干眼患者淚液結(jié)晶圖和脂質(zhì)層異常的關(guān)系研究

姚 濤，崔 琦，何 偉

0引言

干眼作為一類常見的眼表疾病，目前全球發(fā)病率約為5.5%～35.7%，多項(xiàng)研究表明，在45歲或45歲以上的成年人中，多達(dá)20%的人被認(rèn)為患有干眼癥。我國干眼發(fā)病率與其他亞洲國家相似，較歐美高，發(fā)病率約21%～30%[1]。輕中度干眼已成為影響我國人口工作效率與生活質(zhì)量最常見的眼表疾病，而重度干眼會(huì)導(dǎo)致視力障礙，甚至失明。2017年亞洲干眼共識(shí)提出全新的干眼診療理念，即淚膜定向診斷和治療[2]，建議進(jìn)行淚膜分層評(píng)估，針對(duì)性進(jìn)行治療。對(duì)淚膜脂質(zhì)層的評(píng)估，傳統(tǒng)多依賴于采用干涉光原理的大型設(shè)備，如DR-1淚膜干涉成像儀、LipiView和Oculus眼表綜合分析儀等，臨床應(yīng)用受限。經(jīng)典的淚液結(jié)晶試驗(yàn)是通過圖像中央部分羊齒狀物形成的程度判斷淚液黏蛋白成分的異常。近年國外已有研究證實(shí)，人類淚液結(jié)晶圖片中外層透明帶為脂質(zhì)成分[3]。本研究評(píng)估了干眼患者淚液結(jié)晶圖透明帶的臨床意義，探索一種評(píng)估淚液脂質(zhì)層的新方法，現(xiàn)報(bào)告如下。

1對(duì)象和方法

1.1對(duì)象隨機(jī)篩選2018-05/2019-07于我院門診就診的干眼患者47例47眼(均取右眼數(shù)據(jù)進(jìn)行分析)，其中男 12例，女35例，年齡25～74(平均45.71±14.32)歲。參照中華醫(yī)學(xué)會(huì)眼科學(xué)分會(huì)角膜病學(xué)組發(fā)布的《干眼臨床診療專家共識(shí)(2013年)》干眼診斷標(biāo)準(zhǔn)[1]，進(jìn)行檢查和評(píng)估：(1)有干燥感、異物感、燒灼感、疲勞感、不適感、視力波動(dòng)等主觀癥狀之一者；(2)BUT≤5s或Schirmer Ⅰ試驗(yàn)結(jié)果(無表面麻醉)≤5mm/5min；(3)5s

1.2方法所有患者均行眼表疾病指數(shù)(OSDI)問卷評(píng)分、脂質(zhì)層分級(jí)檢測(cè)、非侵入式淚膜破裂時(shí)間(NIBUT)和淚河高度檢查，應(yīng)用改良法行淚液采集并行淚液結(jié)晶試驗(yàn)，顯微鏡下獲取結(jié)晶圖像全貌，計(jì)算外層透明帶面積占比，之后與上述干眼相關(guān)指標(biāo)進(jìn)行相關(guān)性分析。

1.2.2淚膜脂質(zhì)層評(píng)估采用DR-1淚膜干涉成像儀評(píng)估受試者淚膜脂質(zhì)層，由同一檢查者完成檢測(cè)。分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)：Ⅰ級(jí)，灰白色無圖像；Ⅱ級(jí)，灰白色，但有輕微條紋改變；Ⅲ級(jí)，出現(xiàn)紅色、黃色光譜；Ⅳ級(jí)，出現(xiàn)雜亂的紫色、藍(lán)色光譜；Ⅴ級(jí)，淚膜層消失，角膜上皮暴露，不產(chǎn)生干涉圖像。

1.2.3淚河高度采用眼表綜合分析儀對(duì)受試者的淚河圖像進(jìn)行拍攝，并用系統(tǒng)內(nèi)自置的測(cè)量工具對(duì)瞳孔中央正下方即6 ∶ 00位的淚河高度進(jìn)行測(cè)量。每位受試者經(jīng)同一位眼科醫(yī)生檢查3次，取平均值為最終測(cè)量結(jié)果。

1.2.4非侵入式淚膜破裂時(shí)間采用眼表綜合分析儀中的Tear Film Scan軟件通過角膜前表面曲率變化而識(shí)別淚膜厚度的改變，從而計(jì)算出NIBUT。

