羅漢果內(nèi)生真菌多樣性研究

徐祥林 駱海玉 顏小捷 盧鳳來 李典鵬

摘 要：? 該文采用傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)方法結(jié)合rDNA-ITS序列分析，對(duì)我國(guó)重要藥用植物羅漢果中的內(nèi)生真菌進(jìn)行了鑒定并研究其多樣性。結(jié)果表明：采用組織培養(yǎng)法從羅漢果健康植株中共分離得到150株內(nèi)生真菌，包括羅漢果中雌株的內(nèi)生真菌96株、雄株的內(nèi)生真菌54株。122株內(nèi)生真菌經(jīng)形態(tài)學(xué)結(jié)合rDNA-ITS序列分析鑒定為9個(gè)屬，均歸屬為子囊菌門，包含座囊菌綱（Dothideomycetes）和子囊菌綱（Sordariomycetes）。其中，座囊菌綱（Dothideomycetes）真菌包含3科、3屬;子囊菌綱（Sordariomycetes）真菌包含6科、6屬。優(yōu)勢(shì)屬為刺盤孢屬（Colletotrichum）和鐮刀菌屬（Fusarium）。羅漢果雌、雄植株不同組織中內(nèi)生真菌的定殖率及分離率的變化規(guī)律均不相同，雌株中以根中內(nèi)生真菌的定殖率和分離率最高，葉片中的最低;在雄株中以葉片中的定殖率和分離率最高，根中的最低。不同菌株在雌、雄兩種植株的不同組織中的分布均不同，結(jié)合內(nèi)生真菌群落組成的相似性比較結(jié)果，表明部分內(nèi)生真菌對(duì)羅漢果雌株和雄株，以及同一植株中的不同組織均具有偏好性。不同組織中內(nèi)生真菌的多樣性指數(shù)在0.11～0.69的范圍，其中雌株根部的內(nèi)生真菌多樣性指數(shù)最高。以上研究結(jié)果為后期探究?jī)?nèi)生真菌與羅漢果互作關(guān)系奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞： 內(nèi)生真菌， 定殖率， 分離率， 相對(duì)頻率， 多樣性指數(shù)， 相似性

中圖分類號(hào)：? Q939.99

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：? A

文章編號(hào)：? 1000-3142（2020）05-0618-10

Diversity of endophytic fungi isolated from Siraitia grosvenorii

XU Xianglin1，2， LUO Haiyu1， YAN Xiaojie2， LU Fenglai2， LI Dianpeng2*

（ 1. College of Life Sciences， Guangxi Normal University， Guilin 541004， Guangxi， China; 2. Guangxi Key Laboratory of Functional Phytochemicals Research and Utilization， Guangxi Zhuang Autonomous Region and Chinese Academy of Sciences， Guangxi Institute of Botany， Guilin 541006， Guangxi， China ）

Abstract：? Involved in the biological co-existence， endophytic fungi can confer adaptative advantages to the plant host， such as enhance growth， competitiveness， and induce stress tolerance and the producing of bioactive metabolites of the host plant， displaying an important role in biocontrol of plant diseases. There are many species of endophytic fungi in plants. The identification based on amplification and sequencing analysis of ITS gene， combined with traditional morphological identification methods， could fast and effectively identify endophytic fungi. In this study， the identification as well as the diversity of endophytic fungi isolated from Siraitia grosvenorii were studied. The results were as follows： A total of 150 endophytic fungi were obtained by a tissue culture method， including 96 and 54 fungal isolates respectively isolated from pistillate plant and staminiferous plant of S. grosvenorii. Among them， 122 isolates were classified into nine genera based on the morphology identification and sequencing analysis of ITS gene， which belong to phylum Ascomycota， including Dothideomycetes and Sordariomycetes. Dothideomycetes contained three families and three genera， and Sordariomycetes contains six families and six genera. The most frequent genera were Colletotrichum and Fusarium. There were different colonization rates and isolation rates between pistillate plant and staminiferous plant of S. grosvenorii， i.e.， in the pistillate plant， the root possessed the highest colonization rate and isolation rate， while the leaves possessed the lowest. The opposite happened in staminiferous plant. Additionally， distributions of endophytic fungi were different in different tissues of both pistillate plant and staminiferous plant of S. grosvenorii. Combined with the similarities of community composition of endophytic fungi in different tissues， the results indicate that endophytic fungi have the hosts and tissues preferences. The diversity indices of endophytic fungi in different tissues ranged from 0.11 to 0.69， among which the root of pistillate plant had the highest diversity indices.

