IL-23和IL-17在糖尿病性視網(wǎng)膜病變患者房水中的表達(dá)

張海江，梁 亮，田 瑞

0引言

糖尿病性視網(wǎng)膜病變(diabetic retinopathy，DR)是糖尿病(diabetes mellitus，DM)常見(jiàn)且嚴(yán)重的并發(fā)癥，也是DM患者致盲的重要原因。其主要病理改變?yōu)橐暰W(wǎng)膜出血、滲出、微血管瘤及新生血管形成，發(fā)病與氧化應(yīng)激、蛋白激酶C激活、晚期糖基化產(chǎn)物等因素密切相關(guān)，但其具體發(fā)病機(jī)制目前尚未明確。近年研究表明，由炎癥介質(zhì)介導(dǎo)的慢性炎癥反應(yīng)在DR的發(fā)生與發(fā)展過(guò)程中起著十分關(guān)鍵的作用[1-2]。長(zhǎng)期以來(lái)，人們按照CD4+細(xì)胞分化和功能特征將其分為輔助性T細(xì)胞(T help cell，Th)和調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(regulatory T cell，Treg)，而最近發(fā)現(xiàn)一種新型的不同于Th1和Th2的CD4+效應(yīng)細(xì)胞，具有獨(dú)立的分化和調(diào)節(jié)機(jī)制，因其能產(chǎn)生特異性炎癥因子白細(xì)胞介素(interleukin，IL)-17而命名為Th細(xì)胞17型(Th17)。IL-17作為超強(qiáng)的前炎癥因子，其可通過(guò)與特異性受體(IL-17R)相結(jié)合，激活PI3K/Akt/ERK及p38MAPK等炎癥信號(hào)傳導(dǎo)通路，啟動(dòng)炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)，在炎癥、感染及宿主反應(yīng)等過(guò)程中承擔(dān)重要角色[3]。而IL-23可通過(guò)激活Th17細(xì)胞內(nèi)JAK/STAT信號(hào)通路促進(jìn)IL-17分泌和活化，參與IL-17介導(dǎo)的多種病理生理過(guò)程，是IL-17上游正向調(diào)控因子[4]。本研究通過(guò)檢測(cè)不同程度DR患者房水中IL-17、IL-23的表達(dá)變化情況，分析兩者的相關(guān)性，探討IL-23/IL-17通路是否作為炎癥因素參與DR的病理?yè)p傷過(guò)程，以期為DR的臨床診療提供新的思路，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1對(duì)象和方法

1.1對(duì)象收集2016-06/2019-06宜昌市中心人民醫(yī)院眼科收治的因年齡相關(guān)性白內(nèi)障需行白內(nèi)障手術(shù)的患者70例70眼，其中單純年齡相關(guān)性白內(nèi)障患者20例20眼(Ⅰ組)；合并DM者50例50眼均符合2013年版《中國(guó)2型糖尿病防治指南》中制定的糖尿病診斷和分型標(biāo)準(zhǔn)[5]，根據(jù)美國(guó)早期治療糖尿病性視網(wǎng)膜病變研究小組(ETDRS)制定的DR病變程度分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)[6]分為3組，無(wú)糖尿病性視網(wǎng)膜病變組(Ⅱ組)18例18眼，非增殖性糖尿病性視網(wǎng)膜病變組(non-proliferative diabetic retinopathy，NPDR，Ⅲ組)17例17眼，增殖性糖尿病性視網(wǎng)膜病變組(proliferative diabetic retinopathy，PDR，Ⅳ組)15例15眼。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)晶狀體混濁Ⅱ～Ⅲ級(jí)，有白內(nèi)障手術(shù)指征；(2)空腹血糖控制在8.3mmol/L以下；(3)血壓正常(140/90mmHg以內(nèi))或接近正常范圍。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)合并其他嚴(yán)重全身性疾病(如腎功能不全、明顯高血脂、血壓控制不佳等)者；(2)屈光介質(zhì)明顯混濁，影響眼底觀察，無(wú)法進(jìn)行ETDRS評(píng)分者；(3)既往有眼底病變史，伴有其他明顯眼底病變者；(4)1型糖尿病患者。四組患者年齡、性別構(gòu)成比、患眼眼別等一般資料及三組DM患者DM病程比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05，表1)。本研究遵循《赫爾辛基宣言》，符合醫(yī)學(xué)倫理學(xué)原則，并獲得醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。所有患者均對(duì)本研究知情同意，均簽署知情同意書。

