人工合成啟動(dòng)子的應(yīng)用

肖紅慶 李曉薇 Jameel Aysha 劉偉燦 章婷婷 王一帆 李海燕

（吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院/生物反應(yīng)器與藥物開(kāi)發(fā)教育部工程研究中心，吉林 長(zhǎng)春130118）

啟動(dòng)子在基因轉(zhuǎn)錄的起始和調(diào)節(jié)中發(fā)揮非常重要的作用，在基因工程中是重要的組成構(gòu)件[1]。天然啟動(dòng)子很難實(shí)現(xiàn)連續(xù)的、有目的性的調(diào)控。對(duì)于組成型啟動(dòng)子，一般啟動(dòng)子的序列都比較固定，所以啟動(dòng)子的活性一般也都無(wú)法實(shí)現(xiàn)更多的調(diào)控。而對(duì)于誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，經(jīng)過(guò)誘導(dǎo)物的誘導(dǎo)之后，通過(guò)改變濃度可以在一定的范圍內(nèi)調(diào)節(jié)啟動(dòng)子的活性，但超出這個(gè)范圍啟動(dòng)子的活性是不可以調(diào)節(jié)的。因此，為了獲得更多在不同條件下具有不同強(qiáng)度、不同功能的啟動(dòng)子，更為精細(xì)的調(diào)節(jié)基因的表達(dá)，近年來(lái)，人工合成啟動(dòng)子的研究受到越來(lái)越多人的關(guān)注。

近年來(lái)，生物技術(shù)與生物信息學(xué)的不斷發(fā)展，具有特定功能的調(diào)控元件在顯示出巨大的應(yīng)用潛力[2]。轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控直接影響基因的表達(dá)水平，而啟動(dòng)子是轉(zhuǎn)錄水平的重要調(diào)節(jié)者，因此，啟動(dòng)子是生物學(xué)中的重要調(diào)控元件之一[3，4]。人工合成啟動(dòng)子是指按照實(shí)踐需求合成一段啟動(dòng)子序列，人工合成啟動(dòng)子能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)基因進(jìn)行更為精細(xì)和定量的調(diào)控，使調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中各個(gè)基因的表達(dá)強(qiáng)度實(shí)現(xiàn)最佳組合[5]。人工合成啟動(dòng)子對(duì)于植物生物技術(shù)、基因治療和生命科學(xué)基本原理研究具有重要價(jià)值。本文具體闡述了人工合成啟動(dòng)子工業(yè)生產(chǎn)、基因治療及農(nóng)業(yè)上的應(yīng)用，并且分析了人工合成啟動(dòng)子的發(fā)展趨勢(shì)。

1 在工業(yè)生產(chǎn)上的應(yīng)用

合成啟動(dòng)子可以通過(guò)調(diào)節(jié)代謝途徑生產(chǎn)生物和化學(xué)產(chǎn)品，用于工業(yè)上大規(guī)模的生產(chǎn)過(guò)程[6]。在綜合的生物系統(tǒng)中啟動(dòng)子存在的遺傳不穩(wěn)定性，是大規(guī)模的工業(yè)生產(chǎn)中最重要的限制條件[7]。因此，在這些系統(tǒng)中使用合成啟動(dòng)子有助于基因的低水平表達(dá)，可以提高遺傳穩(wěn)定性，所以在解決這類問(wèn)題時(shí)設(shè)計(jì)的合成啟動(dòng)子應(yīng)該避免重復(fù)序列以防止序列重組，另一種解決方法是使用可誘導(dǎo)的啟動(dòng)子?？傊趶?fù)雜的基因工程中使用合成啟動(dòng)子技術(shù)有利于增加基因的穩(wěn)定性和提高對(duì)調(diào)控元件調(diào)節(jié)效率的控制。例如，在原核生物體內(nèi)設(shè)計(jì)表達(dá)兩種或者更多的酶基因，突變體在幾代內(nèi)會(huì)連續(xù)增加最終導(dǎo)致基因表達(dá)的終止，這是因?yàn)橥蛔凅w在幾代內(nèi)的積累導(dǎo)致基因失活，有研究報(bào)道，通過(guò)使用不同強(qiáng)度的雙啟動(dòng)子對(duì)N-乙酰葡糖胺合成路徑中Liu 等利用雙啟動(dòng)子系統(tǒng)對(duì)N-乙酰葡糖胺合成路徑中2 個(gè)關(guān)鍵酶基因的組合進(jìn)行優(yōu)化，使其產(chǎn)量提高了32.4%[8]，說(shuō)明可以利用合成啟動(dòng)子技術(shù)提高某些工業(yè)產(chǎn)品的產(chǎn)量。