Key words： endophytic fungi， colonization rate， isolation rate， relative frequency， Shannon-Weiner（H′）， similarity

植物內(nèi)生真菌是指那些在其生活史中的某一階段或全部階段生活在健康植物組織內(nèi)，對(duì)宿主植物組織不引起明顯病害癥狀的真菌，但在植物中卻普遍存在，且與宿主植物協(xié)同進(jìn)化、互惠共生（Fe Andres et al.， 2017;Sudha et al.， 2016;Nisa et al.， 2014;Zhang et al.， 2012;Aly et al.， 2010）。一方面，內(nèi)生真菌從宿主中吸取營(yíng)養(yǎng)供自己生長(zhǎng)所需;另一方面，其產(chǎn)生的次生代謝產(chǎn)物可促進(jìn)宿主植物營(yíng)養(yǎng)吸收、提高植物抗生物逆境和非生物逆境的能力、刺激植物產(chǎn)生活性物質(zhì)等（Zhao et al.， 2011）。其是植物病蟲害生物防治領(lǐng)域的重要研究?jī)?nèi)容之一（姜道宏，2015）。植物內(nèi)生真菌種類繁多，目前對(duì)其鑒定主要是采用形態(tài)學(xué)結(jié)合分子生物學(xué)的方法。該方法克服了傳統(tǒng)的僅依賴形態(tài)、生化等表型特征來進(jìn)行鑒定而存在的諸如人為因素影響大、耗時(shí)長(zhǎng)等的局限（任燕，2018）。在分子生物學(xué)鑒定方法中，真菌核糖體中的DNA內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（internal transcribed spacer，ITS）已廣泛用于真菌屬種間的系統(tǒng)學(xué)研究。真核生物基因組中編碼rRNA的基因稱為rRNA基因或rDNA。rDNA一般由轉(zhuǎn)錄區(qū)和非轉(zhuǎn)錄區(qū)組成。轉(zhuǎn)錄區(qū)包括5S rDNA、18S rDNA、5.8S rDNA和28S rDNA，它們?cè)谌旧w上頭尾相連、串聯(lián)排列，相互之間由間隔區(qū)分隔。其中，18S rDNA、5.8S rDNA和28S rDNA基因組成一個(gè)轉(zhuǎn)錄單元，三者高度保守，可在屬、科、目水平上用于不同生物種的比較，其間的間隔區(qū)為內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)包括ITS1和ITS2兩部分，進(jìn)化相對(duì)迅速而具多態(tài)性，可用于屬內(nèi)或種內(nèi)的系統(tǒng)學(xué)研究。rDNA的ITS序列進(jìn)化速度較快且具有一定的保守性，rDNA序列分析已成為內(nèi)生真菌鑒定的常用方法（劉春來等，2007）。

