獼猴桃潰瘍病拮抗菌株篩選及田間藥效試驗(yàn)

張文娟

(渭南職業(yè)技術(shù)學(xué)院，陜西 渭南 714026)

0 引言

獼猴桃又名奇異果，果肉中富含有糖、多種維生素和氨基酸、有機(jī)酸、K+、Mg2+以及相應(yīng)的色素等等內(nèi)容，新鮮的獼猴桃可以進(jìn)行加工，將其加工成果品以及飲料罐頭，而且還可以做進(jìn)一步的開發(fā)，同時(shí)獼猴桃的籽、葉子、枝條、花等部分都有進(jìn)一步加工和開發(fā)的價(jià)值[1,2]。因此，獼猴桃有廣闊的市場發(fā)展前景和很好的研究價(jià)值。但是獼猴桃種植過程中會(huì)受病菌感染而出現(xiàn)病害，比如丁香假單胞菌，是導(dǎo)致獼猴桃病變的一種病原菌，可能導(dǎo)致獼猴桃出現(xiàn)一些大面積的病害，獼猴桃潰瘍病主要感染樹干、枝條、葉片及花，引起枝干潰病或者枝葉萎蔫[3,4]。獼猴桃潰瘍自1980年首次在日本報(bào)道以來，已在全球獼猴桃栽培區(qū)廣泛分布，當(dāng)獼猴桃出現(xiàn)病害的時(shí)候，帶來的危害較大，會(huì)導(dǎo)致果實(shí)的產(chǎn)量以及質(zhì)量出現(xiàn)大面積的下降，繼而給生產(chǎn)者帶來巨大的經(jīng)濟(jì)損失[5,6]。分析導(dǎo)致獼猴桃出現(xiàn)病害的原因，其中一個(gè)因素就是大量使用農(nóng)藥導(dǎo)致的抵抗力降低。大量的使用化學(xué)方面的農(nóng)藥很容易會(huì)使病菌出現(xiàn)一定的耐藥性，藥物的效力逐漸下降；同時(shí)化學(xué)農(nóng)藥的大量使用會(huì)出現(xiàn)較高的殘留，不僅可能污染環(huán)境，還可能影響人類的身體健康。因此，迫切需要?jiǎng)?chuàng)制高效、安全、低殘留的新型農(nóng)藥，這對(duì)于獼猴桃以及相關(guān)疾病的抑制都是十分有效的，只有不斷地提升病害防治水平，才能保證獼猴桃的種植質(zhì)量，進(jìn)而提升獼猴桃生產(chǎn)水平[7,8]。筆者研究采集渭南市獼猴桃健康株，進(jìn)行內(nèi)生放線菌的分離純化，并對(duì)獼猴桃潰瘍病病菌進(jìn)行拮抗試驗(yàn)，篩選出拮抗菌株，從生物農(nóng)藥角度為獼猴桃細(xì)菌性潰瘍病防治工作提供支持。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試樣品 采集地點(diǎn)為陜西省渭南市臨渭區(qū)賀家村、高李村、華州區(qū)3個(gè)獼猴桃種植園區(qū)，于2018年4-5月份采集健康獼猴桃植株的枝條和葉片等組織，樣品共計(jì)29份。

1.1.2 病原菌 獼猴桃潰瘍病菌(Pseudomonassyringaepv.actinidiae，Psa)由西北農(nóng)林科技大學(xué)植物病理研究室提供。

1.1.3 培養(yǎng)基 淀粉酪素培養(yǎng)基：可溶性淀粉 10.0 g，K2HPO42.0 g，KNO32.0 g，NaCl 2.0 g，Casein 0.3 g，MgSO47H2O 0.05 g，CaCO30.02 g，F(xiàn)eSO47H2O 0.01 g，瓊脂粉 15.0 g，H2O 1 000 mL。

小米發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖 10.0 g，小米 10.0 g， NaCl 2.5 g，蛋白胨3.0 g，CaCO31.0 g，(NH4)2SO41.0 g，H2O 1 000 mL，pH7.2。

