應(yīng)用熒光定量PCR技術(shù)檢測小兒尿液中人巨細(xì)胞病毒

袁成立

【中圖分類號】R821.4+2 ? ? ? 【文獻標(biāo)識碼】B ? ? 【文章編號】2095-6851（2020）06-069-01

巨細(xì)胞病毒（CMV）感染主要源自于人巨細(xì)胞病毒（HCMV） ，具有較強易感性，可在任意季節(jié)肆意增殖，臨床研究表明該病成人感染率高達95%，而大部分患者感染該病后無明顯癥狀表現(xiàn)，病毒潛伏期較長。而一旦感染體免疫功能弱化，則可直接激活潛伏病毒，導(dǎo)致靶器官傷損傷，情況嚴(yán)重下可致死。

巨細(xì)胞病毒的主要靶器官主要針對肝臟、呼吸系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)以及血液系統(tǒng)。由于兒童（包括嬰兒、新生兒）的抵抗力、免疫力較低，感染風(fēng)險較高，臨床癥狀主要表現(xiàn)為黃疸、溶血性貧血或智力低下等，可致畸、致殘甚至致死。新生兒感染CMV的主要因素及途徑是HCMV母嬰傳播，HCMV可直接穿透胎盤而造成感染。有研究指出，孕婦CMV若為非活動性感染，則發(fā)生垂直傳導(dǎo)傳播的風(fēng)險較低，因此CMV DNA陽性不可作為終止妊娠的獨立危險證據(jù)。若病毒DNA含量少，幾乎不影響正常妊娠。而對此現(xiàn)階段隨著特異性抗CMV病毒更昔洛韋等藥物的廣泛應(yīng)用，如何早期、迅速且精確診斷CMV感染，是檢測CMV感染程度及動態(tài)，開展合理治療與評估療效、預(yù)后的關(guān)鍵依據(jù)。

現(xiàn)階段診斷HCMN感染的金標(biāo)準(zhǔn)主要是病原體分離，而因分離技術(shù)條件較差且分離時間較長，臨床實驗室內(nèi)難以廣泛應(yīng)用。近年多使用血清學(xué)及分子生物學(xué)等方法輔助診斷HCMN感染。但結(jié)合上文所述，新生兒的HCMV-IgG抗體表達嬰兒后期經(jīng)胎盤獲取的母體抗體，最多只能存在約18個月，因此也無法作為診斷兒童HCMV感染的唯一依據(jù)。而經(jīng)IgM試驗假陽性與假陰性過于一致，加之兒童的體液免疫系統(tǒng)尚未完善，免疫應(yīng)答有效性存在一定局限性，因此血清學(xué)方法不宜適用于檢查診斷HCMN感染。

EISA是現(xiàn)階段臨床應(yīng)用率較高的檢測技術(shù)之一，采用EISA法檢測CMVIgM抗體是臨床診斷活動性CMV的關(guān)鍵指標(biāo)，主要出現(xiàn)于感染后3～5d，持續(xù)發(fā)展3～6個月，大多表示為近期活動性感染;若為IgM陰性，推斷可能原因為處于感染初期，尚不具抗體或感染后抗體完全消失。而IgM陽性并不是診斷原發(fā)性感染的金標(biāo)準(zhǔn)，無法作為診斷CMV的唯一證據(jù)。由于風(fēng)濕因子，以往遺留感染及皰疹病毒產(chǎn)生交叉反應(yīng)，均可造成假陽性，且無法作為評估藥物療效與患者預(yù)后狀況的定性、定量指標(biāo)。