羅漢果（Siraitia grosvenorii）為葫蘆科（Cucur-bitaceae）羅漢果屬（Siraitia）多年生攀援藤本植物，主要分布在廣西、廣東、湖南、江西、貴州等省（區(qū)）的部分地區(qū)，其中以廣西桂林的臨桂、永福、興安、資源、龍勝、靈川的栽培面積最大，是我國(guó)最大的羅漢果生產(chǎn)基地（閆海鋒等，2011）。羅漢果具有清熱潤(rùn)肺、保肝護(hù)肝、利咽開音、提高機(jī)體免疫功能、減低血糖、抗腫瘤、抗氧化等功效，國(guó)家衛(wèi)生部、中醫(yī)藥管理局將其列入第一批“既是食品又是藥品的品種”名單，目前已廣泛用于醫(yī)藥、保健品、食品和飲料等領(lǐng)域（張維等，2014;李典鵬和張厚瑞，2000）。根據(jù)共生理論，羅漢果內(nèi)生真菌可具有多種生物活性功能，目前對(duì)羅漢果內(nèi)生真菌的研究見有少量報(bào)道（張昌志，2018;范彩琴等，2017;蔣智，2015;付東興，2013;陳海燕等，2010，2012）。然而，羅漢果為雌雄異株植物，對(duì)內(nèi)生真菌組成的影響可能不同。因此，本研究首次對(duì)羅漢果雌、雄株各組織中的內(nèi)生真菌多樣性開展研究，對(duì)不同組織中的內(nèi)生真菌進(jìn)行分離鑒定，對(duì)內(nèi)生真菌的組成進(jìn)行分析比較，以期為研究?jī)?nèi)生真菌與羅漢果互作關(guān)系，以及其在羅漢果病害生物防治領(lǐng)域的應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 培養(yǎng)基

1.1.1 馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA） 馬鈴薯去皮200 g，葡萄糖20 g，瓊脂20 g，蒸餾水1 000 mL，pH7.0，121 ℃高溫高壓滅菌20 min。

1.1.2 玉米粉瓊脂培養(yǎng)基（CMA） 玉米粉40 g、瓊脂15 g﹑蒸餾水1 000 mL，pH7.0，121 ℃高溫高壓滅菌20 min。

1.1.3 NGA培養(yǎng)基 葡萄糖2.5 g、牛肉浸膏3.0 g、蛋白胨5.0 g、瓊脂16.0 g、121 ℃高溫高壓滅菌。

1.2 羅漢果及內(nèi)生真菌的分離

羅漢果健康植株于2017年11月采自中國(guó)科學(xué)院廣西植物研究所內(nèi)，雌雄植株各1株。采集完整植株，雌株包括根、莖、葉片和果實(shí)，雄株包括根、莖和葉片。塊根長(zhǎng)13～15 cm，藤莖長(zhǎng)2～3 m，帶深綠色葉片，果實(shí)大小約5 cm × 6 cm。材料帶回實(shí)驗(yàn)室后立即進(jìn)行內(nèi)生真菌的分離。

內(nèi)生真菌的分離參照Lou et al.（2013）、王利娟和賀新生（2006）的方法，并進(jìn)行一定改良。具體操作如下：首先，在水龍頭下以流動(dòng)水將羅漢果各組織沖洗干凈，去掉表面的泥土和灰塵;然后，用吸水紙將多余水分吸干，以75%酒精擦拭材料表面;最后，將材料轉(zhuǎn)至超凈工作臺(tái)中，以無菌剪刀結(jié)合解剖刀，將材料切割成大小約為0.5 cm × 0.5 cm的組織塊，共切取210個(gè)組織塊。每一個(gè)組織塊均依次以75%酒精消毒2 min、2%次氯酸鈉溶液消毒2 min、0.2%升汞溶液消毒5 min。每換一種消毒劑時(shí)，均先以無菌水清洗組織塊3次，再以無菌濾紙吸干多余水分;先以升汞溶液消毒完成后，再次以無菌水清洗組織塊4次。為確定消毒是否徹底，分別設(shè)置了兩組對(duì)照：其一，吸取100 μL最后一次清洗組織塊的無菌水至新鮮無菌PDA平板上，并以無菌涂布器涂布均勻;其二，采用按壓法，將消毒的組織塊放至新鮮無菌PDA平板上，稍加按壓，放置20 min后移去組織塊，每組處理設(shè)置3個(gè)平行。將以上兩種不同方法處理的對(duì)照放至培養(yǎng)箱中（26 ± 1）℃進(jìn)行培養(yǎng)，觀察有無菌落長(zhǎng)出，以明確組織塊消毒是否徹底。將所有消毒的組織塊先置于含有硫酸鏈霉素（500 μg·mL-1，以抑制細(xì)菌的生長(zhǎng)）的PDA平板上，每皿放一個(gè)組織塊，然后放至（26 ± 1）℃條件下培養(yǎng)，每天觀察有無菌落長(zhǎng)出，待有新菌落長(zhǎng)出時(shí)，將其轉(zhuǎn)接至新的PDA培養(yǎng)基，反復(fù)轉(zhuǎn)接以對(duì)其進(jìn)行純化，直至長(zhǎng)出的菌落形態(tài)完全一致。將純化后的菌株接種至PDA斜面，放置于4 ℃冰箱進(jìn)行保存。以上操作均在無菌條件下進(jìn)行。

