漢族與哈薩克族PACG患者房水及小梁網(wǎng)中TGF-β2的表達與濾過泡形成的研究

王媛媛，張奕霞，羅遠湘，趙新榮，高云仙，楊 煒

0引言

青光眼是全球不可逆失明的首位原因[1]。2020年全球青光眼患者約7600萬，預(yù)計到2040年將增至1.118億[2]。原發(fā)性閉角型青光眼(primary angle-closure glaucoma，PACG)是我國致盲眼病之一，哈薩克族是新疆第二大少數(shù)民族，2006年李宏科等[3]對哈薩克族門診首診病例進行調(diào)查發(fā)現(xiàn)，哈薩克族青光眼發(fā)病以閉角型青光眼為主，占比約72%，急性閉角型青光眼患者及時就診率較低，慢性青光眼患者在發(fā)病早期缺乏足夠重視，單眼青光眼失明病例占29%，雙眼青光眼失明病例占51%，明顯高于國內(nèi)其他地區(qū)青光眼失明率。加之新疆哈薩克族大多居住在邊遠牧區(qū)，患者對青光眼認識不足，直至病情嚴重影響日常生活才到醫(yī)院就診檢查，往往需要實行手術(shù)治療[4]。

小梁切除術(shù)是目前治療PACG的經(jīng)典手術(shù)方式[5-6]，其目的是制作一個鞏膜瓣，通過切除鞏膜小梁組織，使房水從前房流入球結(jié)膜下，房水的水流受機械應(yīng)力的影響積蓄在術(shù)區(qū)結(jié)膜下，構(gòu)成有功能濾過泡。此過程涉及復(fù)雜的動態(tài)級聯(lián)反應(yīng)，手術(shù)破壞血-房水屏障，損傷球結(jié)膜、鞏膜等周邊組織，觸發(fā)炎癥反應(yīng)，從而釋放出轉(zhuǎn)化生長因子β2(TGF-β2)、血小板衍生生長因子(PDGF)、胰島素生長因子(IGF)-1等因子，促使成纖維細胞(Tenon’s capsule fibroblasts，Tfb)遷移至損傷處分化為肌纖維細胞，最終導(dǎo)致濾過泡瘢痕形成[7-8]。當(dāng)濾過通道受阻，可使有功能濾過泡損傷，導(dǎo)致其塌陷、扁平進而使眼壓控制不佳[9]。青光眼小梁切除術(shù)后2a內(nèi)復(fù)發(fā)率為15%～30%[10]。研究發(fā)現(xiàn)，TGF-β2在濾過泡纖維瘢痕化形成過程中起重要作用，被公認為是濾過瘢痕、傷口愈合和細胞外基質(zhì)(ECM)合成的關(guān)鍵中介[11-12]。目前有關(guān)哈薩克族PACG患者術(shù)后臨床隨訪研究甚少。本研究通過檢測漢族與哈薩克族PACG患者房水與小梁網(wǎng)中TGF-β2水平差異，探討其對PACG術(shù)后濾過泡瘢痕形成及濾過泡形態(tài)的影響，旨在為漢族與哈薩克族PACG患者小梁切除術(shù)后的臨床隨訪結(jié)果提供理論依據(jù)。

1對象和方法

1.1對象前瞻性研究。選取2018-07/2019-04在石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院眼科就診的PACG患者46例49眼，年齡40～85歲，漢族患者25例26眼，其中男11例，女14例，平均年齡65.650±9.529歲；哈薩克族患者21例23眼，其中男5例，女16例，平均年齡59.910±10.996歲。納入標準：(1)符合PACG的診斷標準，Goldmann眼壓計壓平記錄的眼內(nèi)壓>21mmHg，房角鏡下檢查房角粘連≥1/2，存在視野缺損、視盤改變(篩板變薄，視杯加深)；(2)擬首次行小梁切除術(shù)的漢族或哈薩克族患者。排除標準：(1)繼發(fā)性青光眼，如晶狀體源性青光眼、新生血管性青光眼、虹膜睫狀體炎繼發(fā)青光眼等；(2)原發(fā)性開角型青光眼、先天性或發(fā)育性青光眼；(3)合并視網(wǎng)膜或視神經(jīng)疾??；(4)既往有內(nèi)眼手術(shù)史者。漢族和哈薩克族患者性別構(gòu)成比、年齡差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=2.051，P=0.152；t=1.958，P=0.056)。本研究通過石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院倫理委員會同意，所有患者及其家屬均對本研究知情同意并簽署知情同意書。