圖1ELISA法檢測(cè)IL-23的表達(dá)bP<0.01vsⅠ組；dP<0.01vsⅡ組；fP<0.01vsⅢ組。

1.2方法

1.2.1房水標(biāo)本采集所有患者手術(shù)眼在行白內(nèi)障超聲乳化術(shù)前常規(guī)消毒鋪巾、麻醉開瞼后，顯微鏡下用1mL一次性注射器在角膜緣內(nèi)1mm行前房穿刺。針頭不觸及晶狀體、虹膜及角膜內(nèi)皮，抽取瞳孔中央?yún)^(qū)未稀釋房水0.2mL，注入無(wú)菌離心管中，置于冰上，標(biāo)記并放入-80℃低溫冰箱保存待檢[7]。所有標(biāo)本采集均為同一名手術(shù)醫(yī)師完成，標(biāo)本采集后常規(guī)行白內(nèi)障手術(shù)。

1.2.2 ELISA法檢測(cè)房水中IL-17和IL-23的表達(dá)檢測(cè)前從冰箱取出樣品，放于冰上溶解，然后輕彈混勻，以5000r/min離心收集上清作為檢測(cè)樣品。按照IL-23和IL-17 ELISA試劑盒(武漢博士德公司)操作說(shuō)明書，測(cè)定各組患者房水中IL-23和IL-17的表達(dá)水平。實(shí)驗(yàn)中分別設(shè)空白、標(biāo)準(zhǔn)和樣品檢測(cè)組，每個(gè)檢測(cè)孔設(shè)3個(gè)復(fù)孔，每孔加樣50μL。37℃溫育90min后棄去液體，然后每孔直接加入生物素標(biāo)記抗體工作液50μL，37℃溫育60min。棄去液體后加入1×洗滌緩沖液300μL，1min后棄去，洗滌步驟重復(fù)3次。隨后加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記親和素工作液50μL，37℃溫育60min，棄去液體并按前述步驟洗孔3次。最后，每孔加底物溶液50μL，37℃避光反應(yīng)30min后加終止液終止反應(yīng)。使用全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀(Thermo公司)檢測(cè)450nm處吸光度值(A值)，以試劑盒提供的標(biāo)準(zhǔn)品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，使用標(biāo)準(zhǔn)曲線法分別計(jì)算IL-23和IL-17的濃度。

2結(jié)果

2.1各組患者房水中IL-23的表達(dá)水平ELISA檢測(cè)結(jié)果顯示，Ⅰ組、Ⅱ組、Ⅲ組、Ⅳ組患者房水中IL-23的表達(dá)水平分別為22.18±5.48、37.63±4.52、45.06±4.64、68.89±6.11pg/mL，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=263.668，P<0.001，圖1)。Ⅱ組、Ⅲ組、Ⅳ組患者房水中IL-23的表達(dá)水平較Ⅰ組明顯升高，且Ⅱ組、Ⅲ組、Ⅳ組之間兩兩比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)。

2.2各組患者房水中IL-17的表達(dá)水平ELISA檢測(cè)結(jié)果顯示，Ⅰ組、Ⅱ組、Ⅲ組、Ⅳ組患者房水中IL-17的表達(dá)水平分別為4.69±2.03、6.83±1.02、9.52±1.30、10.89±1.26pg/mL，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=64.795，P<0.001，圖2)。Ⅱ組、Ⅲ組、Ⅳ組患者房水中IL-23的表達(dá)水平較Ⅰ組明顯升高，且Ⅱ組、Ⅲ組、Ⅳ組之間兩兩比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

表1 四組患者基本資料

分組例數(shù)/眼數(shù)男/女(例)年齡( x±s,歲)DM病程( x±s,a)患眼眼別(左/右,眼)Ⅰ組20/208/1268.90±6.52-11/9Ⅱ組18/1810/869.86±5.178.29±5.3112/6Ⅲ組17/179/862.70±4.459.06±5.927/10Ⅳ組15/159/665.96±6.3611.75±6.328/7 F/χ21.6250.9300.5022.299P0.6540.4310.6090.503