1.2.5淚液結(jié)晶試驗(yàn)和結(jié)晶圖獲取分析受試者取坐位，無表面麻醉，用滅菌玻璃毛細(xì)管(0.2mm內(nèi)徑)在裂隙燈下于受試者右眼近淚阜處的淚河吸取約1μL淚液(長度約8mm)，利用硅膠吹頭將淚液排出滴于干凈的載玻片上，在室溫下(18℃～25℃)干燥10min。使用顯微鏡(物鏡=5×，目鏡=10×)觀察并拍攝干燥后的淚液結(jié)晶圖全貌。將圖片導(dǎo)入電腦，使用Digimizer軟件對(duì)結(jié)晶圖外層透明帶和整個(gè)結(jié)晶圖分別進(jìn)行手動(dòng)圈選(圖1)，測(cè)量出透明帶面積和結(jié)晶圖總面積，經(jīng)計(jì)算得出透明帶在結(jié)晶圖總面積中的面積占比。

圖1Digimizer軟件測(cè)量示例。

2結(jié)果

所有患者均順利完成檢查。在淚液采集過程中患者無不適主訴，無刺激性淚液分泌，均一次順利完成淚液采集并獲得淚液結(jié)晶圖。從獲取的典型淚液結(jié)晶圖中可見，合并嚴(yán)重瞼板腺功能障礙(MGD)的重度干眼患者淚液結(jié)晶圖中的外層透明帶窄且分布不均勻(圖2A)；輕度干眼患者結(jié)晶圖的外層透明帶相對(duì)寬且分布均勻(圖2B)。本組患者OSDI評(píng)分為36.38±14.14分，其中輕度干眼5眼，中度干眼34眼，重度干眼8眼；淚膜脂質(zhì)層分級(jí)為2.70±0.86級(jí)；淚河高度為0.16±0.05mm；NIBUT為7.93±5.59s；淚液結(jié)晶圖外層透明帶面積占比為0.18%±0.05%。Pearson積差相關(guān)分析結(jié)果顯示，本組患者OSDI評(píng)分與淚液結(jié)晶圖的外層透明帶面積占比呈負(fù)相關(guān)(r=-0.764，P<0.05，圖3A)，表明OSDI得分越高(即干眼癥狀越重)，淚液結(jié)晶圖外層透明帶面積占比越小；淚膜脂質(zhì)層分級(jí)與淚液結(jié)晶圖外層透明帶面積占比呈負(fù)相關(guān)(r=-0.838，P<0.05，圖3B)，表明淚膜脂質(zhì)層檢測(cè)結(jié)果等級(jí)越高(即淚膜脂質(zhì)層越薄)，淚液結(jié)晶圖外層透明帶面積占比越??；淚河高度與淚液結(jié)晶圖外層透明帶面積占比無顯著相關(guān)性(r=-0.237，P=0.112，圖3C)；NIBUT值與淚液結(jié)晶圖外層透明帶面積占比呈正相關(guān)(r=0.575，P<0.05，圖3D)，表明淚膜破裂時(shí)間越長(即淚膜越穩(wěn)定)，淚液結(jié)晶圖外層透明帶面積占比有增大的趨勢(shì)。

3討論

干眼是由于淚液的量或質(zhì)或流體動(dòng)力學(xué)異常引起的淚膜不穩(wěn)定和(或)眼表損害，從而導(dǎo)致眼的不適癥狀及視功能障礙的一類疾病。此病的發(fā)生是綜合性因素作用的結(jié)果，然而真正的機(jī)制尚不完全清楚?，F(xiàn)在普遍認(rèn)為干眼的發(fā)生涉及到一個(gè)復(fù)雜的功能機(jī)構(gòu)—眼表淚液分泌反射系統(tǒng)，包括眼表(角膜上皮、結(jié)膜上皮、淚膜)和淚分泌腺(淚腺、副淚腺、結(jié)膜杯狀細(xì)胞、瞼板腺等外分泌腺)以及連接它們的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)。其中任何一個(gè)環(huán)節(jié)出現(xiàn)問題均可引起淚膜完整性和功能的破壞，導(dǎo)致干眼的發(fā)生[5]。目前我國按照淚液的組成成分與維持淚膜穩(wěn)定性的因素將干眼分為水液缺乏型、蒸發(fā)過強(qiáng)型、黏蛋白缺乏型、淚液動(dòng)力學(xué)異常型與混合型五種類型[1]。國外有學(xué)者提出了全新的干眼診療理念，即淚膜定向診斷和治療(Tear film oriented diagnosis and therapy，TFOD and TFOT)，建議進(jìn)行淚膜的分層評(píng)估，針對(duì)性地進(jìn)行治療[6]。這個(gè)診療思路也被廣泛肯定，并被寫入了2017年的亞洲干眼共識(shí)[2]。

