肝臟LC3II 蛋白表達(dá)下降（＜0.01），P62 蛋白表達(dá)上升(＜0.01)，見圖3?；啬c和結(jié)腸LC3II蛋白表達(dá)較成年組下降（＜0.05），P62 蛋白表達(dá)較成年組增加（＜0.01），見圖4和圖5。

圖1 兩組大鼠肝組織的病理學(xué)改變（HE 染色）。

圖2 兩組大鼠的回腸和結(jié)腸組織病理改變（HE 染色）。

2.3 老年大鼠肝臟和腸道組織中促炎因子的表達(dá)變化qRT-PCR 檢測(cè)結(jié)果顯示，與成年組相比，老年組大鼠肝臟促炎因子白細(xì)胞介素-1 (interleukin-1 )，腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor- ，TNF- ），白介素6（interleukin-6），基質(zhì)金屬蛋白酶9（MMP-9）的表達(dá)水平增加（＜0.05），見圖6?；啬c中MMP-9，IL-1表達(dá)增加（＜0.01），IL-6，TNF- 表達(dá)增加（＜0.01），見圖7。結(jié)腸中IL-6，IL-1 ，TNF- 表達(dá)增加（＜0.01），MMP-9 表達(dá)增加（＜0.05），見圖8。IL-1 在老年大鼠和成年大鼠肝臟與腸道中的表達(dá)差相較于其他促炎

圖3 兩組大鼠肝臟自噬相關(guān)蛋白LC3，P62 表達(dá),**<0.01。

圖4 兩組大鼠回腸組織自噬相關(guān)蛋白LC3,P62 的表達(dá)，*<0.05,**<0.01。

圖5 兩組大鼠結(jié)腸自噬相關(guān)蛋白LC3,P62 的表達(dá),<0.05,**<0.01。

圖6 兩組大鼠肝臟促炎因子mRNA 的表達(dá),**<0.05,**<0.01。

圖7 兩組大鼠回腸組織中各促炎因子的mRNA 表達(dá)mRNA 表達(dá)*<0.05，**<0.01。

圖8 兩組大鼠結(jié)腸組織中各促炎因子的mRNA 表達(dá)*<0.05。

2.4 老年大鼠肝臟和回腸、結(jié)腸中NLRP3 蛋白的表達(dá)變化 Western Blot 結(jié)果顯示，與成年組大鼠相比，老年組大鼠肝臟NLRP3 蛋白表達(dá)增加（<0.05），見圖9。老年組大鼠回腸和結(jié)腸NLRP3 蛋白表達(dá)增加（<0.01），見圖10 和圖11，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖9 兩組大鼠肝臟炎性小體NLRP3 蛋白的表達(dá)（*<0.05）。

圖10 兩組大鼠結(jié)腸炎性小體NLRP3 蛋白達(dá)（**<0.01）。

圖11 兩組大鼠結(jié)腸炎性小體NLRP3 蛋白的表達(dá)（**<0.01）。

2.5 老年大鼠回腸和結(jié)腸中緊密連接蛋白Occludin 和ZO-1 的表達(dá)變化 免疫組化結(jié)果顯示：與成年組對(duì)比，老年大鼠回腸中 Occludin, ZO-1 表達(dá)下降（<0.01），老年大鼠結(jié)腸中Occludin, ZO-1 表達(dá)下降（<0.05），表明大鼠衰老過程中腸道緊密連接蛋白減少，腸道屏障功能障礙，見圖12。

3 討論

炎性衰老是指衰老過程中伴隨的低度炎癥反應(yīng)狀態(tài)[4]，肝臟的始基由前腸胚層發(fā)育而來(lái)[5]，肝臟的衰老又加速了肝臟相關(guān)疾病的進(jìn)程[6]。病理學(xué)結(jié)果分析得知肝臟有炎性細(xì)胞浸潤(rùn)且出現(xiàn)脂肪變，符合肝臟衰老的組織學(xué)表現(xiàn)，且腸道組織病理學(xué)結(jié)果顯示腸道固有層腸腺萎縮，有炎癥細(xì)胞灶性浸潤(rùn)，提示腸道整體呈現(xiàn)出萎縮衰老狀態(tài)。