注：Ⅰ組：?jiǎn)渭兡挲g相關(guān)性白內(nèi)障患者；Ⅱ組：年齡相關(guān)性白內(nèi)障合并單純DM患者；Ⅲ組：年齡相關(guān)性白內(nèi)障合并NPDR患者；Ⅳ組：年齡相關(guān)性白內(nèi)障合并PDR患者。

圖2ELISA法檢測(cè)IL-17的表達(dá)bP<0.01vsⅠ組；dP<0.01vsⅡ組；eP<0.05vsⅢ組。

圖3房水中IL-17與IL-23水平的相關(guān)性分析散點(diǎn)圖A：Ⅰ組；B：Ⅱ組；C：Ⅲ組；D：Ⅳ組。

2.3房水中IL-17與IL-23水平的相關(guān)性分析Pearson相關(guān)性分析結(jié)果顯示，Ⅰ組患者房水中IL-17與IL-23水平無(wú)明顯相關(guān)性(r=0.24，P>0.05)，而Ⅱ組、Ⅲ組、Ⅳ組患者房水中IL-17與IL-23水平均呈正相關(guān)(r=0.84、0.94、0.85，均P<0.01)，提示DM患者房水中IL-23濃度的上升，可能會(huì)促進(jìn)IL-17的分泌(圖3)。

3討論

隨著近年來(lái)人民生活水平和飲食習(xí)慣的改變，我國(guó)DM患者逐年增多。DR作為DM最為常見(jiàn)的慢性微血管并發(fā)癥，其引起的糖尿病性黃斑水腫(diabetic macular edema，DME)和PDR是引起工作人群視力損傷或致盲的主要原因。近年我國(guó)在北京、上海、山東、山西、廣州等地開展了以社區(qū)人群為基礎(chǔ)的DR流行病學(xué)研究，結(jié)果顯示在DM患者中，DR的患病率已高達(dá)24.7%～37.5%[8]，因此尋找早期診斷和治療DR的臨床研究成為當(dāng)前的熱點(diǎn)?，F(xiàn)已證實(shí)，DR以視網(wǎng)膜微血管內(nèi)皮損傷為始動(dòng)因素，但具體如何啟動(dòng)機(jī)制不明。目前普遍認(rèn)為，慢性持續(xù)炎癥反應(yīng)參與視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮損傷，白細(xì)胞在DR發(fā)生發(fā)展過(guò)程中起著關(guān)鍵作用，進(jìn)而提出DR是一種“炎癥性疾病“的概念[9-10]。體內(nèi)長(zhǎng)期高血糖首先引起視網(wǎng)膜血管血流動(dòng)力學(xué)改變，從而引起白細(xì)胞趨化、聚集、粘附、分泌炎性因子，造成視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮損傷、血管通透性增加、血-視網(wǎng)膜屏障(blood-retinal barrier，BRB)破壞。隨后，白細(xì)胞對(duì)視網(wǎng)膜局部組織進(jìn)一步浸潤(rùn)，釋放大量的炎癥介質(zhì)產(chǎn)生炎癥放大效應(yīng)，引起視網(wǎng)膜出血、滲漏、微動(dòng)脈瘤形成、血管閉塞等病理病變(臨床NPDR期)。最后，持續(xù)的視網(wǎng)膜缺血、缺氧，局部炎癥的不斷加劇，誘導(dǎo)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)產(chǎn)生，產(chǎn)生視網(wǎng)膜新生血管、玻璃體積血、牽拉性視網(wǎng)膜脫離等病理改變(臨床PDR期)。臨床上，通過(guò)收集標(biāo)本發(fā)現(xiàn)在DM患者血清、患眼房水及玻璃體中，炎癥因子、粘附分子及趨化因子的表達(dá)水平往往是顯著上調(diào)的，與DR的發(fā)生與進(jìn)展密切相關(guān)[7，11-13]。同時(shí)，從治療效果反饋上也證實(shí)，對(duì)于頑固性DME，單純玻璃體腔注射抗VEGF藥物難以奏效，往往需要聯(lián)合應(yīng)用糖皮質(zhì)激素。主要機(jī)制在于，糖皮質(zhì)激素可下調(diào)多種炎癥因子的表達(dá)、干預(yù)炎癥反應(yīng)信號(hào)通路、減輕視網(wǎng)膜炎癥反應(yīng)，促進(jìn)BRB功能的恢復(fù)，延緩DR的進(jìn)展[14]。因此，進(jìn)一步研究炎癥因子、炎癥反應(yīng)與DR的相關(guān)性，對(duì)于闡明DR的發(fā)病機(jī)制及探尋臨床治療DR的方法均具有重要意義。

