PDR行玻璃體手術(shù)前注射雷珠單抗或曲安奈德后玻璃體腔內(nèi)細(xì)胞因子的變化

王新婷,李甦雁,范 巍,李 婕,馮瑞芳,張正培,季蘇娟

0引言

增生型糖尿病視網(wǎng)膜病變(proliferative diabetic retinopathy，PDR)是糖尿病重要的微血管并發(fā)癥之一，也是造成視力損傷的主要致盲眼病。玻璃體切割術(shù)(pars plana vitrectomy，PPV)是目前治療嚴(yán)重PDR的主要方法，但由于新生血管膜以及視網(wǎng)膜前增殖膜與視網(wǎng)膜的連接較為緊密，剝離困難，術(shù)中活動(dòng)性出血和醫(yī)源性裂孔增加了手術(shù)難度，嚴(yán)重影響手術(shù)療效。近年來研究發(fā)現(xiàn)，抗VEGF藥物能夠降低眼內(nèi)VEGF的表達(dá)，不僅能抑制新生血管形成，而且還可以促進(jìn)已形成的新生血管消退，從而減輕新生血管滲漏、加快出血吸收[1-2]。雷珠單抗是一種人源化抗VEGF Fab 段單克隆抗體，具有相對(duì)分子質(zhì)量小、易穿透視網(wǎng)膜和生物利用率高等特點(diǎn)，能夠非特異性的結(jié)合多個(gè)具有生物學(xué)活性的VEGF-A異構(gòu)體，通過降低VEGF的表達(dá)，從而減低血管的通透性并抑制病理性新生血管產(chǎn)生，玻璃體腔注射抗VEGF藥物作為PDR玻璃體切割手術(shù)前的輔助治療，能有效降低手術(shù)中及手術(shù)后并發(fā)癥[1]。曲安奈德(TA)屬于非水溶性含氟長效糖皮質(zhì)激素，局部用藥吸收較為緩慢，具有較強(qiáng)的抗炎作用，能夠減輕細(xì)胞的免疫反應(yīng)，從而降低血管通透性、減少異常新生血管的增加，TA具有抑制炎癥因子和血管生成因子的雙重作用，玻璃體腔注射糖皮質(zhì)激素也在PDR的治療中表現(xiàn)出了較好的抗炎、抑制細(xì)胞增生的效果，TA作為玻璃體手術(shù)中的染色劑已經(jīng)廣泛應(yīng)用于臨床，也有少數(shù)學(xué)者將其作為PDR玻璃體切割術(shù)前的輔助用藥取得較好的療效[3-4]。盡管雷珠單抗和TA都可作為PDR患者術(shù)前的輔助藥物，但二者作用機(jī)制并不完全相同，既往研究發(fā)現(xiàn)，PDR患者玻璃體腔中多種細(xì)胞因子，如單核細(xì)胞趨化蛋白1(MCP-1)、單核細(xì)胞趨化蛋白3(MCP-3)、白介素-6(IL-6)、胎盤生長因子(PIGF)、血小板源性生長因子-AB/BB(PDGF-AB/BB)及血管內(nèi)皮生長因子-A(VEGF-A)等水平明顯增加，提示以上因子在參與和推動(dòng)PDR發(fā)生發(fā)展中起重要作用[5-8]，這些細(xì)胞因子是否對(duì)雷珠單抗和曲安奈德的治療具有不同影響值得進(jìn)一步探究，因此我們進(jìn)行了一項(xiàng)前瞻性臨床研究，對(duì)比分析了PDR患者玻璃體手術(shù)前用雷珠單抗和曲安奈德預(yù)處理后各類細(xì)胞因子的變化，并且對(duì)術(shù)中出血情況進(jìn)行了比較。現(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

1對(duì)象和方法

1.1對(duì)象本研究為前瞻性研究，經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(批號(hào)：20140004)，患者均獲知情并簽署知情同意書。將2015-05/2017-02在我院確診的88例112眼PDR患者納入研究。采用ETDRS視力表對(duì)患者進(jìn)行最佳矯正視力(BCVA)檢查，行裂隙燈顯微鏡、間接檢眼鏡、眼壓、B超等相關(guān)輔助檢查。所有患者臨床表現(xiàn)均符合PDR國際臨床診斷標(biāo)準(zhǔn)[9]。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)大于18周歲的2型糖尿病患者, 自愿參與且可定期隨訪者；(2)確診為PDR，符合手術(shù)適應(yīng)證；(3)空腹血糖≤8mmol/mL，糖化血紅蛋白值≤8%；(4)除患糖尿病外全身情況良好，無手術(shù)禁忌證者。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)1型糖尿??；(2)內(nèi)眼手術(shù)史、外傷史以及伴其它各類視網(wǎng)膜疾病如ARMD、CRVO等；(3)B超或OCT顯示視網(wǎng)膜脫離累及黃斑區(qū)者；(4)血糖控制不佳、腎功能不全、心功能不全、腦梗、凝血功能障礙者。