1.2方法

1.2.1樣本采集所有患者均由同一位具有豐富臨床經(jīng)驗的術(shù)者行鞏膜下小梁切除術(shù)。結(jié)膜下注射利多卡因局部麻醉，懸吊上直肌，打開穹窿部結(jié)膜，制作結(jié)膜瓣，充分暴露手術(shù)區(qū)域的角鞏膜部分，以此為基底做3mm×4mm梯形鞏膜瓣至角膜緣，沿結(jié)膜切口向后及向兩側(cè)盡量分離球周間隙，顳側(cè)角膜緣11 ∶ 00位進針做前房穿刺，抽取房水0.1mL，后進行小梁切除1mm×2mm，做周邊虹膜切除，縫合鞏膜，適當(dāng)調(diào)節(jié)切口松緊度，由側(cè)穿口注入前房灌注液，仔細觀察鞏膜瓣水密性、前房的穩(wěn)定性，隨后將結(jié)膜瓣對合，并用8-0可吸收縫線將兩端結(jié)膜縫合固定在角膜緣處?？股貨_洗結(jié)膜囊，涂抗生素及阿托品眼膏，包扎術(shù)眼。術(shù)中均不使用5-氟尿嘧啶(5-FU)、絲裂霉素(MMC)干預(yù)。術(shù)中抽取房水0.1mL，4 000g離心20min，取上清液置于Eppendorf管中，-80℃凍存?zhèn)溆茫恍g(shù)中采集小梁組織，立即常溫下4%多聚甲醛液中固定24h備用。

1.2.2免疫組化法檢測小梁組織中TGF-β2表達術(shù)中取下小梁組織后立即放入4%多聚甲醛液中固定24h，常規(guī)石蠟包埋切片、烤片、抗原修復(fù)。免疫組織化學(xué)檢測采用常規(guī)方法，分步滴加TGF-β2一抗(武漢三鷹生物技術(shù)有限公司，貨號19999-1-AP)，工作濃度1 ∶ 100，4℃濕盒中孵育過夜(15h)。PBS 漂洗3min×3次，滴加HRP標記的山羊抗兔/小鼠二抗(武漢博士德生物工程有限公司，貨號BA1034)，37℃孵育20min。室溫顯色，鏡下控制反應(yīng)時間(胞漿呈棕黃色為陽性)，蒸餾水充分沖洗，蘇木素復(fù)染1min，梯度脫水，中性樹脂封片。光學(xué)顯微鏡觀察結(jié)果，陽性效應(yīng)產(chǎn)物為棕黃色顆粒，位于細胞漿中。

1.2.3免疫熒光法觀察小梁組織中TGF-β2表達術(shù)中取下小梁組織后立即放入4%多聚甲醛液中固定24h，常規(guī)石蠟包埋、切片。切片脫蠟，抗原修復(fù)，血清封閉，加TGF-β2一抗(武漢三鷹生物技術(shù)有限公司，貨號19999-1-AP)，工作濃度1 ∶ 100，于4℃濕盒中孵育過夜。滴加CY3羊抗兔IgG二抗(武漢博士德生物工程有限公司，貨號BA1032)，工作濃度1 ∶ 100，濕盒中20℃～37℃孵育1h，PBST洗片3min×4次；滴加DAPI避光孵育5min進行核染色，PBST洗片5min×4次，抗熒光淬滅劑封片，熒光顯微鏡下觀察結(jié)果。

圖1免疫組化法觀察PACG患者小梁組織中TGF-β2的表達(IHC×400)A：漢族PACG患者；B：哈薩克族PACG患者。紅色箭頭示TGF-β2陽性細胞。

圖2免疫熒光法觀察PACG患者小梁組織中TGF-β2的表達(IF×400)A：漢族PACG患者；B：哈薩克族PACG患者。紅色示TGF-β2表達陽性，藍色示細胞核。

1.2.4 ELISA法檢測房水中TGF-β2含量參考Human TGF-β2 ELISA Kit(Elabscience，貨號E-EL-H1587c)說明書操作，分別檢測房水中總TGF-β2(total TGF-β2，tTGF-β2)含量及活化TGF-β2(active TGF-β2，aTGF-β2)含量。