高氏一號(hào)合成培養(yǎng)基、牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基。

1.1.4 主要試劑 HPD系列大孔樹脂、分析純甲醇、乙酸乙酯等(汕頭西隴化工廠)、氨芐青霉素(Ampicillin)為生化試劑。

1.2 方法

1.2.1 內(nèi)生放線菌的分離、純化 用蒸餾水將樣品清洗干凈、自然晾干備用。使用打孔器切割葉片，使其成為直徑確定的小圓片。用無菌處理的枝剪將枝條剪成0.6 cm兩端均有切口的小段，按照組織塊表面消毒法，枝條：75%酒精沖洗3次→3.5%次氯酸鈉沖洗4次→75%酒精沖洗3次；葉片：75%酒精沖洗1次→3.5%次氯酸鈉沖洗2次→75%酒精沖洗1次，對(duì)組織表面進(jìn)行消毒。消毒結(jié)束后即刻用無菌水清洗3次，末次清洗液取1 000 μL加入淀粉酪素培養(yǎng)基和高氏一號(hào)合成培養(yǎng)基制成的平板中，涂布均勻，置于28℃培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)3 d，觀察表面是否有菌落長出，以檢測消毒是否徹底。

將表面消毒的組織塊無菌條件下貼在淀粉酪素培養(yǎng)基和高氏一號(hào)合成培養(yǎng)基制成的平板中，每皿貼4份，放置在28℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，等待菌株長出菌落，然后采集菌落開展菌株的純化工作，最后將純化處理之后的菌株在培養(yǎng)基斜面上進(jìn)行保存、備用。

1.2.2 內(nèi)生放線菌的拮抗實(shí)驗(yàn) 內(nèi)生放線菌的液體發(fā)酵：在250 mL 三角瓶中裝入50 mL 小米培養(yǎng)基，滅菌，冷卻。接種各純化菌株到培養(yǎng)瓶中，置入28℃搖床，以180 r·min-1轉(zhuǎn)速培養(yǎng)5 d。過濾發(fā)酵液并收集濾液，4℃保藏備用。

活性測定：測定各菌株發(fā)酵液對(duì)獼猴桃潰瘍病的抑菌活性采用管碟法。將供試細(xì)菌獼猴桃潰瘍病菌制成濃度為1×106菌懸液，取1 mL菌懸液與9 mL的牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基充分混勻，制成帶菌平板，各平板等距離放置牛津杯5個(gè)，各加發(fā)酵液 200 μL，37℃培養(yǎng) 24 h ，測量抑菌圈直徑，每處理重復(fù)3次。

1.2.3 WN34菌株發(fā)酵液活性粗提物制備 大孔吸附樹脂的選擇：取6份100 mL過濾好的菌株發(fā)酵液分別用預(yù)處理過的20 mL(濕體積)HPD100、HPD300、HPD400、HPD500、HPD600、HPD750大孔吸附樹脂靜態(tài)吸附，重復(fù)三次。12 h后裝入層析柱，先用少量蒸餾水洗去雜質(zhì)，然后分別用甲醇洗脫(解吸)。將甲醇洗脫液定容至一定體積，采用管碟法、濾紙片法對(duì)殘留液、甲醇洗脫液進(jìn)行以獼猴桃潰瘍病病菌為指示菌的抑菌活性試驗(yàn)。

針對(duì)這個(gè)問題，我們?cè)谡n后進(jìn)行了探討，最后得到一致結(jié)論，那就是我們?cè)谶x取視頻的時(shí)候只注重了上課內(nèi)容本身，沒有關(guān)注學(xué)生的興趣點(diǎn)，從而造成了課前師生互動(dòng)的脫節(jié)，以至于整個(gè)教學(xué)系統(tǒng)在這個(gè)階段就已經(jīng)崩塌了。