IL-17作為強(qiáng)大的促炎因子，具有強(qiáng)大的招募中性粒細(xì)胞和促進(jìn)多種細(xì)胞釋放炎癥因子的作用。其可以促進(jìn)多種炎癥因子如IL-6、IL-8、腫瘤壞死因子-α、前列腺素E2等及趨化因子、粒細(xì)胞集落刺激因子等的表達(dá)，更重要的是可以刺激中性粒細(xì)胞和其他炎癥細(xì)胞的聚集、貼壁，最后突破血管內(nèi)壁、局部浸潤(rùn)組織而產(chǎn)生病理?yè)p傷[3，15]。IL-23作為IL-12家族的新成員，主要由樹突狀細(xì)胞、吞噬細(xì)胞、小膠質(zhì)細(xì)胞等抗原提呈細(xì)胞產(chǎn)生[4，16]。與IL-12生物活性不同的是，IL-23與Th細(xì)胞膜上的IL-23受體結(jié)合后，不僅可以促進(jìn)Th細(xì)胞向Th17分化、維持Th17增殖和存活，同時(shí)可誘導(dǎo)和促進(jìn)IL-17的分泌，激活I(lǐng)L-23/IL-17通路，產(chǎn)生炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)。在以往的視網(wǎng)膜相關(guān)炎性疾病研究中如葡萄膜炎、缺血性視網(wǎng)膜病變、年齡相關(guān)性黃斑變性等，均發(fā)現(xiàn)IL-23/IL-17通路參與介導(dǎo)視網(wǎng)膜病理?yè)p傷過(guò)程[4，17-18]。同樣在DR的研究中，Takeuchi等[11]通過(guò)分別采集需要行玻璃體切除手術(shù)患者的血清和玻璃體液，檢測(cè)發(fā)現(xiàn)PDR患者玻璃體液中炎性因子(IL-4、IL-6、IL-17A、IL-21、IL-22等)的檢出率及濃度明顯高于該患者自身血清；同時(shí)與黃斑前膜、黃斑裂孔等其他眼底疾病患者相比，PDR患者玻璃體液中這些炎癥因子的表達(dá)水平也是明顯升高的，差異具有顯著性，提示Th2和Th17細(xì)胞分泌的相關(guān)炎癥因子及炎癥反應(yīng)參與PDR的發(fā)生、發(fā)展。王靜等[12]檢測(cè)DM患者血清中IL-17的表達(dá)，結(jié)果顯示DR組患者血清IL-17的表達(dá)水平顯著高于NDR組(P<0.05)，經(jīng)Logistic回歸分析顯示血清IL-17是DR的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，提示檢測(cè)血清IL-17水平對(duì)DR的預(yù)測(cè)具有一定臨床意義。其機(jī)制可能是IL-17通過(guò)介導(dǎo)視網(wǎng)膜局部炎癥反應(yīng)，加劇胰島素抵抗或胰島細(xì)胞凋亡，進(jìn)而直接或間接參與視網(wǎng)膜微血管病變。Xu等[19]通過(guò)鏈脲酶素(streptozotocin，STZ)誘導(dǎo)建立DR大鼠模型，采用逆轉(zhuǎn)錄PCR和ELISA法分別檢測(cè)IL-17A mRNA和蛋白在視網(wǎng)膜上的表達(dá)水平，流式細(xì)胞儀檢測(cè)IL-17A+CD4+細(xì)胞在外周血單核細(xì)胞(peripheral blood mononuclear cells，PBMCs)中的比例，結(jié)果顯示DR組大鼠IL-17A+CD4+細(xì)胞在PBMCs的比例明顯高于正常對(duì)照組，IL-17A蛋白在血清及視網(wǎng)膜上的表達(dá)也明顯增強(qiáng)。同時(shí)，經(jīng)IL-23Rp19抗體玻璃體腔注射干預(yù)1wk后發(fā)現(xiàn)DR組大鼠視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞排列較前緊密，BRB功能恢復(fù)，IL-17A蛋白的表達(dá)水平也隨之下降，推測(cè)通過(guò)抑制IL-23的表達(dá)可下調(diào)IL-17的分泌，進(jìn)而減輕DR的視網(wǎng)膜炎癥反應(yīng)。上述臨床和實(shí)驗(yàn)研究均提示，IL-23、IL-17在DR患者血清、房水及玻璃體液中呈高表達(dá)狀態(tài)，而通過(guò)干預(yù)IL-23可以降低IL-17的表達(dá)，進(jìn)而減輕、延緩DR的發(fā)生發(fā)展。本研究結(jié)果與上述報(bào)道相一致，但對(duì)于IL-17、IL-23等炎癥因子在房水中的動(dòng)態(tài)變化規(guī)律及其與DR嚴(yán)重程度的相關(guān)性，目前還未見(jiàn)相關(guān)研究和文獻(xiàn)報(bào)道。