圖2典型的淚液結(jié)晶圖A：重度干眼患者；B：輕度干眼患者。

圖3Pearson積差相關(guān)分析結(jié)果A：OSDI評(píng)分與淚液結(jié)晶圖的外層透明帶面積占比的相關(guān)性；B：淚膜脂質(zhì)層分級(jí)與淚液結(jié)晶圖的外層透明帶面積占比的相關(guān)性；C：淚河高度與淚液結(jié)晶圖的外層透明帶面積占比的相關(guān)性；D：NIBUT與淚液結(jié)晶圖的外層透明帶面積占比的相關(guān)性。

脂質(zhì)層位于淚膜的最表層，厚度約0.1μm。淚膜脂質(zhì)層主要由位于上下眼瞼的瞼板腺分泌的瞼脂形成，分為非極性脂質(zhì)和極性脂質(zhì)，非極性脂質(zhì)(如膽固醇酯、甘油三脂)位于淚液最表面，構(gòu)成脂質(zhì)主要厚度；極性脂質(zhì)(如磷脂、脂肪酸)臨近水-黏蛋白層，可形成離子鍵和氫鍵，同時(shí)結(jié)合水層和非極性脂質(zhì)層，為均勻分散排布的薄層結(jié)構(gòu)[7-8]。較厚的非極性脂質(zhì)層主要起減少水分蒸發(fā)的作用，而脂質(zhì)層的完整性則依賴于極性脂質(zhì)，二者缺一不可。脂質(zhì)層的生理作用主要有以下幾方面：(1)在瞬目過程中對(duì)眼瞼運(yùn)動(dòng)起到潤滑的作用；(2)阻止水液蒸發(fā)的屏障作用；(3)阻止微生物和有機(jī)物(如花粉)進(jìn)入眼表[8]。 脂質(zhì)層的異常在干眼發(fā)病中起到重要作用。蒸發(fā)過強(qiáng)型干眼主要由于淚膜脂質(zhì)層的質(zhì)或量的異常而引起，如脂質(zhì)層游離脂肪酸增加，內(nèi)源性蠟脂及膽固醇合成增多，磷脂水平下降等。近年來，隨著生活環(huán)境和生活習(xí)慣的改變，如智能手機(jī)普及、電子化辦公人群增加、不良的閱讀習(xí)慣、空調(diào)環(huán)境、長期熬夜等，也導(dǎo)致脂質(zhì)層異常干眼所占的比例越來越大。對(duì)淚膜脂質(zhì)層的評(píng)估，現(xiàn)在臨床上多依賴于采用干涉光原理的大型設(shè)備，如DR-1淚膜干涉成像儀、LipiView眼表面干涉儀和Oculus眼表綜合分析儀等[9-10]，它們都具有非侵入性，獲取結(jié)果快速等特點(diǎn)，但價(jià)格相對(duì)昂貴、服務(wù)價(jià)格高是這類設(shè)備的缺點(diǎn)。

淚液結(jié)晶試驗(yàn)是在獲取患者淚液后，將淚液樣本滴于干凈的載玻片上，常溫下自然干燥，干燥過程中因?yàn)樗值恼舭l(fā)，淚液中的蛋白(主要為黏蛋白)與鹽離子相互作用，形成特殊的“羊齒狀結(jié)晶”，又稱淚液蕨類試驗(yàn)(tear ferning，TFT)。淚液中黏蛋白成分是決定淚液羊齒狀結(jié)晶的重要因素。傳統(tǒng)的淚液結(jié)晶試驗(yàn)是通過圖像中央部分羊齒狀物形成的程度，進(jìn)而判斷淚液黏蛋白成分的異常，輔助診斷干眼[11-12]。近年有研究者對(duì)淚液結(jié)晶圖進(jìn)行了更為深入的研究，發(fā)現(xiàn)所有結(jié)晶圖的外層均帶有透明的帶狀部分。Traipe等[3]使用尼羅藍(lán)A及油紅O，與新鮮淚液進(jìn)行1 ∶ 10比例混合，然后將1μL混合液體滴于干凈的載玻片上干燥，每個(gè)淚液標(biāo)本最外層的透明帶均能被染色，認(rèn)為該部分為脂質(zhì)。本研究在前期預(yù)實(shí)驗(yàn)中也使用脂質(zhì)特異性染色的蘇丹Ⅲ染液，對(duì)正常人的淚液樣本進(jìn)行染色后發(fā)現(xiàn)，外層的確可被蘇丹Ⅲ染液染色，進(jìn)一步證實(shí)了該部分為脂質(zhì)層。這在理論上可解釋為當(dāng)淚液滴于載玻片后，因?yàn)楸戎氐脑?，脂質(zhì)成分漂浮于淚滴表層，隨著水分蒸發(fā)，蛋白和無機(jī)鹽成分析出形成結(jié)晶時(shí)，表層的脂質(zhì)層被印在結(jié)晶斑的最外層，形成獨(dú)特的透明帶，并帶有油脂樣反光。上述淚液結(jié)晶圖外層透明帶為脂質(zhì)成分的發(fā)現(xiàn)，在之前的報(bào)道中從未被提及其臨床意義。理論上，淚滴中的脂質(zhì)成分越多，結(jié)晶圖外層透明帶會(huì)越寬，意味著可以通過結(jié)晶圖外層透明帶的寬度判斷淚液脂質(zhì)層的厚度。本研究為了使淚液結(jié)晶試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)化，并使得獲取的淚液結(jié)晶圖具有較好一致性和可比性，采取相對(duì)固定量(1μL)的淚液滴于載玻片上，形成的淚液結(jié)晶圖大小和形態(tài)一致性較好。另外，為進(jìn)一步排除不同樣本淚滴圖大小和形態(tài)的差異在透明帶寬度結(jié)果過程中測(cè)量造成影響，我們采用透明帶面積占比值(透明帶部分面積占整個(gè)結(jié)晶圖的總面積的百分比)進(jìn)行最終的統(tǒng)計(jì)分析。