1.3 內(nèi)生真菌的鑒定

1.3.1 形態(tài)學(xué)鑒定 采用不同培養(yǎng)基（PDA、CMA、NGA）對(duì)內(nèi)生真菌進(jìn)行培養(yǎng)，參考《真菌鑒定手冊(cè)》（魏景超，1979）、相關(guān)文獻(xiàn)以及廣西師范大學(xué)珍稀瀕危動(dòng)植物生態(tài)與環(huán)境保護(hù)省部共建教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室化學(xué)生態(tài)實(shí)驗(yàn)室已鑒定至屬種的多種內(nèi)生真菌菌株等。鑒定特征包括菌落大小、菌落及培養(yǎng)基基質(zhì)顏色、菌落形態(tài)、菌落邊緣特征、菌落生長(zhǎng)速率、菌落在顯微鏡下的特征（如菌絲有無分隔、分支，分生孢子形態(tài)、大小，產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)特征等）。

1.3.2 分子生物學(xué)鑒定 利用真核生物在rDNA的ITS區(qū)段的特性，即具保守性序列和特異性序列的特性，通過內(nèi)生真菌的rDNA-ITS序列對(duì)其進(jìn)行鑒定。采用十六烷基三甲基溴化銨法（CTAB）提取內(nèi)生真菌的總DNA，以真菌通用引物ITS1（5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′）和ITS4（5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′）擴(kuò)增菌株ITS堿基序列，委托北京六合華大基因科技有限公司武漢分公司進(jìn)行檢測(cè)純化及測(cè)序。將測(cè)序得到的結(jié)果進(jìn)行校對(duì)拼接后，登錄GenBank進(jìn)行序列比對(duì)，找出相似性高的真菌序列作為參考，采用MEGA Ⅹ以鄰接法（Neighbor-Joining，NJ）對(duì)供試菌株進(jìn)行ITS堿基序列系統(tǒng)發(fā)育分析。Bootstrap進(jìn)行自展次數(shù)為1 000的置信度檢測(cè)，根據(jù)系統(tǒng)發(fā)育樹中的組群關(guān)系對(duì)菌株進(jìn)行分類。

1.4 內(nèi)生真菌的多樣性指數(shù)統(tǒng)計(jì)分析方法

1.4.1 定殖率（colonization rate，CR） 指生長(zhǎng)內(nèi)生真菌的組織塊數(shù)量與全部樣本組織塊數(shù)量百分比，即CR（%）=（生長(zhǎng)內(nèi)生真菌的組織塊數(shù)/分離的組織塊總數(shù)）×100。

1.4.2 分離率（isolation rate，IR） 指從樣本組織塊中得到的菌株數(shù)量與全部樣本組織塊數(shù)量的比值，即IR=分離得到的內(nèi)生真菌菌株數(shù)量/分離的組織塊總數(shù)。

1.4.3 相對(duì)頻率（relative frequency，RF） 分離到某種屬內(nèi)生真菌的菌株數(shù)量占分離到的所有總菌株數(shù)量的百分?jǐn)?shù)，即RF（%）=（某種屬內(nèi)生真菌菌株數(shù)量/分離到的所有內(nèi)生真菌總菌株數(shù)）×100。