樹脂的動(dòng)態(tài)飽和吸附量考察：取已處理好的HPD100樹脂20 mL(濕體積)裝柱，將準(zhǔn)備好的菌株發(fā)酵液緩慢加入層析柱中，通過液用三角瓶收集并編號(hào)，每份100 mL，流速約為2 mL·min-1，采用管碟法對(duì)收集的各餾分進(jìn)行以獼猴桃潰瘍病病菌為指示菌的抑菌活性試驗(yàn)。

活性粗提物的制備：將90L發(fā)酵液經(jīng)HPD100樹脂富集，用40%，60%，100%甲醇水梯度洗脫，100%甲醇餾分濃縮至一定體積即為活性粗提物。

1.2.4 WN34 菌株的大田實(shí)驗(yàn) 田間病害防治實(shí)驗(yàn)于 2018年 2 月下旬在渭南市臨渭區(qū)獼猴桃園進(jìn)行，以全株噴霧和涂抹枝干的方法進(jìn)行防效實(shí)驗(yàn)，被試獼猴桃品種為徐香。①噴霧法: 分別用WN菌株發(fā)酵液粗提物稀釋液(濃度為原發(fā)酵液濃度)，進(jìn)行全株噴施，每組處理發(fā)病株 10 株，間隔 7 d 噴藥 1 次，連續(xù)4 次。分別于7 d、14 d、21 d、28 d調(diào)查各個(gè)處理樹枝的病斑愈合情況，計(jì)算相對(duì)防效。以45%代森銨150倍稀釋液和清水為對(duì)照[9,10]。②涂抹法: 在施藥前，先用刀將植株發(fā)病部位的樹皮刮除，然后再涂抹WN菌株發(fā)酵液粗提物稀釋液(濃度為原發(fā)酵液濃度)，每組處理發(fā)病株10株，以45%代森銨150倍稀釋液和清水為對(duì)照。涂抹藥劑6個(gè)月后調(diào)查病斑愈合情況，以病斑處產(chǎn)生愈合組織為愈合病斑的依據(jù)，計(jì)算防治效果[11]。

病斑愈合率=(防治后病斑愈合數(shù)/防治前病斑總數(shù))×100%

防治效果=[(處理區(qū)病斑愈合率-對(duì)照區(qū)病斑愈合率)/(1-對(duì)照區(qū)病斑愈合率)]×100%

2 結(jié)果與分析

2.1 內(nèi)生放線菌的分離及拮抗實(shí)驗(yàn)結(jié)果

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，最后一次清洗液加入淀粉酪素培養(yǎng)基和高氏一號(hào)合成培養(yǎng)基制成的平板中，涂布均勻，置于28℃培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)3 d，表面未觀察到菌落，說明表面消毒效果良好。從采集的獼猴桃植株的枝條和葉片等組織分離得到37株內(nèi)生放線菌，其中從枝條組織中分離得到8株，葉片組織中分離得到29株。采用管碟法測定各菌株發(fā)酵液對(duì)Psa的抑菌活性，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表1。

表1 初篩拮抗菌發(fā)酵液對(duì)獼猴桃潰瘍病菌的抑制活性

備注："+++"表示抑菌圈非常清晰，"++"表示抑菌圈比較清晰。

2.2 WN34菌株的大田實(shí)驗(yàn)結(jié)果

采用噴霧法進(jìn)行田間試驗(yàn)的結(jié)果見表2。從表2可知，在噴藥14 d、21 d、28 d內(nèi)，WN34菌株發(fā)酵液粗提物對(duì)獼猴桃潰瘍病都有較好的治療效果，防效優(yōu)于陽性對(duì)照45%代森銨，并且隨著時(shí)間的推移有一定程度的提高，在噴藥28 d后，WN34菌株發(fā)酵液粗提活性物對(duì)獼猴桃潰瘍病的防效提高至66.0%。采用涂抹法進(jìn)行田間試驗(yàn)的結(jié)果見表3。從表3可知，在涂抹藥劑后，WN34菌株發(fā)酵液粗提活性物對(duì)獼猴桃潰瘍病的防治效果為78.2%，優(yōu)于陽性對(duì)照45%代森銨。并且在實(shí)驗(yàn)中觀察發(fā)現(xiàn)，涂抹藥劑6個(gè)月后病斑出現(xiàn)愈合現(xiàn)象，并且在病斑處后形成愈合層。說明WN34菌株發(fā)酵液對(duì)獼猴桃潰瘍病有較好的防治效果。