1.2方法

1.2.1治療方法按照隨機(jī)數(shù)表法分為雷珠單抗組和曲安奈德組，采用推薦安全注射劑量雷株單抗0.5mg/0.05mL，曲安奈德4mg/0.1mL[4]。玻璃體腔注藥術(shù)：常規(guī)內(nèi)眼手術(shù)消毒鋪巾，表面麻醉后，自顳上角鞏膜緣后3.5mm用25G穿刺刀穿刺后放置trocar(套管針)，25G玻璃體切割頭抽取玻璃體液0.5mL，隨后向玻璃體腔注射雷珠單抗0.5mg/0.05mL或曲安奈德4mg/0.1mL，再向玻璃體腔內(nèi)注入BSS(平衡液)維持眼內(nèi)壓，拔出trocar后用棉簽按壓30～60s，觀察有無出血、切口滲漏，注藥后給予左氧氟沙星滴眼液預(yù)防感染。將抽取的玻璃體液放入無菌EP管進(jìn)行離心(溫度4℃，轉(zhuǎn)速3000r/min，10min)，-80℃冰箱保存。

玻璃體手術(shù)：兩組患者均于玻璃體腔注藥后7d行25G PPV手術(shù)，手術(shù)開始打開內(nèi)眼灌注前再次抽取玻璃體液0.5mL，離心后放-80℃冰箱保存。兩組患者手術(shù)均由同一位玻璃體手術(shù)經(jīng)驗(yàn)豐富的醫(yī)師完成。

1.2.2檢測方法(1)雙抗體酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)檢測：采用ELISA檢測玻璃體中PIGF的濃度。按照試劑盒說明書將標(biāo)準(zhǔn)品按照200、100、50、25、12.5、6.25、3.13、0pg/mL的不同濃度配置好后加入孔中，樣品孔中加入待測樣本玻璃體。通過加入一抗、孵育、洗滌等步驟，再加入底物試劑A、B后37℃恒溫培養(yǎng)箱中孵育15min加入終止液進(jìn)行終止。孵育10min之內(nèi)采用ELX808酶標(biāo)儀測定各孔450nm吸光度值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算樣品PIGF濃度；(2)液相芯片分析檢測：96孔板中每孔分別加入標(biāo)準(zhǔn)品緩沖液、質(zhì)控品以及患者玻璃體液后加入混勻稀釋好的微球，經(jīng)過室溫震蕩孵育、離心、洗滌微球，所有操作嚴(yán)格按照試劑說明書進(jìn)行，最終采用Luminex200多功能流式點(diǎn)陣儀測定樣品孔熒光強(qiáng)度中位值，使用5-parameters logistic方式計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)品曲線，通過MILLIPLEX Analyst.V5.1軟件計(jì)算樣品中MCP-1、MCP-3、PDGF-AB/BB、IL-6、IL-8和VEGF-A的濃度。陰性質(zhì)控品、陽性質(zhì)控品的檢測結(jié)果均在QC Range范圍之內(nèi)。(3)觀察兩組患者術(shù)中出血情況。

表1 兩組患者一般臨床資料比較

分組眼數(shù)年齡( x±s,歲)性別(男,%)糖尿病病程( x±s,a)糖化血紅蛋白( x±s,%)ETDRS字母數(shù)( x±s,個(gè))眼壓( x±s,mmHg)PDR分期(眼)ⅣⅤⅥ雷珠單抗治療組5753.78±9.6721(36.8)11.52±5.367.06 ± 0.7321.23±2.4614.90±3.0023223曲安奈德治療組5555.89±8.1226(47.3)12.98±7.387.14 ± 0.6425.42±4.3114.60±2.6823716 t/χ2/U-0.981.25-1.32-0.56-0.43-0.55-1.17P0.330.260.240.570.610.590.24

時(shí)間PIGFMCP-1MCP-3IL-6IL-8PDGF-AB/BBVEGF-A注藥前65.36±15.162652.36±112.838.03±3.1037.32±4.04111.723±21.328.33±6.85315.16±14.34注藥1wk后19.42±6.342831.21±101.237.73±4.2652.42±5.32198.73±19.037.65±7.8321.32±2.54t5.3240.5640.672-2.342-5.3210.6213.451P0.0010.3240.5010.003<0.0010.5730.001