1.4.4 多樣性指數(shù)（H′） 根據(jù) Shannon-Weiner 指數(shù)公式計(jì)算，即H′ =-ki=1Pi × lnPi。式中：k指某種植物或組織中內(nèi)生真菌種類的總數(shù);Pi某種屬內(nèi)生真菌的菌株數(shù)量占分離到的所有總菌株數(shù)量的百分?jǐn)?shù)。

1.4.5 相似性系數(shù)（CS） 根據(jù)Sorenson系數(shù)公式計(jì)算，即CS=2j/（a+b）。式中： j是兩種組織中具有的相同內(nèi)生真菌種類數(shù);a是一種組織中內(nèi)生真菌的種類數(shù);b是另一組織中內(nèi)生真菌的種類數(shù)。相似性系數(shù)可以比較兩種組織之間內(nèi)生真菌種類組成的相似程度。

2 結(jié)果與分析

2.1 內(nèi)生真菌定殖率和分離率

從羅漢果的210個(gè)組織塊中共分離得到150株內(nèi)生真菌（表1）。其中，羅漢果雌株分離得到內(nèi)生真菌96株，包括根43株、莖27株、葉片9株、果實(shí)17株，四種不同組織中的內(nèi)生真菌總定殖率為根（100%）>莖（57%）>果實(shí)（30%）>葉片（13%），分離率的變化規(guī)律為根（1.43）>莖（0.9）>果實(shí)（0.57）>葉片（0.3）。羅漢果雄株分離得到內(nèi)生真菌54株，包括根9株、莖20株、葉片25株，三種不同組織的內(nèi)生真菌總定殖率為葉片（40%）>莖（30%）>根（10%），分離率的變化規(guī)律為葉（0.83）>莖（0.67）>根（0.3）。

羅漢果雌雄兩種植株中不同組織內(nèi)生真菌的定殖率及分離率的變化規(guī)律均有很大差異。在雌株中，以根中內(nèi)生真菌的定殖率和分離率最高，葉片中的最低;在雄株中，以葉片中的定殖率和分離率最高，根中的最低。

2.2 內(nèi)生真菌的組成

采用不同培養(yǎng)基（PDA、CMA、NGA）培養(yǎng)內(nèi)生真菌，通過形態(tài)學(xué)鑒定，利用五界分類系統(tǒng)，根據(jù)《真菌詞典》第10版分類系統(tǒng)，將122株菌株鑒定為9個(gè)屬，均歸屬于子囊菌門（Ascomycota）（表2），包含座囊菌綱（Dothideomycetes）和子囊菌綱（Sordariomycetes）。其中，座囊菌綱真菌包含3科、3屬，子囊菌綱真菌包含6科、6屬。從150株菌株中挑選23株代表性菌株進(jìn)行分子鑒定，將測(cè)序成功的16株菌株的ITS序列在GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行BLAST比對(duì)，相關(guān)結(jié)果及16株菌株的GenBank序列號(hào)見表3。在GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中選取相似性較高且已知種屬名的序列，采用MEGA Ⅹ以NJ法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹（圖1）分析其同源性。基于ITS序列的BLAST比對(duì)結(jié)果和系統(tǒng)進(jìn)化聚類分析，并結(jié)合形態(tài)學(xué)特征，將16株菌株CJ-3-2-2、CJ-10-2-2、CG-6、CG-6-1-2-2、CG-10-1-2-4、CG-12-1-1、CG-14-2-1、CF-1、CF-1-1-2、CF-2-1、CF-6、CF-7-1、XJ-1、XJ-1-3、XJ-1-4和XY-11-3-1分別鑒定為Colletotrichum fructicola、Colletotrichum gloeosporioides、

Acrocalymma vagum、Diaporthe sp.、Colletotrichum truncatum、Diaporthe phaseolorum、Fusarium equiseti、Colletotrichum fructicola、Sarocladium terricola、Colletotrichum truncatum、Cladosporium cladosporioides、Xylariaceae sp.、Fusarium proliferatum、Phoma sp.、Colletotrichum fructicola和Nigrospora sp.。