2 合成啟動(dòng)子用于基因治療

合成啟動(dòng)子技術(shù)的又一重大應(yīng)用是在疾病治療上的應(yīng)用。實(shí)際上腫瘤的病毒療法作為潛在的治療方法已經(jīng)有幾十年的研究歷史，通過(guò)產(chǎn)生一類可復(fù)制的病毒使其在腫瘤細(xì)胞中特異性的復(fù)制使腫瘤細(xì)胞特異性死亡。有研究報(bào)道，應(yīng)用一個(gè)復(fù)制的有活性的逆轉(zhuǎn)錄病毒能夠選擇性殺死腫瘤細(xì)胞[9]，其原理在于通過(guò)在逆轉(zhuǎn)錄病毒長(zhǎng)末端重復(fù)序列上結(jié)合前列腺特異啟動(dòng)子，在前列腺特異啟動(dòng)子的基礎(chǔ)上設(shè)計(jì)更多在前列腺癌細(xì)胞中有活性的合成啟動(dòng)子，其結(jié)果顯示，逆轉(zhuǎn)錄病毒只在癌細(xì)胞中有效的轉(zhuǎn)導(dǎo)和復(fù)制，這是一個(gè)令人關(guān)注的治療癌癥的療法。

另外，只在循環(huán)內(nèi)皮細(xì)胞有活性的啟動(dòng)子對(duì)于癌癥基因療法是一個(gè)重要的治療手段?？梢允鼓繕?biāo)新血管在腫瘤中生長(zhǎng)以切斷供應(yīng)腫瘤生長(zhǎng)的營(yíng)養(yǎng)，發(fā)展一種癌癥基因療法。有研究采用此種方法，cdc6基因的啟動(dòng)子只在分裂的細(xì)胞中有活性，使啟動(dòng)子與內(nèi)皮素增強(qiáng)子元件相結(jié)合構(gòu)建一個(gè)在內(nèi)皮細(xì)胞中有活性的合成啟動(dòng)子[10]，在體外4個(gè)內(nèi)皮素元件結(jié)合到cdc6啟動(dòng)子上得到了最優(yōu)的啟動(dòng)子。當(dāng)將其引入體內(nèi)時(shí)，合成啟動(dòng)子在腫瘤組織中比CMV35S(Cucumber mosaic virus)啟動(dòng)子具有更高的驅(qū)動(dòng)基因表達(dá)的效率。

合成啟動(dòng)子在基因治療方面的另一個(gè)重要應(yīng)用是構(gòu)建肝臟特異性啟動(dòng)子，在轉(zhuǎn)基因小鼠模型中用來(lái)治愈糖尿病[11]。通過(guò)隨機(jī)組合順式作用元件構(gòu)建一個(gè)在肝細(xì)胞中對(duì)胰島素敏感的合成啟動(dòng)子，注射最高劑量病毒的小鼠在50d內(nèi)未出現(xiàn)高血糖癥狀。注射由CMV啟動(dòng)子表達(dá)胰島素的腺病毒由于血糖過(guò)低導(dǎo)致了小鼠的死亡，這說(shuō)明基因治療中對(duì)表達(dá)的調(diào)節(jié)是至關(guān)重要的，同時(shí)說(shuō)明設(shè)計(jì)啟動(dòng)子時(shí)對(duì)基因表達(dá)的控制是不可忽視的[12]。

3 植物抗逆上的應(yīng)用

植物中主要是通過(guò)在核心啟動(dòng)子上游組合順式調(diào)控元件來(lái)構(gòu)建脅迫誘導(dǎo)型人工合成啟動(dòng)子。有研究導(dǎo)報(bào)利用W1-box、W2-box、GCC-box、JERE等調(diào)控元件構(gòu)建的四聚體構(gòu)建人工合成啟動(dòng)子，轉(zhuǎn)化合成啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)基因植物在受到病原菌脅迫時(shí)報(bào)告基因GUS的表達(dá)結(jié)果說(shuō)明，在受到不同脅迫誘導(dǎo)時(shí)，基因的表達(dá)水平和啟動(dòng)子的可誘導(dǎo)成都均有所不同[13]。同樣通過(guò)組合來(lái)自小麥的ABRE和來(lái)自大麥HVA22的ABRC調(diào)控元件，并且與Mini35S啟動(dòng)子融合構(gòu)建的合成啟動(dòng)子，轉(zhuǎn)化合成啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)基因煙草在受到高鹽、脫水和脫落酸脅迫時(shí)，報(bào)告基因GUS的表達(dá)水平均有所提高，證明構(gòu)建的人工合成啟動(dòng)子對(duì)某些逆境脅迫有響應(yīng)[14]。Liu等人通過(guò)組合對(duì)于植物防御病原菌有作用的順式調(diào)控元件構(gòu)建人工合成啟動(dòng)子，通過(guò)在轉(zhuǎn)基因擬南芥和煙草中的功能分析，在轉(zhuǎn)基因植物手病原菌、水楊酸、乙烯和茉莉酸甲酯等脅迫時(shí)，構(gòu)建的人工合成啟動(dòng)子能夠提高報(bào)告基因的表達(dá)水平[15]。