時(shí)間PIGFMCP-1MCP-3IL-6IL-8PDGF-AB/BBVEGF-A注藥前74.28±17.342789.32±143.546.89±2.8841.34±10.37104.34±14.249.45±2.45362.65±89.35注藥1wk后136.12±15.342038.21±105.346.32±1.3961.32±13.64108.32±20.319.72±4.21351.35±82.34 t-2.8154.2360.872-1.782-3.211-0.063-2.342P0.0070.0010.7820.0630.8210.8710.980

根據(jù)術(shù)中出血程度分為：(1)無或輕度出血：術(shù)中無出血或者點(diǎn)狀出血且能夠在短時(shí)間內(nèi)自凝不影響手術(shù)操作，無需處理者；(2)中度出血：術(shù)中片狀出血，能自凝，但影響手術(shù)操作需要用玻璃體切割頭或笛針吸除；(3)重度出血：出血量較大，不能自行停止，影響手術(shù)視野，需要電凝止血。

2結(jié)果

2.1兩組患者基線資料比較本研究中共88例112眼，其中男47例59眼，女41例53眼；年齡31～73歲。雷珠單抗治療組43例57眼，曲安奈德治療組45例55眼。兩組患者年齡、性別、糖尿病病程、糖化血紅蛋白、視力、眼壓及PDR分期差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05，表1)，具有可比性。

2.2兩組患者玻璃體腔注藥前后玻璃體中細(xì)胞因子含量的比較兩組患者玻璃體腔注射藥物前后，玻璃體細(xì)胞因子PIGF、MCP-1、MCP-3、IL-6、IL-8、PDGF-AB/BB、VEGF-A濃度見表2、3。與注藥前比較，雷株單抗組注藥1wk后PIGF、VEGF-A表達(dá)明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=5.324、3.451，P=0.001)，而IL-6和IL-8表達(dá)顯著增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=-2.342、-5.321，P=0.003、P<0.001)；MCP-1、MCP-3和PDGF-AB/BB的表達(dá)在雷珠單抗玻璃體腔注射前后的玻璃體中無顯著改變，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=0.564、0.672、0.621，P=0.324、0.501、0.573)。

曲安奈德組，與注藥前比較，注藥1wk后MCP-1的表達(dá)明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=4.236，P=0.001)，同時(shí)PIGF的表達(dá)增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=-2.815，P=0.007)。而MCP-3、IL-6、IL-8和PDGF-AB/BB、VEGF-A細(xì)胞因子的表達(dá)在接受曲安奈德玻璃體腔注射前后無明顯變化，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=0.872、-1.782、-3.211、-0.063、-2.342，P=0.782、0.063、0.821、0.871、0.980)。

雷珠單抗組和曲安奈德組注藥1wk后，雷珠單抗組PIGF、VEGF-A的表達(dá)較曲安奈德組顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=-5.731、-4.443，P<0.001)，IL-8和MCP-1的表達(dá)較曲安奈德組增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=2.382、3.320，P=0.009、0.008)。IL-6、MCP-3和PDGF-AB/BB在兩組間無明顯改變，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=-0.872、1.762、-1.621，P=0.671、0.382、0.521)，見圖1。

圖1雷珠單抗組和曲安奈德組玻璃體腔內(nèi)細(xì)胞因子濃度變化A:PIGF; B:VEGF-A; C:IL-8; D:MCP-1。

圖2兩組患者手術(shù)中照片A:雷珠單抗組；B:曲安奈德組。

表4 兩組患者術(shù)中出血比較眼(%)

2.3兩組患者術(shù)中出血比較與曲安奈德組相比，雷株單抗組術(shù)中出血情況明顯低于曲安奈德組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(U=2.50，P=0.012)，見表4，圖2。

3討論

DR是一種病理過程較為復(fù)雜的病變，炎性細(xì)胞因子的釋放和VEGF的過度分泌在該過程中發(fā)揮重要作用[10-11]，且目前有研究觀察到玻璃體切割術(shù)前應(yīng)用糖皮質(zhì)激素或抗VEGF藥物均可有效增加手術(shù)安全性，減少術(shù)后并發(fā)癥的發(fā)生，術(shù)前玻璃體腔輔助藥物的應(yīng)用已逐漸成為主要治療手段[12-13]。