分子鑒定結(jié)果與形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果一致。刺盤孢屬（Colletotrichum）真菌的特征：在PDA培養(yǎng)基上，菌落主要呈棉絮狀，表面為墨綠色，背面為褐色;氣生菌絲為白色，常帶有黑色的分生孢子器和棕色的孢子液;菌落生長(zhǎng)十分迅速，25 ℃恒溫培養(yǎng)7 d時(shí)， 菌落直徑可達(dá)9 cm; 分生孢子器的數(shù)量多，球形，帶有剛毛;分生孢子為單孢，呈梭形，同時(shí)伴隨有棍棒狀的褐色附著孢子（高劍，2013）。鐮刀菌屬（Fusarium）真菌的特征：在PDA培養(yǎng)基上，菌落表面為灰白色至亮色（黃色、粉色或紫色等），背面為灰白色至淺褐色等，邊緣規(guī)則、平滑，多具有豐富的其實(shí)菌絲，呈棉絮狀;菌落生長(zhǎng)迅速，25 ℃恒溫培養(yǎng)7 d時(shí)菌落直徑可達(dá)9 cm;該屬真菌采用瓶梗式產(chǎn)孢，瓶梗無色、修長(zhǎng)，表面光滑無疣狀突起;分生孢子為全壁芽生，通常有兩種形態(tài)，即大孢子和小孢子，大孢子無色透明、呈紡錘形或鐮刀形、帶2個(gè)或2個(gè)以上的隔膜、頂細(xì)胞多半修長(zhǎng)、基部細(xì)胞呈梗狀，小孢子通常為單胞或雙胞、無色、直立或彎曲、梨形或卵圓形、比大孢子小;有時(shí)會(huì)產(chǎn)生厚垣孢子（高劍，2013）。

在分離得到的內(nèi)生真菌中，優(yōu)勢(shì)屬為刺盤孢屬（Colletotrichum）（40%）和鐮刀菌屬（Fusarium）（20%）。Colletotrichum在羅漢果雌株和雄株的各組織中均有分布，表明該菌為羅漢果中穩(wěn)定存在的內(nèi)生真菌，并且主要分布于雌株和雄株的莖中，相對(duì)頻率（RF）分別為12%和8%。其在雌株和雄株各組織中的分布變化規(guī)律有所不同，在雌株中的分布規(guī)律為莖（12%）>根（6.67%）>果實(shí)（4%）>葉片（3.33%），在雄株中的分布規(guī)律為莖（8%）>葉片（4.67%）>根（1.33%）。以上結(jié)果表明，Colletotrichum在雄根中的分布最少。Fusarium主要分布于雌株的根（7.33%）中，而在雄株的根中分布為0。其在雌株和雄株中的分布變化規(guī)律也有所不同，在雌株中RF變化規(guī)律為根（7.33%）>莖（4%）>果實(shí)（5.33%）>葉片（0.67%），在雄株中RF變化規(guī)律為葉片（2%）>莖（0.67%）>根（0）。綜上所述，優(yōu)勢(shì)屬刺盤孢屬（Colletotrichum）和鐮刀菌屬（Fusarium）在雄根中的出現(xiàn)頻率均最低。

此外，莖點(diǎn)霉屬（Phoma）（6.67%）和間座殼屬（Diaporthe）（6.67%）在羅漢果植株中出現(xiàn)頻率較高，Phoma僅分布于雌株和雄株的莖中，Diaporthe僅分布于雌株的根和莖中。其他屬如枝孢屬（Cladosporium）、Xylariaceae和Sarocladium僅分布在雌株的果實(shí)中，Acrocalymma僅分布在雌株的根中，黑孢屬（Nigrospora）僅分布于雄株的葉中。