植物中合成啟動(dòng)子的研究相對(duì)較少且大多集中于誘導(dǎo)型合成啟動(dòng)子，主要利用順式調(diào)控元件融合核心啟動(dòng)子的方法構(gòu)建。Rushton 等[13]曾利用 W1-box、W2-box、GCC 元件、JERE 元件等組合成多種四聚體人工合成啟動(dòng)子。不同病原菌處理下的轉(zhuǎn)基因植株 GUS 分析結(jié)果顯示，不同啟動(dòng)子的誘導(dǎo)因子、本底表達(dá)水平和誘導(dǎo)程度均存在明顯差別。通過(guò)四拷貝小麥來(lái)源的脫落酸應(yīng)答元件(4×ABRE)或者兩拷貝脫落酸應(yīng)答元件連接兩拷貝大麥 HVA22 結(jié)合元件(2×ABRC)分別與 Mini 35S 融合發(fā)現(xiàn)，合成啟動(dòng)子能夠誘導(dǎo) GUS報(bào)告基因在轉(zhuǎn)基因煙草中對(duì)高鹽、脫水和脫落酸應(yīng)答表達(dá)，證明它們能夠作為一種有效的脅迫誘導(dǎo)啟動(dòng)子。Koschmann 等人根據(jù) 生物信息學(xué)分析結(jié)果，篩選到PathoPlant 數(shù)據(jù)庫(kù)中的擬南芥芯片數(shù)據(jù)，挑選出受病原菌誘導(dǎo)上調(diào)表達(dá)的基因，利用 BEST 軟件尋找這些基因啟動(dòng)子區(qū)的保守序列，然后與 AthaMap、PLACE 和 AGRIS 數(shù)據(jù)庫(kù)中的順式調(diào)控元件比對(duì)，挑選與已知順式調(diào)控元件的相似度低的保守序列，通過(guò)合成啟動(dòng)子的方法驗(yàn)證[14]。Liu 等人將一些與病原菌和植物防御信號(hào)分子誘導(dǎo)相關(guān)的順式調(diào)控元件與核心啟動(dòng)子融合并穩(wěn)定轉(zhuǎn)化煙草和擬南芥，對(duì)轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行病原菌、水楊酸、乙烯和茉莉酸甲酯處理，結(jié)果證實(shí)合成的誘導(dǎo)型啟動(dòng)子在轉(zhuǎn)基因煙草和擬南芥中能夠發(fā)揮預(yù)期功能[15]。

在農(nóng)業(yè)上，惡劣的環(huán)境例如干旱、高鹽和低溫等條件對(duì)作物的產(chǎn)量和產(chǎn)品質(zhì)量都有較大的影響[16]，遺傳轉(zhuǎn)化已經(jīng)成為一種重要的提高作物抗逆性的手段。合成啟動(dòng)子包含天然啟動(dòng)子區(qū)域的調(diào)控元件DNA序列，并且它們與天然啟動(dòng)子極大的不同，因?yàn)樗鼈兛梢蕴峁┳匀唤缰胁淮嬖诘谋磉_(dá)譜。合成啟動(dòng)子還可以對(duì)啟動(dòng)子中某部分序列的功能進(jìn)行分析驗(yàn)證，合成啟動(dòng)子可以通過(guò)有規(guī)律的、有目的的組合順式調(diào)控元件來(lái)構(gòu)建，合成啟動(dòng)子中順式元件的排列可以導(dǎo)致非常精確的轉(zhuǎn)基因表達(dá)，而避免了在“全長(zhǎng)”啟動(dòng)子序列內(nèi)存在的另外的元件產(chǎn)生的非特異性表達(dá)[17，18]。

