應(yīng)用微衛(wèi)星標(biāo)記評(píng)估壽光雞的保種情況

李惠龍

摘 ?要：壽光雞是國(guó)家級(jí)地方優(yōu)良品種，原產(chǎn)于山東省壽光市，具有重要的保種價(jià)值。本研究利用微衛(wèi)星標(biāo)記檢測(cè)兩個(gè)不同保種場(chǎng)壽光雞群體的遺傳多樣性，評(píng)估群體遺傳資源現(xiàn)狀和保種場(chǎng)的保種效果。結(jié)果表明：在來(lái)自山東壽光慈倫種雞養(yǎng)殖場(chǎng)與中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院家禽遺傳資源與育種試驗(yàn)基地的兩個(gè)壽光雞群體中，5個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記共有等位基因53個(gè)，各微衛(wèi)星標(biāo)記的等位基因數(shù)為8～15;2個(gè)群體中5個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)的平均多態(tài)信息含量（polymorphism information content，PIC）分別為0.543 和0.465，平均雜合度（heterozygosity， H）分別為0.601 和0.523，說(shuō)明各群體的遺傳多樣性較為豐富;2個(gè)群體間相似性系數(shù)為0.9678，Nei氏遺傳距離為0.0328，UPGMA聚類結(jié)果將2個(gè)群體聚為1類，與白洛克群體明顯分開(kāi)，表明2個(gè)群體遺傳相似性很高。研究表明兩個(gè)不同保種場(chǎng)的壽光雞的保種效果良好，但在遺傳多樣性上仍然存在一定差別，可能是保種群體大小和保種方法的不同所致，為壽光雞這一地方品種的保種提供了部分參考與依據(jù)。

關(guān)鍵詞：微衛(wèi)星;壽光雞;保種;雜合度（H）;多態(tài)信息含量（PIC）;聚類分析

中圖分類號(hào)：S813.1 ? ?文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：B ? ? 文章編號(hào)：1673-1085（2020）5-0003-05

我國(guó)擁有品種眾多、分布廣泛的地方雞種，其遺傳多樣性非常豐富。但由于保種的方法不當(dāng)，以及盲目引進(jìn)外來(lái)品種與地方品種進(jìn)行雜交，造成了我國(guó)許多優(yōu)秀的地方雞種的數(shù)量和種類大量減少，對(duì)地方雞種遺傳資源的檢測(cè)與管理亟待加強(qiáng)。壽光雞是國(guó)家級(jí)地方優(yōu)良品種，原產(chǎn)于山東省壽光市，屬肉蛋兼用型。壽光雞具有耐粗飼、覓食力強(qiáng)、遺傳性穩(wěn)和抗病力強(qiáng)的特點(diǎn)，是著名的山東地方雞種。早在1960年，國(guó)家就在山東省壽光市慈倫種雞場(chǎng)建立了保種場(chǎng)以保護(hù)壽光雞。中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)于2000年從山東省壽光市慈倫種雞場(chǎng)引進(jìn)了一批壽光雞進(jìn)行保種。兩個(gè)群體分別在不同地區(qū)、不同飼養(yǎng)條件下進(jìn)行活體保種，本研究擬對(duì)兩個(gè)壽光雞群體的群體結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，同時(shí)了解其保種效果。

微衛(wèi)星（microsatellite），又稱簡(jiǎn)單序列重復(fù)（simple sequence repeats，SSR），一般以1～6個(gè)堿基為核心序列，首尾相連組成的串聯(lián)重復(fù)序列。微衛(wèi)星具有高度的多態(tài)性和保守性，重復(fù)性好，等位基因數(shù)目多，呈等顯性遺傳，并且檢測(cè)方便等特點(diǎn)[1]。目前已開(kāi)發(fā)出大量的微衛(wèi)星標(biāo)記，并廣泛用于畜禽遺傳圖譜的構(gòu)建、基因定位、群體遺傳結(jié)構(gòu)分析等研究。本研究擬利用微衛(wèi)星標(biāo)記分析壽光雞在不同保種場(chǎng)的群體結(jié)構(gòu)，分析其遺傳多樣性及保種效果，為地方雞保種選育與利用提供科學(xué)依據(jù)。