研究中我們發(fā)現(xiàn)玻璃體腔注射雷珠單抗后，VEGF-A、PIGF的水平顯著降低；玻璃體腔注射曲安奈德后，VEGF-A的水平較注射前并無明顯改變，MCP-1的水平呈降低改變，由此進(jìn)一步證實(shí)，雷珠單抗和曲安奈德分別在降低玻璃體腔內(nèi)細(xì)胞生長因子和炎癥因子表達(dá)方面具有不同效應(yīng)。此外，結(jié)合兩組玻璃體手術(shù)中觀察到的雷珠單抗組術(shù)中出血情況顯著低于曲安奈德組，證實(shí)在玻璃體切割術(shù)前使用雷珠單抗比曲安奈德更能減輕術(shù)中出血，有利于術(shù)者在手術(shù)過程中獲得清晰的手術(shù)視野。這與雷珠單抗本身是一段能夠辨識(shí)出人VEGF全部分異構(gòu)體的單克隆抗體片段有關(guān)，同時(shí)由于雷珠單抗其分子量小，因此能夠更容易更快地穿透視網(wǎng)膜各層發(fā)揮抑制新生血管的作用[13]。Cui等[14]的研究也發(fā)現(xiàn)玻璃體手術(shù)前3～7d注射雷珠單抗可明顯降低術(shù)中出血的發(fā)生提高手術(shù)安全性和成功率，降低術(shù)后并發(fā)癥的發(fā)生，但與本研究不同的是該發(fā)現(xiàn)是與術(shù)中行TA注射的患者進(jìn)行對(duì)比。術(shù)前應(yīng)用雷珠單抗和曲安奈德對(duì)玻璃體手術(shù)中效果的差異性仍需進(jìn)一步進(jìn)行探討。

本研究中，我們比較了雷珠單抗和曲安奈德注藥前后的玻璃體血管生長因子和炎癥因子含量差異以及兩組間注藥后的各細(xì)胞因子的差異。雷珠單抗組玻璃體腔內(nèi)VEGF-A、PIGF含量較注射前顯著降低；而曲安奈德組VEGF-A含量較注射前并無明顯改變，PIGF含量較之前有升高趨勢。PIGF是VEGF家族的重要成員，能通過VEGFR-1直接作用內(nèi)皮細(xì)胞也可與VEGFR-1結(jié)合后抑制VEGF-A與VEGFR-1結(jié)合，從而使VEGF-A與VEGFR-2結(jié)合發(fā)揮其生物學(xué)作用。Yu等[15]研究發(fā)現(xiàn)在PDR患者玻璃體腔中VEGF和PIGF的含量均高于正常人。Forooghian等[16]從行玻璃體切割手術(shù)的DR患者中發(fā)現(xiàn)，術(shù)前注射雷珠單抗后其房水中PIGF的含量明顯降低，與我們的研究較為一致。VEGF-A、VEGF-B和PIGF可隨DR病程的增加而表現(xiàn)出上升趨勢[17]，有研究報(bào)道發(fā)現(xiàn)曲安奈德可抑制花生四烯酸的產(chǎn)生從而產(chǎn)生抗炎的作用導(dǎo)致血管生長因子的表達(dá)減弱[18]，由于作用環(huán)節(jié)較雷珠單抗更復(fù)雜，使得作用時(shí)間更緩慢可能是導(dǎo)致PIGF持續(xù)增高的重要原因，在本研究中觀察到玻璃體腔注射曲安奈德對(duì)PIGF有升高趨勢而對(duì)VEGF-A無明顯影響，由此我們推斷PIGF的升高及VEGF-A的持續(xù)異常分泌可能是影響曲安奈德有效阻斷DR持續(xù)發(fā)展的可能原因之一。