轉(zhuǎn)錄因子可以調(diào)節(jié)許多抗逆基因的表達(dá)，而且在調(diào)節(jié)植物對(duì)脅迫的響應(yīng)方面發(fā)揮重要的作用，例如ABA響應(yīng)元件結(jié)合因子/ABA響應(yīng)元件家族[19]。在某些物種中，在其他脅迫響應(yīng)基因表達(dá)的條件下，基本的DREBs/CBFs基因過(guò)表達(dá)可以對(duì)干旱、高鹽、低溫等脅迫產(chǎn)生抗性[20]。同時(shí)AtMYC2和AtMYB2 cDNAs基因的過(guò)表達(dá)可以提高轉(zhuǎn)基因植物的抗逆性。然而，在正常條件下轉(zhuǎn)基因過(guò)表達(dá)會(huì)阻礙植物的生長(zhǎng)和大幅度降低作物產(chǎn)量[21，22]。有研究報(bào)道在脅迫誘導(dǎo)處理的擬南芥rd29A啟動(dòng)子的作用下，DREBs/CBFs基因的表達(dá)對(duì)植物的生長(zhǎng)可以產(chǎn)生最小的干擾，可以獲得最優(yōu)的抗逆植株[23]。并且在很多不同的轉(zhuǎn)基因植物中也得到了同樣的結(jié)論，例如馬鈴薯[24]、番茄、花生[25]、煙草[21]、大米[26]。通過(guò)組合抗逆調(diào)節(jié)序列構(gòu)建人工合成啟動(dòng)子，實(shí)現(xiàn)了在不同逆境脅迫條件下合成啟動(dòng)子在植物所有的器官和組織中的響應(yīng)，并且誘導(dǎo)基因有效的表達(dá)。

另外，合成啟動(dòng)子在早期檢測(cè)植物病原體感染方面也有重要的應(yīng)用價(jià)值。在抗病信號(hào)傳導(dǎo)途徑中，許多抗病相關(guān)基因的啟動(dòng)子區(qū)都包含一系列保守的順式作用元件，它們對(duì)植物抗病響應(yīng)的精確調(diào)控發(fā)揮著重要作用。隨著對(duì)這些順式作用元件功能的了解，可以通過(guò)組合這些有功能的元件，產(chǎn)生用于防治植物病害的誘導(dǎo)型啟動(dòng)子[27]。通過(guò)農(nóng)桿菌浸入法轉(zhuǎn)染煙草，啟動(dòng)子在相應(yīng)的植物激素處理時(shí)具有敏感性和可誘導(dǎo)性，通過(guò)擬南芥介導(dǎo)的瞬時(shí)表達(dá)體系證明合成的誘導(dǎo)型啟動(dòng)子可以對(duì)植物病原體的感染進(jìn)行早期的檢測(cè)。在作物防病抗病方面，誘導(dǎo)型啟動(dòng)子相對(duì)于天然啟動(dòng)子更有優(yōu)勢(shì)和利用價(jià)值。

4 展望

合成啟動(dòng)子在過(guò)去超過(guò)20a的時(shí)間里，在識(shí)別天然啟動(dòng)子重要的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)、和調(diào)節(jié)基因表達(dá)方面發(fā)揮著重要的作用。近年來(lái)，生物信息學(xué)的發(fā)展和大量實(shí)驗(yàn)方法與實(shí)驗(yàn)儀器的進(jìn)步，促進(jìn)了在嚴(yán)格的調(diào)控下能夠驅(qū)動(dòng)基因有效表達(dá)的高特異性啟動(dòng)子的合成。將來(lái)可以設(shè)計(jì)在病變的細(xì)胞、特異組織和感染不同病原體的細(xì)胞中有活性的啟動(dòng)子，在臨床上用于檢測(cè)和治療目前無(wú)法得到治愈的疾病。隨著生物技術(shù)的不斷發(fā)展進(jìn)步，成功的實(shí)現(xiàn)了在生物系統(tǒng)中的模擬實(shí)驗(yàn)。有研究報(bào)道目前能夠通過(guò)[28]利用計(jì)算子模型確定了造血干細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄調(diào)控模式。隨著計(jì)算機(jī)預(yù)測(cè)技術(shù)在未來(lái)的不斷發(fā)展，實(shí)現(xiàn)對(duì)啟動(dòng)子表達(dá)強(qiáng)度的預(yù)測(cè)將會(huì)成為可能。在對(duì)啟動(dòng)子的設(shè)計(jì)，選擇和利用方面將會(huì)更加合理。因此在未來(lái)構(gòu)建具有本底活性低、定向表達(dá)、啟動(dòng)表達(dá)快、表達(dá)易調(diào)節(jié)等特點(diǎn)的人工合成啟動(dòng)子，仍然是將來(lái)研究的重點(diǎn)。隨著對(duì)人工合成啟動(dòng)子研究的不斷深入與發(fā)展，人工合成啟動(dòng)子在生物制藥、農(nóng)業(yè)領(lǐng)域和開(kāi)發(fā)新的基因療法等方面將會(huì)有更加廣泛的應(yīng)用前景。

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