1 ?材料與方法

1.1 ?試驗(yàn)材料 ?試驗(yàn)所用壽光雞分別來(lái)自山東省壽光市慈倫種雞養(yǎng)殖場(chǎng)與中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院家禽遺傳資源與育種試驗(yàn)基地，每個(gè)場(chǎng)各選取60只雞，在本試驗(yàn)中分別記為壽光-SG、壽光-CAU，選取60只白洛克作為參考群體。每只雞翅下靜脈采血1mL，置于盛有EDTA抗凝劑的離心管中。使用血液基因組DNA提取試劑盒（天根生化科技有限公司，北京），并按其說(shuō)明書(shū)步驟提取每只雞的基因組DNA，用1.0%凝膠電泳檢測(cè)DNA完整度，使用分光光度計(jì)DS-11 測(cè)定濃度。

1.2 ?微衛(wèi)星引物篩選及PCR擴(kuò)增 ?根據(jù)參考文獻(xiàn)[2-3]中提供的雞微衛(wèi)星序列及引物，選擇出ADL267、LEI194、MCW295、MCW34、LEI228 5個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記進(jìn)行分析。微衛(wèi)星位點(diǎn)信息見(jiàn)表1。

PCR反應(yīng)體系（20μL）：10×Taq Buffer 2.5 μL，上下游引物（5pmol/L）各0.2μL，Taq DNA聚合酶0.125μL，dNTP（0.2mmol/L）2μL，DNA（50ng/μL）2μL，ddH2O補(bǔ)齊至20μL。PCR擴(kuò)增反應(yīng)程序如下：95℃預(yù)變性5min，94℃變性30s，52～64℃退火35s，72℃延伸40s，共35個(gè)循環(huán)，72℃延伸10min。

PCR產(chǎn)物檢測(cè)：采用ABI3730XL DNA分析儀對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行毛細(xì)管電泳，檢測(cè)片段大小信息，上樣總體積10μL，其中上樣液Hi-Di Formamide （高質(zhì)量的去離子甲酞胺）7.5μL，GS-500標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)參0.5μL，混合PCR擴(kuò)增產(chǎn)物2μL。

1.3 ?數(shù)據(jù)分析 ?通過(guò)GeneMapperV4.1軟件分析各目標(biāo)片段大小，判斷純合子或雜合子;利用Microsatellite-Toolkit算等位基因數(shù)、等位基因頻率、雜合度（heterozygosity，H）、多態(tài)信息含量（polymorphism information content，PIC）。利用 Popgene32V1.31軟件對(duì)3個(gè)雞群體間的Nei氏遺傳距離和遺傳相似性進(jìn)行分析，根據(jù)遺傳距離，采用UPGMA法進(jìn)行聚類。

2 ?結(jié)果與分析

2.1 ?微衛(wèi)星標(biāo)記的等位基因及基因頻率 ?各微衛(wèi)星標(biāo)記在不同群體中均表現(xiàn)出不同的多態(tài)性，結(jié)果見(jiàn)表2～6。每個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記的平均等位基因數(shù)為10.60，平均有效等位基因數(shù)為3.46。各微衛(wèi)星標(biāo)記的等位基因數(shù)為8～15，5個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記共有等位基因53個(gè)。位點(diǎn)LEI228的等位基因最多，共15個(gè);而位點(diǎn)ADL267、MCW295、MCW34的等位基因均為8個(gè)。各標(biāo)記等位基因數(shù)在各群體間是有差異的，等位基因數(shù)相同的標(biāo)記其等位基因的基因頻率也是不同的。

2.2 ?群體內(nèi)多態(tài)信息含量與雜合度 ?壽光-SG、壽光-CAU與白洛克這3個(gè)群體的多態(tài)信息含量（PIC）如表7所示。對(duì)于所有群體，各位點(diǎn)的PIC平均為0.648;遺傳信息含量最低的是壽光-CAU，為0.465;最高的是白洛克，為0.704。壽光-SG與白洛克屬于高度多態(tài)（PIC>0.5），壽光-CAU屬于中度多態(tài)（0.25