1.2.5術(shù)后眼壓和濾過泡形態(tài)所有患者分別于術(shù)后1、3、7d，3、6mo利用非接觸式眼壓計測量眼壓，重復(fù)測量3次取平均值，對于眼壓高于30mmHg的患者利用Goldmann接觸式眼壓計復(fù)測，并進行校正。隨訪至術(shù)后6mo，觀察患者的濾過泡形態(tài)，并參照Vanbuskirk法進行分型[13]：Ⅰ型(微囊狀泡)：微囊、缺血、壁?。虎蛐?平坦彌散泡)：彌散、透明液腔、壁較厚；Ⅲ型(瘢痕泡)：扁而平、加壓無隆起；Ⅳ型(包裹囊狀泡)：囊泡樣、界清、壁厚。Ⅰ型、Ⅱ型濾過泡均表明結(jié)膜下有外濾過的房水存在，稱為功能性濾過泡；Ⅲ型和Ⅳ型為非功能性濾過泡，Ⅳ型濾過泡雖有房水外引流，但被包裹的囊腔限制了結(jié)膜的吸收面積，只能視為做前房的有效通道，對增加房水吸收并無益處[14]。

2結(jié)果

2.1 PACG患者小梁組織中TGF-β2的表達免疫組化檢測結(jié)果顯示，漢族患者小梁組織細胞中TGF-β2表達陽性細胞數(shù)明顯增多(圖1A紅色箭頭示)，哈薩克族患者小梁組織細胞中TGF-β2陽性細胞數(shù)相對較少(圖1B紅色箭頭示)。免疫熒光檢測結(jié)果顯示，漢族患者小梁組織細胞中TGF-β2呈現(xiàn)明顯高表達(圖2A)，哈薩克族患者小梁組織細胞中TGF-β2呈現(xiàn)低表達(圖2B)。

2.2 PACG患者房水中TGF-β2水平ELISA檢測結(jié)果顯示，漢族和哈薩克族PACG患者房水中tTGF-β2含量分別為448.917±135.221、425.822±146.122pg/mL，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(t=0.575，P=0.568)，aTGF-β2含量分別為172.015±79.367、83.436±41.743pg/mL，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(t=4.794，P<0.001)，見圖3。

既往研究發(fā)現(xiàn)，PACG在70歲以上青光眼患者中占比最高[15]。本研究納入患者中，≥70歲者31例34眼，其中漢族患者18例19眼，哈薩克族患者13例15眼，漢族患者房水中tTGF-β2含量(480.124±152.997pg/mL)明顯高于哈薩克族(338.858±72.497pg/mL)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=2.421，P=0.026)；<70歲者15例15眼，其中漢族患者7例7眼，哈薩克族患者8例8眼，兩民族患者房水中tTGF-β2含量分別為422.159±116.985、472.203±155.878pg/mL，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.340)。

民族術(shù)前術(shù)后1d術(shù)后3d術(shù)后7d術(shù)后3mo術(shù)后6mo漢族43.27±11.0815.15±4.9614.15±4.6714.92±4.5316.69±5.1217.46±4.46哈薩克族61.83±20.7017.35±5.0314.61±4.0514.70±2.80313.91±2.9512.17±2.50

圖3PACG患者房水中TGF-β2水平A：tTGF-β2；B：aTGF-β2。

表2 PACG患者術(shù)后6mo濾過泡形態(tài) 眼

2.3手術(shù)前后眼壓情況手術(shù)前后，漢族和哈薩克族患者眼壓無組間差異性(F組間=1.146，P組間=0.290)，但有時間差異性和交互效應(yīng)(F時間=2.448，P時間=0.048；F交互=13.495，P交互<0.001)，兩民族患者術(shù)后眼壓均較術(shù)前明顯下降，見表1。

2.4術(shù)后濾過泡形態(tài)術(shù)后6mo，漢族患者形成功能性濾過泡者占50%(13/26)，哈薩克族患者形成功能性濾過泡者占78%(18/23)，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=4.841，P=0.028)，見表2。

3討論

PACG是我國致盲眼病之一，眼壓升高是患者視力損傷的重要因素。目前有研究表明PACG急性發(fā)作時眼前段炎癥反應(yīng)引起的高眼壓可刺激TGF-β2在房水中表達升高[16]。本研究通過對漢族和哈薩克族患者房水檢測發(fā)現(xiàn)，漢族患者房水中aTGF-β2表達量高于哈薩克族，且差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)?；A(chǔ)實驗證明，TGF-β2可能導(dǎo)致眼內(nèi)壓增高，在眼內(nèi)注射能夠編碼具有生物活性形式的TGF-β2腺病毒載體，可增加大鼠和小鼠眼內(nèi)壓[17-19]。Guo等[16]研究將急性閉角型青光眼(AACG)患者分為高眼壓組和正常眼壓組，眼壓高(>21mmHg)的AACG患者房水TGF-β2顯著高于眼壓正常的患者，表明TGF-β2在青光眼眼壓調(diào)節(jié)中起重要作用。