表3 菌株WN34發(fā)酵液活性粗提物涂抹法對(duì)獼猴桃潰瘍病的田間防治效果

3 結(jié)論

研究從采集的獼猴桃植株的枝條和葉片等組織分離得到37株內(nèi)生放線菌，其中從枝條組織中分離得到8株，葉片組織中分離得到29株，其中8株內(nèi)生放線菌的發(fā)酵液表現(xiàn)出對(duì)Psa有較強(qiáng)的抑制作用。說明葉片組織中內(nèi)生放線菌多于枝條組織中的內(nèi)生放線菌。采用管碟法測定WN34菌株發(fā)酵液對(duì)Psa的抑菌活性，抑菌圈直徑達(dá)到21 mm。

田間試驗(yàn)結(jié)果表明：采用噴霧法，WN34菌株發(fā)酵液粗提活性物對(duì)獼猴桃潰瘍病有較好的治療效果，在噴藥28 d后，防效達(dá)到66.0%。采用涂抹法，WN34菌株發(fā)酵液粗提活性物防效為78.2%，優(yōu)于陽性對(duì)照45%代森銨。并且在實(shí)驗(yàn)中觀察發(fā)現(xiàn)，涂抹藥劑6個(gè)月后病斑出現(xiàn)愈合現(xiàn)象，并且在病斑處后形成愈合層。說明WN34菌株發(fā)酵液對(duì)獼猴桃潰瘍病有較好的防治效果。

4 討論

內(nèi)生菌具有一定的多樣性，植物的種類、生長年限以及培養(yǎng)過程等因素對(duì)其的成長都有一定影響。筆者在篩選獼猴桃內(nèi)生放線菌時(shí)發(fā)現(xiàn)不同部位內(nèi)生菌數(shù)量差異顯著，其中葉片中的內(nèi)生放線菌多于枝干樣品。可能原因?yàn)槿~片相對(duì)于枝干表面積大，與外界物質(zhì)交換機(jī)會(huì)多，微生物更有可能進(jìn)入植物組織。也有學(xué)者認(rèn)為植物內(nèi)生菌是通過植物體表面、根際的自然孔口或傷口等進(jìn)入組織內(nèi)部。筆者使用淀粉酪素和高氏一號(hào)兩種培養(yǎng)基來分離篩選獼猴桃組織中的內(nèi)生放線菌，目的是盡量多的得到不同種類的內(nèi)生放線菌，但即使使用不同種類的培養(yǎng)基，也不能確保將植物組織中所有的內(nèi)生放線菌全部分離出來，并且有些內(nèi)生菌不能在離體條件下生長，有些內(nèi)生菌生長較慢，會(huì)被生長相對(duì)較快的菌株覆蓋，導(dǎo)致分離得到菌株有所遺漏。

筆者采用噴霧法和涂抹法兩種方法進(jìn)行田間試驗(yàn)，結(jié)果表明涂抹法防治效果(78.2%)優(yōu)于噴霧法(66.0%)?？赡苁且?yàn)橥磕ǚㄔ趯?shí)施過程中是將病斑部位的組織刮除后再涂抹藥劑，縮短藥劑與病原菌接觸時(shí)間，快速抑制病情發(fā)展，避免外界氣候條件的影響，故優(yōu)于噴霧法。WN34菌株發(fā)酵液作為一種新型的抗獼猴桃潰瘍病生物防治藥劑開發(fā)，有很好的潛力。