群體雜合度（H）表示在被檢測(cè)基因座上群體中雜合子的頻率，它是群體雜合程度的度量單位。群體平均雜合度的大小反映了群體的遺傳一致性程度。群體的雜合度越小，反映該群體的遺傳一致性越高，而群體的遺傳變異程度就越低，群體的遺傳多樣性越差。壽光-SG的雜合度為0.601，壽光-CAU的雜合度為0.523，白洛克雜合度為0.746。白洛克的雜合度最高，而壽光-CAU群體雜合度最低，見(jiàn)表7。

2.3 ?群體間的遺傳變異分析

2.3.1 ?遺傳距離和遺傳相似系數(shù) ?遺傳距離與遺傳相似系數(shù)均是反應(yīng)群體遺傳變異的指標(biāo)[4]。遺傳距離表示群體間的遺傳差異，遺傳相似系數(shù)主要表示群體間的相似程度，遺傳距離越小，其遺傳相似系數(shù)越大。

由表4可以看出，壽光-SG、壽光-CAU與白洛克的遺傳距離較大，分別為0.4132和0.4691，而2個(gè)壽光雞群體之間的遺傳距離為0.0328，遠(yuǎn)小于壽光雞與白洛克的Nei氏遺傳距離。遺傳相似系數(shù)方面，壽光-SG與壽光-CAU相似系數(shù)為0.9678。

2.3.2 ?聚類分析 ?根據(jù)群體間遺傳距離，使用UPGMA方法構(gòu)建系統(tǒng)聚類圖1。

從聚類的結(jié)果（圖1）可以看出，壽光雞的2個(gè)群體聚在一起，而被用于對(duì)照的白洛克則單獨(dú)成為一類。這進(jìn)一步說(shuō)明了壽光-SG、壽光-CAU這兩個(gè)群體的遺傳關(guān)系很近，并與遺傳背景差異較大的白洛克相比形成了差異。

3 ?討論

微衛(wèi)星通常應(yīng)用于物種遺傳多樣性分析、保種效果監(jiān)測(cè)、雜種優(yōu)勢(shì)預(yù)測(cè)等方面，能夠反映群體內(nèi)的遺傳變異情況，同時(shí)也可以作為群體間的劃分依據(jù)。在家禽的相關(guān)研究中，王利剛等利用微衛(wèi)星標(biāo)記對(duì)13個(gè)鴨品種進(jìn)行了遺傳多樣性分析[5]，反映了我國(guó)各地方鴨種的遺傳多樣性差異;方倩倩等（2016）利用微衛(wèi)星標(biāo)記對(duì)我國(guó)太湖鵝進(jìn)行了保種效果的檢測(cè)[6];黃勛和（2017）以嶺南黃雞為參照，利用微衛(wèi)星位點(diǎn)檢測(cè)貴妃雞和麒麟雞的遺傳多樣性，并評(píng)估了群體遺傳資源現(xiàn)狀[7]。研究發(fā)現(xiàn)，在配套系鑒定的微衛(wèi)星選擇過(guò)程中，使用ADL267、LEI194、MCW295、MCW34、LEI228、ADL172 6個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記所獲得的群體遺傳結(jié)構(gòu)與使用20個(gè)微衛(wèi)星所得到的結(jié)果類似，這6個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記可以將不同品系進(jìn)行區(qū)分[3]。這說(shuō)明本研究所選用的微衛(wèi)星標(biāo)記有能力鑒定出家禽的不同品系和分析群體遺傳結(jié)構(gòu)，可以用于壽光雞保種效果的鑒定。