由于倫理的原因，往往無(wú)法從DR患者玻璃體、視網(wǎng)膜組織中取出大量反映視網(wǎng)膜中IL-23、IL-17表達(dá)情況的標(biāo)本。房水是一種包含多種細(xì)胞因子的生物活性復(fù)合體，眼內(nèi)產(chǎn)生的各種細(xì)胞因子可通過(guò)多種途徑進(jìn)入其中，在一定程度上反映其在眼內(nèi)組織的表達(dá)情況，而且采集房水相對(duì)方便、可重復(fù)。因此本研究選取2型糖尿病合并年齡相關(guān)性白內(nèi)障患者為研究對(duì)象，并根據(jù)DR的臨床分級(jí)進(jìn)行分組，分別收集房水，通過(guò)ELISA法檢測(cè)房水中IL-23、IL-17的表達(dá)水平以間接反映兩者在玻璃體、視網(wǎng)膜的表達(dá)情況。本研究結(jié)果顯示，各組患者房水中IL-23、IL-17均有表達(dá)，但隨著DR病情的嚴(yán)重，兩者的表達(dá)水平顯著升高。同時(shí)，相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，單純年齡相關(guān)性白內(nèi)障患者房水中IL-17與IL-23的表達(dá)無(wú)明顯相關(guān)性(r=0.24，P>0.05)，而DM患者房水中IL-17與IL-23的表達(dá)均呈正相關(guān)。這說(shuō)明DM患者房水中IL-23的高表達(dá)可能相應(yīng)促進(jìn)了IL-17的分泌，兩者長(zhǎng)期在眼內(nèi)的高表達(dá)產(chǎn)生協(xié)同作用，加劇DR病情的發(fā)展，這一檢測(cè)結(jié)果為臨床DR的早期診斷和后期治療提供了新的思路。分析其機(jī)制可能是IL-23/IL-17通路通過(guò)促進(jìn)炎性因子的分泌加重視網(wǎng)膜炎癥反應(yīng)，引起視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞和周細(xì)胞凋亡，下調(diào)視網(wǎng)膜緊密連接蛋白的表達(dá)，破壞BRB引起視網(wǎng)膜血管滲漏、出血等[20]，最終導(dǎo)致DME和PDR。

此外，我們發(fā)現(xiàn)，IL-23、IL-17在DR患者房水中呈高表達(dá)，且兩者表達(dá)的水平隨著DR的嚴(yán)重程度呈增高的趨勢(shì)，提示IL-23/IL-17通路可能作為視網(wǎng)膜炎癥反應(yīng)的主要途徑之一參與DR的病理?yè)p傷。同時(shí)，DM患者房水中IL-17與IL-23水平呈正相關(guān)，臨床上可以通過(guò)檢測(cè)房水IL-23等炎性因子的水平(玻璃體腔注藥時(shí))為下一步是否需要對(duì)DR患者加強(qiáng)抗炎治療和推測(cè)預(yù)后提供客觀依據(jù)[21]。但由于本研究樣本量較小，未將各組患者白內(nèi)障的嚴(yán)重程度、眼底黃斑水腫等情況納入討論和分析，且僅檢測(cè)了房水，研究結(jié)果可能存在偏倚性，還需要大樣本、多中心的研究證實(shí)。更重要的是DR本身是一個(gè)復(fù)雜的病理過(guò)程，是多種因素、多種途徑綜合作用的結(jié)果，IL-23和IL-17在眼內(nèi)由哪種細(xì)胞分泌、信號(hào)通路如何、介導(dǎo)炎癥反應(yīng)的具體機(jī)制等問(wèn)題也需進(jìn)一步研究。