2.3 各組織中內(nèi)生真菌的多樣性與相似性

雌株中，各組織多樣性指數(shù)大小分別為根（0.69）>莖（0.61）>果實(shí)（0.41）>葉片（0.15）（表4）;雄株中，葉片（0.35）與莖（0.35）具有相同的多樣性指數(shù)，根（0.11）中的多樣性指數(shù)相對(duì)較小。

從羅漢果雌雄株各組織中分離的內(nèi)生真菌的相似性指數(shù)范圍為0.4～0.8（表5）。由表5可知，雌株莖中的內(nèi)生真菌與雄株莖中的相似性最高，雌株的葉與雄株的莖和葉其次，而雄株的根與雌株的根、莖、果實(shí)中的內(nèi)生真菌的相似性卻最低。這表明雄株根中的內(nèi)生真菌與雌株大部分組織中的內(nèi)生真菌的差異較大。

3 討論

對(duì)于內(nèi)生真菌的鑒定及分類，隨著rDNA-ITS序列分析的興起和廣泛應(yīng)用對(duì)其具有很大的推進(jìn)作用，但這種技術(shù)仍然不能取代傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)方法，且必須以形態(tài)學(xué)為基礎(chǔ)。其主要原因如下：（1）進(jìn)行序列比對(duì)的數(shù)據(jù)庫(kù)需要不斷完善，據(jù)估計(jì)GenBank中有10%～20%的真菌序列存在錯(cuò)誤鑒定且每年不斷有新的序列提交至數(shù)據(jù)庫(kù)，而過多的相似序列會(huì)給鑒定工作帶來困難。（2）核酸的完整性和純度都會(huì)影響測(cè)序結(jié)果，當(dāng)核糖體DNA重復(fù)序列之間的純合度很高時(shí)，直接測(cè)序可以真實(shí)反映ITS區(qū)域的序列;反之，各個(gè)重復(fù)序列之間的差異較大時(shí)，采用PCR產(chǎn)物直接測(cè)定序列，可能會(huì)由于測(cè)序儀讀出多峰而導(dǎo)致無法得到正確的單一序列。（3）對(duì)于某些物種，其ITS區(qū)序列可變的程度相對(duì)不高，不足以用來分析其屬種或組群間的差異。因此，需要將ITS序列分析結(jié)果與真菌形態(tài)學(xué)特征相結(jié)合，才能更好地正確鑒定絲狀真菌（李營(yíng)等，2015;鄭冰等，2011）。本研究從羅漢果雌、雄株的不同組織中分離得到150株內(nèi)生真菌，通過形態(tài)學(xué)鑒定與ITS序列分析結(jié)合，利用五界分類系統(tǒng)，根據(jù)《真菌詞典》第10版分類系統(tǒng)，將122株菌株鑒定為9個(gè)屬，均歸屬于子囊菌門（Ascomycota），包含座囊菌綱（Dothideomycetes）和子囊菌綱（Sordariomycetes）。其中，座囊菌綱真菌包含3科3屬;子囊菌綱真菌包含6科6屬。此外，優(yōu)勢(shì)屬為刺盤孢屬（Colletotrichum）和鐮刀菌屬（Fusarium）。刺盤孢屬和鐮刀菌屬是普遍存在于植物中的內(nèi)生真菌，且刺盤孢屬和鐮刀菌屬在許多植物中也均為優(yōu)勢(shì)屬（齊靜等， 2014;Lou et al.， 2013; Durán et al.， 2005）。

雌株的內(nèi)生真菌為96株，雄株的內(nèi)生真菌為54株，其內(nèi)生真菌的總定殖率和分離率均高于雄株。目前對(duì)于雌雄異株植物內(nèi)生真菌的分離及組成分析的報(bào)道極少，賈敏等（2014）對(duì)浙江天目山地區(qū)雌雄株銀杏內(nèi)生真菌多樣性的研究發(fā)現(xiàn)，雌雄株在菌種種類和數(shù)量上存在差異，雄株銀杏內(nèi)生真菌在菌種數(shù)量上具有一定優(yōu)勢(shì)。雌、雄株內(nèi)生真菌數(shù)量的差異可能與宿主植物生理功能有關(guān)，后續(xù)還需加大樣本量采集并進(jìn)行更深入的研究。