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，透明帶面積占比與DR-1淚膜干涉成像儀檢測(cè)分級(jí)具有強(qiáng)相關(guān)性，提示淚液結(jié)晶圖的外層透明帶越寬，淚膜脂質(zhì)層越厚，這與本文研究者之前的設(shè)想相一致。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，透明帶面積占比與干眼癥狀評(píng)分(OSDI評(píng)分)及其他干眼檢查結(jié)果(DR-1淚膜干涉成像儀檢測(cè)分級(jí)、淚膜破裂時(shí)間)均具有相關(guān)性，提示對(duì)淚液結(jié)晶圖透明帶的評(píng)估具有一定的臨床意義，即透明帶越寬，干眼癥狀越輕、淚膜穩(wěn)定性越好。這與之前其他學(xué)者報(bào)道的淚膜脂質(zhì)層厚度相關(guān)研究結(jié)果相一致[13-14]。我們發(fā)現(xiàn)，透明帶面積占比與淚河高度的相關(guān)性無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，考慮淚河高度在一定程度上反映淚液的分泌量，是評(píng)價(jià)水液缺乏型干眼的重要指征，透明帶的寬度與淚膜中水液含量不相關(guān)。此外，從典型干眼患者淚液結(jié)晶圖全貌可以看到，合并嚴(yán)重MGD的干眼患者圖像外層透明帶除了變窄，還存在分布不均的特點(diǎn)，考慮可能是由于這類患者淚膜脂質(zhì)層中極性脂質(zhì)成分異常，脂質(zhì)層不能形成穩(wěn)定均一的結(jié)構(gòu)。而通過結(jié)晶圖透明帶的均一性是否可以用來判斷淚膜極性脂質(zhì)的異常尚不明確，有待進(jìn)一步研究。

本研究提供了一種通過淚液結(jié)晶圖評(píng)估淚液脂質(zhì)層的新方法，并評(píng)價(jià)了其臨床意義。該方法具有結(jié)果可量化、重復(fù)性較好、設(shè)備要求低等優(yōu)點(diǎn)。本研究中對(duì)結(jié)晶圖片的評(píng)估是應(yīng)用醫(yī)學(xué)測(cè)量軟件進(jìn)行的手工測(cè)量，相對(duì)費(fèi)時(shí)，但由于結(jié)晶圖分層清晰，開發(fā)出自動(dòng)化的專有軟件并不困難。此方法為診斷干眼以及評(píng)估其嚴(yán)重程度提供了一種新的思路，對(duì)干眼的診斷及治療效果評(píng)價(jià)也會(huì)起到一定作用，可作為干眼的輔助檢查手段。然而，受現(xiàn)有設(shè)備的限制，本研究僅采用了DR-1淚膜干涉成像儀進(jìn)行脂質(zhì)層評(píng)估，該設(shè)備獲取的淚膜脂質(zhì)層分級(jí)具有一定的主觀性，需要根據(jù)操作經(jīng)驗(yàn)和熟悉程度聯(lián)合判斷，容易造成一些誤差，這是本研究的不足之處。如果可能，將進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量，增加與采用LipiView眼表面干涉儀獲取脂質(zhì)層厚度的客觀指標(biāo)進(jìn)行對(duì)比，結(jié)果可信度更高。

1中華醫(yī)學(xué)會(huì)眼科學(xué)分會(huì)角膜病學(xué)組．干眼臨床診療專家共識(shí)(2013年). 中華眼科雜志 2013; 49(1): 73-75