另外，有研究報(bào)道，DR患者房水和玻璃體液中MCP-1、IL-6、IL-8等炎癥因子濃度顯著增加，且與DR患者黃斑水腫的發(fā)生密切相關(guān)[19-24]。MCP-1在部分炎癥、免疫疾病中發(fā)揮重要作用，是一種重要的炎癥因子，可參與多種視網(wǎng)膜疾病病理過程。當(dāng)視網(wǎng)膜發(fā)生炎癥反應(yīng)時(shí)，MCP-1表達(dá)明顯上升，升高的MCP-1可以募集單核-巨噬細(xì)胞向炎癥部位遷移，促進(jìn)小膠質(zhì)細(xì)胞活化，在損傷部位吞噬細(xì)胞碎片等[25]。Kunikata等[26]在孔源性視網(wǎng)膜脫離的研究中發(fā)現(xiàn)，玻璃體注射曲安奈德后，增加的MCP-1被明顯抑制。在對(duì)糖尿病黃斑水腫患者治療的研究中有報(bào)道指出，曲安奈德可能通過降低MCP-1等因子的分泌減少視網(wǎng)膜血管的滲漏[27]。本研究中也觀察到PDR玻璃體腔注射曲安奈德后MCP-1的濃度明顯降低，說明MCP-1是曲安奈德在抗炎反應(yīng)中參與的重要炎癥因子。同時(shí)，研究中我們還發(fā)現(xiàn)，雷珠單抗組IL-6和IL-8較注藥前出現(xiàn)明顯增加。IL-6屬于多功能的細(xì)胞因子，是感染和外傷急性期反應(yīng)中發(fā)揮重要作用的主要誘導(dǎo)因子，可引起炎性細(xì)胞分泌、刺激內(nèi)皮細(xì)胞增殖、增加內(nèi)皮細(xì)胞通透性等多種病理改變。Naldini等[28]研究發(fā)現(xiàn)IL-6等細(xì)胞因子與VEGF有類似特征，均可被低氧所誘導(dǎo)新生血管形成。此外，慢性高血糖刺激可明顯促進(jìn)胰島細(xì)胞分泌IL-6[29]，即使阻斷VEGF的分泌，IL-6的表達(dá)仍顯著增加可能是本研究中使用雷珠單抗后IL-6上調(diào)的可能原因之一。IL-8是嗜中性粒細(xì)胞的主要趨化因子，可參與促進(jìn)血管的生成過程。有研究者在使用雷珠單抗玻璃體腔注射后，觀察到DR患者房水中IL-8的表達(dá)升高，并認(rèn)為VEGF-A抑制后，IL-8之所以出現(xiàn)升高現(xiàn)象可能不是依賴于HIF-1α途徑而是通過調(diào)控NF-κB的表達(dá)引起的[16]。而有研究指出注射時(shí)穿刺或藥物作用過程中的急性反應(yīng)或視網(wǎng)膜缺血缺氧所致的調(diào)節(jié)結(jié)果是導(dǎo)致玻璃體腔注射雷珠單抗后IL-6和IL-8升高的可能原因[30]。由此可見，玻璃體腔注射雷珠單抗后IL-6和IL-8的升高可能是多種因素作用的共同結(jié)果。

此外，在本研究中，無論是組內(nèi)注藥前后對(duì)比，還是組間進(jìn)行比較，均未發(fā)現(xiàn)PDGF-AB/BB以及MCP-3的改變。PDGF-AB/BB與VEGF具有顯著的同源性，可促進(jìn)細(xì)胞生長并參與細(xì)胞運(yùn)動(dòng)。有研究發(fā)現(xiàn)，PDGF是視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞生長的自分泌刺激物，參與視網(wǎng)膜創(chuàng)傷修復(fù)和視網(wǎng)膜前膜形成[31]。PDGF-AB/BB表達(dá)的增高可導(dǎo)致神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的非血管相關(guān)增殖，參與調(diào)節(jié)PDR中血管和非血管細(xì)胞的增殖形成[32]。MCP-3是一種多功能趨化因子，具有促炎癥作用，與MCP-1共享MCP-1受體，但親和力相對(duì)較低。有研究表明MCP-1和MCP-3共同參與了受傷部位單核細(xì)胞的激活和補(bǔ)充，因此本研究除MCP-1外同時(shí)也對(duì)MCP-3進(jìn)行了檢測。目前針對(duì)MCP-3在眼部的疾病研究中相對(duì)較少，近期Wang等[33]發(fā)現(xiàn)原發(fā)性閉角型青光眼患者的房水中MCP-3輕度增加，可能參與了病程的進(jìn)展。研究中，我們觀察到PDGF-AB/BB和MCP-3注藥前明顯低于其他因子分泌，可能是其藥物作用不明顯的原因之一。此外，PDR患者中未被抑制的PDGF-AB/BB和MCP-3持續(xù)分泌可長期對(duì)視網(wǎng)膜造成破壞，可能是雷珠單抗和曲安奈德治療效果不佳的原因。

玻璃體切割手術(shù)前聯(lián)合應(yīng)用雷珠單抗及曲安奈德玻璃體腔給藥可從不同方面減少DR術(shù)中出血發(fā)生率，提高手術(shù)效率，本研究對(duì)玻璃體腔注射雷珠單抗及曲安奈德在DR中的調(diào)控因素及臨床效果進(jìn)行了初步探索及比較分析，但由于DR發(fā)病機(jī)制的復(fù)雜及藥物作用的調(diào)控作用，其具體機(jī)制仍有待進(jìn)一步探究。

本研究為前瞻性隨機(jī)對(duì)照非盲研究，雖然不能完全排除干擾因素，但隨機(jī)分組能減少一些選擇偏倚，此外為盡量減少選擇偏倚，所有患者均嚴(yán)格按納入標(biāo)準(zhǔn)選擇，所得結(jié)果真實(shí)可靠。