從組織水平來看，各組織中內(nèi)生真菌的數(shù)量及種屬具有較大差異。雌株中，內(nèi)生真菌在不同組織中的定殖率和分離率大小順序均為根>莖>果實(shí)>葉片，即在雌株中，以根中內(nèi)生真菌的定殖率和分離率最高，葉片中的最低。相似的，張昌志（2018）從羅漢果的根、莖、果實(shí)中分離得到的內(nèi)生真菌的菌株數(shù)量同樣為根>莖>果實(shí)。但蔣智（2015）從羅漢果根、莖、葉、果實(shí)中分離的內(nèi)生真菌的數(shù)量大小順序?yàn)楣麑?shí)>莖>葉>根。另外，在本研究中，羅漢果雄株的內(nèi)生真菌在不同組織的內(nèi)生真菌總定殖率和分離率出現(xiàn)不同情況，其大小順序均為葉片>莖>根，即在雄株中以葉片中的定殖率和分離率最高，根中的最低。以上不同的研究結(jié)果表明，內(nèi)生真菌群落結(jié)構(gòu)受宿主植物影響，即在不同年份、不同季節(jié)、不同地點(diǎn)采集的不同的羅漢果植株，其內(nèi)生真菌的分布情況均有可能不同（羅永蘭等，2005）。另外，本研究中雌株各組織內(nèi)生真菌數(shù)量變化符合“環(huán)境影響和組織傳播”論點(diǎn)（賀超，2016;高劍，2013），即由于土壤真菌在種群豐度和外界環(huán)境上都比葉生真菌有優(yōu)勢(shì)，相對(duì)于葉片，在一定程度上增大了內(nèi)生真菌侵染率，而莖中的內(nèi)生真菌主要來自于根部，同時(shí)因?yàn)榍o生長(zhǎng)周期比葉片長(zhǎng)，這些共同因素導(dǎo)致了內(nèi)生真菌在莖中的定殖率高于葉片中的定殖率。羅漢果雄株各組織中內(nèi)生真菌的分布與此不同，可能羅漢果雄株中內(nèi)生真菌具有不同傳播機(jī)制，其內(nèi)生真菌的分布和傳播機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

不同內(nèi)生真菌在各組織中的分布均不相同。如優(yōu)勢(shì)屬Colletotrichum在羅漢果雌株和雄株的各組織中均有分布，并且主要分布于雌株和雄株的莖中，在雄根中的分布最少。Fusarium主要分布于雌株的根（7.33%）中，而在雄株的根中分布卻為0。該結(jié)果進(jìn)一步表明羅漢果雄株中內(nèi)生真菌在各組織中可能具有不同的傳播機(jī)制。

有些屬表現(xiàn)出明顯的宿主植物及組織的專一性，如Diaporthe僅分布于雌株的根和莖中，枝孢屬（Cladosporium）、Xylariaceae和Sarocladium僅分布在雌株的果實(shí)中，Acrocalymma僅分布在雌株的根中，黑孢屬（Nigrospora）僅分布于雄株的葉中。結(jié)合內(nèi)生真菌群落組成的相似性比較結(jié)果，表明部分內(nèi)生真菌對(duì)羅漢果雌株和雄株，以及同一植株中的不同組織均具有偏好性。羅漢果內(nèi)生真菌對(duì)宿主及組織的偏好性，在一定程度上造就了羅漢果內(nèi)生真菌群落的多樣性。

本研究可為羅漢果內(nèi)生真菌與宿主植物互作及宿主植物病害的生物防治研究奠定基礎(chǔ)。后期還需對(duì)更多樣本進(jìn)行研究，并對(duì)內(nèi)生真菌進(jìn)行進(jìn)一步鑒定，以及進(jìn)行內(nèi)生真菌與宿主互作等方面的研究。

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（責(zé)任編輯 蔣巧媛）