而FQ-PCR可迅速且定量檢測CMV DNA，該技術(shù)基于熒光信號檢測PCR產(chǎn)物，其不僅顯著提升靈敏度，同時具有PCR循環(huán)一次即可采集一個數(shù)據(jù)的優(yōu)勢，實時構(gòu)建增發(fā)曲線，精確明確CT值，進而憑借該CT值明確始末的DNA拷貝指數(shù)。相較于常規(guī)PCR，其優(yōu)勢在于特異性強、靈敏度高、定量精確、設(shè)備線上實檢測、結(jié)果簡易可視化等，可防止醫(yī)師主觀判斷，檢測重復(fù)性較好，自動化可操控性較高，此外有效規(guī)避了PCR污染問題。其靈敏度是每個反應(yīng)體系的100個病毒粒子，大于常規(guī)PCR檢測敏感性約1±0.5個數(shù)量級，且檢測的有效線性范圍得到拓寬，可動態(tài)檢測體內(nèi)CMV。其主要根據(jù)基因擴增數(shù)量及趨勢，作為病情、預(yù)后評估的實質(zhì)性依據(jù)，可精確反映所用藥物是否對病原體濃度的變化產(chǎn)生影響，有助于評估藥效，為后續(xù)用藥方案的制定提供實質(zhì)性的參考。

CMV侵入管道上皮細(xì)胞的風(fēng)險較高，尤其是腎臟、肝膽系統(tǒng)。病毒集中于腎小管，CMV主要在腎小球、腎小管上皮細(xì)胞內(nèi)繁殖，經(jīng)尿液排出。由于尿液具有較強的濃縮功能，因而尿液中病毒含量通常較高。其次HCMN可在細(xì)胞內(nèi)發(fā)生和發(fā)展，而血液中僅可釋放少量病毒，加之檢測方法存在一定局限性，其檢出病毒含量較少，很大程度上是造成FQ-PCR血液標(biāo)本陽性率較低的關(guān)鍵因素。因而可借助尿液檢測CMV DNA，檢出陽性率較高。加之采集兒童尿液的便捷性優(yōu)于血液，后期藥物治療、隨訪中均可采集標(biāo)本實現(xiàn)持續(xù)性檢測，有利于提升檢測動態(tài)結(jié)果的實效性。而目前臨床已有大量研究證實，檢測尿CMVDNA可為診斷嬰幼兒CMV感染提供實質(zhì)性的輔助。

臨床有相關(guān)研究對75例臨床疑似患有HCMV活動性感染患兒的血、尿標(biāo)本中，檢出尿液HCMV陽性57例，檢出率高達達77.33%，高于常規(guī)pp65抗原檢測的64.22%，由此可見FQ- PCR檢測HCMV的敏感性、精確性明顯高于常規(guī)pp65抗原血癥檢測。而兩項檢測結(jié)果的一致性高達（86.78%），因此可表明，尿液中檢出高濃度的HCMV可作為有效提示體內(nèi)病毒活躍程度的關(guān)鍵依據(jù)。而該項實驗中，兩種檢測方法均檢出3例陽性標(biāo)本，本文結(jié)合以上論述，推斷原因可能在于各個群體宿主免疫狀態(tài)的差異、HCMV潛伏后重新激活感染的病理表現(xiàn)、癥狀表現(xiàn)均具有一定差異等?？紤]到HCMV感染的臨床表現(xiàn)較為綜合、復(fù)雜，因而臨床上務(wù)必綜合判斷分析各指征，保證及時、精確、合理診斷HCMV的發(fā)生、發(fā)展與分化。

總的來說，將尿液作為臨床檢測小兒HCMV感染的一線標(biāo)本，具有取材便捷、前期預(yù)處理便捷、結(jié)果敏感性高等優(yōu)點，對臨床及時診斷CMV感染與療效評估具有實質(zhì)性的輔助價值，且一定程度上有助于改善妊娠結(jié)局，防止分娩畸形兒，切實保障母嬰健康。而對CMV DNA的檢測而言，將作為診斷CMV感染繼續(xù)以標(biāo)準(zhǔn)化、多元化優(yōu)創(chuàng)新創(chuàng)效發(fā)展的引領(lǐng)方向。