本研究利用5對(duì)微衛(wèi)星標(biāo)記分析來(lái)自山東省壽光市慈倫種雞養(yǎng)殖場(chǎng)與中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院家禽遺傳資源與育種試驗(yàn)基地兩個(gè)壽光雞群體的遺傳多樣性和保種情況。一般認(rèn)為，PIC大于0.5，說(shuō)明群體遺傳多樣性較高，反之則較低[8]。本次研究結(jié)果顯示壽光-SG（山東省壽光市慈倫種雞場(chǎng)）的位點(diǎn)平均為高度多態(tài)（PIC>0.5），壽光-CAU（中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)）的位點(diǎn)平均為中度多態(tài)（0.25

兩個(gè)壽光雞群體均具有比較豐富的遺傳多樣性，說(shuō)明山東省壽光市慈倫雞場(chǎng)與中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院家禽遺傳資源與育種試驗(yàn)基地的保種效果良好。此前有研究認(rèn)為，兩個(gè)品系間的遺傳距離小于0.030時(shí)，可以將其視為一個(gè)同一品系[9]。中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院家禽遺傳資源與育種試驗(yàn)基地的壽光雞是2000年左右從山東省壽光市慈倫種雞場(chǎng)引進(jìn)，經(jīng)過(guò)15年的隔離，兩壽光雞群體間的遺傳距離為0.0328，遺傳相似系數(shù)為0.9678。兩個(gè)壽光雞群體間的遺傳距離遠(yuǎn)小于甘肅省靜寧縣和寧夏回族自治區(qū)固原市的2個(gè)靜原雞群體間的遺傳距離0.0876[10-11]。在一個(gè)有限的閉鎖群體內(nèi)，群體的近交系數(shù)將隨著繁育世代的增加而逐漸上升，群體基因雜合度將存在一定程度地下降，群體內(nèi)的遺傳變異或遺傳多樣性逐漸降低[12]。因此雖然兩個(gè)壽光雞群體雖然來(lái)源相同，但其多態(tài)信息含量與雜合度有所不同，這可能是由群體大小和保種方法的差異造成的。兩群體基因交流可能會(huì)更有利于壽光雞的保種。

4 ?結(jié)論

本研究利用ADL267、LEI194、MCW295、MCW34、LEI228 5個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記分析了來(lái)自山東省壽光市慈倫種雞養(yǎng)殖場(chǎng)與中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院家禽遺傳資源與育種試驗(yàn)基地的壽光雞的遺傳結(jié)構(gòu)、群體間的遺傳變異情況，一方面表明了壽光雞群體遺傳多樣性豐富，具有較高的保種價(jià)值;另一方面表明兩地的保種情況均能有效保護(hù)壽光雞的遺傳多樣性，同一品種的異地保種可以為品種的保護(hù)與利用提供了方法借鑒。

（致謝：感謝中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院家禽遺傳資源與育種試驗(yàn)基地友情提供樣品。）

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Abstract：Shouguang Chicken is a national-level local variety，native to Shouguang city， Shandong province，with important conservation value.This study used microsatellite markers to detect the genetic diversity of two different groups of Shouguang Chicken，to assess the status of population genetic resources and the conservation efficacy of the species.The results showed that 5 microsatellite markers had 53 alleles in two Shouguang Chicken populations from the Shandong Shouguang Cilun Chicken Breeding Farm and the College of Animal Science and Technology，China Agricultural University，the number of alleles of each microsatellite marker was 8～15，and the average of 5 microsatellite loci in 2 populations was average.The average polymorphism information content （PIC） of 5 microsatellite markers in the 2 populations were 0.543 and 0.465 respectively，and the average heterozygosity （H） were 0.601 and 0.523，respectively，which indicated that the genetic diversity of the two populations was relatively abundant;the similarity coefficient between the 2 populations was 0.9678，Nei's genetic distance was 0.0328，and the UPGMA clustering results gathered 2 groups into 1 groups，indicating that the genetic similarity of the 2 populations is very high.The study shows that the 2 different populations of Shouguang chicken have effectual preservation，but there are still some differences in genetic diversity，which may be the result of the difference between the size of the species and the method of preserving.It provides some reference and basis for the preservation of this local species of Shouguang chicken.

Key words：Microsatellites;Shouguang chicken;Breed conservation;Heterozygosity（H）;Polymorphism information content（PIC）; Cluster analysis