自噬涉及多種如發(fā)育，細(xì)胞分化，對(duì)病原體的防御和營(yíng)養(yǎng)饑餓等生物學(xué)功能[7]。在自噬過程中，胞質(zhì)形式的LC3（LC3-I）與磷脂酰乙醇胺偶聯(lián)，形成具有膜結(jié)合能力LC3-II，隨后募集到自噬體膜上[8]，自噬底物P62 也可反應(yīng)自噬活性[9]。自噬流受阻伴隨著p62 的積累。本次研究發(fā)現(xiàn)：29月齡Wistar 大鼠的肝臟、回腸和結(jié)腸組織中的LC3II 蛋白相較于成年組表達(dá)下降，P62 表達(dá)增高，表明老年大鼠肝臟和不同腸段自噬水平下降，同時(shí)發(fā)現(xiàn)，29月齡老年大鼠肝臟，回腸和結(jié)腸中的多種促炎因子（IL-6、IL-1 、TNF-、MMP-9）基因表達(dá)相較組升成年組增高，提示肝臟和腸道存在慢性炎癥狀態(tài)，并且反應(yīng)了炎性衰老的系統(tǒng)性特點(diǎn)。根據(jù)前期研究，自噬通過至少兩種方式來(lái)保護(hù)細(xì)胞免受過度持久的炎癥影響：（1）通過允許有效清除受損的細(xì)胞器（例如線粒體）或細(xì)胞內(nèi)病原性微生物（它們都構(gòu)成有效的炎癥刺激）而間接清除；護(hù)細(xì)胞免受過度持久的炎癥影響：（1）通過允許有效清除受損的細(xì)胞器（例如線粒體）或細(xì)胞內(nèi)病原性微生物（它們都構(gòu)成有效的炎癥刺激）而間接清除；以及（2）通過抑制促炎復(fù)合物[10]。另外，炎性小體的活化也參與了肝臟的衰老[11]。

圖12 兩組大鼠回腸與結(jié)腸中腸道緊密連接蛋白Occludin，ZO-1 的表達(dá)（A、B、E、F:Occludin 蛋白；C、D、G、H：ZO-1 蛋白；I：回腸中Occludin 蛋白表達(dá)；J：回腸中ZO-1 蛋白表達(dá)；K:結(jié)腸中Occludin 蛋白表達(dá)；L:結(jié)腸中ZO-1 蛋白表達(dá)變化；*<0.05,**<0.01。

自噬不僅維持細(xì)胞器的穩(wěn)態(tài)，而且參與線粒體的穩(wěn)態(tài)。自噬水平下降，線粒體損傷不斷累積，導(dǎo)致線粒體進(jìn)行性解偶聯(lián)，從而導(dǎo)致生物能不足和活性氧（ROS）產(chǎn)生增加[12]。腸道與肝臟均是線粒體最活躍的組織之一，自噬水平下調(diào)影響了ROS，ROS 可直接激活NLRP3 受體，還可通過引發(fā)硫氧還蛋白互作蛋白（Thioredoxin interacting protein，TXNIP）構(gòu)象變化間接活化NLRP3 炎性小體[13]。而炎性小體NLRP3能夠識(shí)別多種病原相關(guān)分子模式，當(dāng)其激活后，進(jìn)而激活caspase-1，切割pro-IL-1 和pro-IL-18 形成成熟形式而發(fā)揮作用[14]。巨噬細(xì)胞中的NLRP3 炎性小體活化后分泌IL-1 和IL-18 來(lái)促進(jìn)嗜中性粒細(xì)胞趨化[15]，IL-1 釋放后加強(qiáng)NF-KB 的活化[16]，NF-KB 進(jìn)入細(xì)胞核調(diào)節(jié)促炎的基因如IL-1，IL-6 和TNF- 等的表達(dá)。因此結(jié)合本次研究結(jié)果可以推測(cè)，在肝臟與腸道衰老過程中，自噬清除能力下降，功能失調(diào)的線粒體和蛋白積累，導(dǎo)致活性氧產(chǎn)物增加和氧化應(yīng)激反應(yīng)；炎性小體NLRP3 被激活，引發(fā)肝臟與腸道的炎癥級(jí)鏈反應(yīng)，導(dǎo)致肝腸促炎相關(guān)因子增加。

此外，本研究還發(fā)現(xiàn)，29月齡大鼠回腸和結(jié)腸腸道緊密連接蛋白Occludin，ZO-1 相較成年均降低。腸道形態(tài)學(xué)病理分析結(jié)果提示腸道組織退行性變，炎癥反應(yīng)增加，對(duì)腸道穩(wěn)態(tài)的維持起到負(fù)面調(diào)控。腸屏障是構(gòu)成抵抗外部環(huán)境的最重要屏障的一層[17]，最新研究發(fā)現(xiàn)，自噬可通過TJ 蛋白claudin-2 的溶酶體降解選擇性地降低離子和小分子的上皮TJ 滲透性[18]。自噬功能下降，ROS 增加，炎癥小體被激活，促炎與抗炎反應(yīng)失衡，形成腸道的慢性炎癥狀態(tài)；而腸道慢性炎癥狀態(tài)又加速衰老，呈惡性交互作用，可致腸道穩(wěn)態(tài)失衡，進(jìn)而影響腸道通透性以及肝臟參與的全身代謝反應(yīng)。

綜上所述，自噬可能參與肝臟和腸道的衰老并在其炎性衰老中起到重要作用，但相關(guān)作用機(jī)制有待進(jìn)一步研究。既往研究顯示二甲雙胍可通過多種信號(hào)通路如AMPK 激活自噬，改善炎癥反應(yīng)。自噬的激活劑還包括雷帕霉素，白藜蘆醇等[19]。后續(xù)將在細(xì)胞和動(dòng)物水平通過靶向藥物干預(yù)進(jìn)一步探討自噬與炎癥的對(duì)話機(jī)制。