小梁切除術(shù)是目前抗青光眼手術(shù)的主要方式，而手術(shù)的成功標志是生成功能性濾過泡。李靜等[20]研究發(fā)現(xiàn)，青光眼小梁切除術(shù)后濾過泡形態(tài)與眼壓關(guān)系密切，且證明濾過通道的通暢性和有效濾過空間是維持功能性濾過泡形成的條件。小梁切除手術(shù)早期發(fā)現(xiàn)，前房炎癥反應(yīng)、分泌房水的睫狀體功能恢復(fù)、濾過通道的重塑及術(shù)后并發(fā)癥均可對眼壓產(chǎn)生影響，濾過術(shù)后眼壓的正常維持需要并依賴于功能性濾過泡的形成，當(dāng)濾過泡瘢痕形成，濾過通道受阻，可使有功能的濾過泡損傷，導(dǎo)致其塌陷、扁平進而使眼壓控制不佳[9]。本研究發(fā)現(xiàn)，漢族和哈薩克族患者小梁切除術(shù)后6mo功能性濾過泡形成情況有差異(P<0.05)。

TGF-β2是人眼內(nèi)廣泛存在的生長因子，眼內(nèi)多種細胞(如小梁細胞、晶狀體細胞、色素上皮細胞等)均可分泌，且眼內(nèi)TGF-β2濃度高于血清，該因子參與眼內(nèi)炎性細胞趨化、調(diào)節(jié)細胞增生、轉(zhuǎn)化、凋亡、ECM合成和損傷修復(fù)等多種生理病理過程[21-23]。小梁切除術(shù)造成血-房水屏障破壞及術(shù)區(qū)的炎癥反應(yīng)，血漿及血小板分泌的TGF-β2主要分布在切口周圍[24], TGF-β2可以促進ECM在小梁網(wǎng)沉積，其中活化的Tfb在ECM中積聚，最終促進濾過泡瘢痕的形成，導(dǎo)致手術(shù)失敗。Picht等[25]對PACG患者房水中TGF-β2濃度進行檢測并在術(shù)后進行長期隨訪發(fā)現(xiàn)，存在高濃度TGF-β2的術(shù)眼術(shù)后濾過瘢痕化發(fā)生率明顯提高。Cordeiro等[26]發(fā)現(xiàn)單克隆抗TGF-β2抗體可抑制成纖維細胞增殖，延長兔眼內(nèi)功能性濾過泡的維持時間。Burgos-Blasco等[27]和Metelli等[28]研究發(fā)現(xiàn)，房水中潛在的TGF-β2被房水中特異性蛋白酶(如細胞膜表面的唾液酸酶)水解，轉(zhuǎn)化為aTGF-β2。本研究術(shù)后6mo隨訪顯示，漢族與哈薩克族患者術(shù)后功能性濾過泡形成情況具有差異，推測可能是兩民族患者自身具有不同的分泌TGF-β2的能力，在手術(shù)的刺激下，房水中潛在的TGF-β2被房水中特異性蛋白酶水解，轉(zhuǎn)化為的aTGF-β2與損傷部位釋放的TGF-β2共同發(fā)揮其生物學(xué)效應(yīng)，促進傷口愈合及瘢痕化的發(fā)生。我們發(fā)現(xiàn)，漢族患者房水中tTGF-β2、aTGF-β2的表達均高于哈薩克族，兩民組患者房水中aTGF-β2含量差異具有統(tǒng)計學(xué)意義；漢族患者小梁組織中也呈現(xiàn)TGF-β2高表達，表明TGF-β2可能在濾過瘢痕形成過程中起重要作用。另有研究表明，PACG存在年齡差異性，其在70歲以上青光眼患者中占比最高[12]。本研究發(fā)現(xiàn)，兩民族患者中年齡在70歲以上的患者房水中tTGF-β2表達存在差異，表明年齡可能與TGF-β2表達有關(guān)。

綜上所述，漢族和哈薩克族PACG患者房水及小梁組織中TGF-β2的表達具有差異性。TGF-β2在PACG的早期及預(yù)后扮演重要角色，哈薩克族PACG患者房水及小梁組織中TGF-β2的低表達可能減緩眼內(nèi)Tfb活化增生和分泌ECM，減少濾過泡瘢痕形成從而控制眼壓，并促進功能性濾過泡形成。但由于本研究的樣本量較小，研究結(jié)論還需更進一步驗證。