高效液相色譜-四極桿/飛行時(shí)間高分辨質(zhì)譜測定化妝品中的西咪替丁及雷尼替丁

王 聰，董 喆，李 莉，王海燕，孫 磊

(中國食品藥品檢定研究院，北京 100050)

組胺是人體內(nèi)源性物質(zhì)，化學(xué)名為4(5)-(2-氨乙基)咪唑，呈堿性。組胺受體有H1、H2、H3亞型，均為G蛋白偶聯(lián)受體，受體激活后通過G蛋白介導(dǎo)，作用于蛋白激酶引發(fā)生物學(xué)反應(yīng)[1]。西咪替丁和雷尼替丁為組胺H2受體拮抗藥物，能有效降低胃酸，臨床可用于消化性潰瘍的治療。此外，由于該類組胺受體拮抗劑能競爭雙氫睪酮受體，阻斷雙氫睪酮與受體的結(jié)合，抑制皮脂分泌，因此可與其他抗菌類、激素類等藥物聯(lián)用治療痤瘡等皮膚病[2-3]。由于《化妝品安全技術(shù)規(guī)范》(2015年版)的禁用組分列表以及禁用組分檢測方法中未包含西咪替丁、雷尼替丁，使得這兩種藥物具有較強(qiáng)的隱蔽性，因而被一些不法商販非法加入到化妝品中，以達(dá)到祛痘、平滑肌膚等作用[4]。在化妝品中非法添加此類藥物，可能危害使用者的健康。

目前國內(nèi)外關(guān)于西咪替丁、雷尼替丁的檢測方法主要有高效液相色譜法[5]、氣相色譜法[6]、毛細(xì)管電泳法[7]、熒光探針法[8]。高分辨質(zhì)譜技術(shù)的應(yīng)用和發(fā)展，推動(dòng)了禁限用物質(zhì)篩查方法的研究。與上述檢測方法相比，高分辨質(zhì)譜具有更強(qiáng)的抗基質(zhì)干擾和高通量檢測能力，可有效區(qū)分混合物，簡化前處理過程，對(duì)色譜的分離要求較低[9]。將四極桿質(zhì)譜和飛行時(shí)間質(zhì)譜串聯(lián)，可對(duì)準(zhǔn)分子離子和子離子的精確質(zhì)量數(shù)進(jìn)行分析，比三重四極桿質(zhì)譜具有更高的分辨率和更好的選擇性[10]。

本研究建立了一種高效液相色譜-四極桿/飛行時(shí)間高分辨質(zhì)譜測定化妝品中2種組胺H2受體拮抗藥物西咪替丁和雷尼替丁的方法，基于其化學(xué)結(jié)構(gòu)，提出了含柔性連接鏈類和二元芳環(huán)或芳雜環(huán)類的組胺H2受體拮抗劑經(jīng)碰撞誘導(dǎo)解離的裂解規(guī)律。該方法可同時(shí)完成定性篩查和定量分析，為發(fā)現(xiàn)、識(shí)別和檢測該類組胺受體拮抗劑提供了研究基礎(chǔ)，有利于對(duì)樣品中未知組胺受體拮抗劑進(jìn)行篩查和確證。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器、試劑與材料

1290高效液相色譜儀串聯(lián)6540四極桿/飛行時(shí)間質(zhì)譜儀，配雙噴霧電噴霧離子源Dual-ESI(美國安捷倫科技公司)；AL204電子分析天平(萬分之一)、XP205電子分析天平(十萬分之一)均購于瑞士梅特勒-托利多公司；arium pro超純水系統(tǒng)(德國賽多利斯公司)。

西咪替丁標(biāo)準(zhǔn)品(99.8%)、鹽酸雷尼替丁標(biāo)準(zhǔn)品(99.9%)，購于中國食品藥品檢定研究院；甲醇、乙腈(色譜純，美國賽默飛世爾公司)；甲酸(質(zhì)譜純，美國賽默飛世爾公司)。祛痘類化妝品購自網(wǎng)店和線下商店。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液：分別取西咪替丁、雷尼替丁標(biāo)準(zhǔn)品約10 mg，精密稱定，置于10 mL容量瓶中，加入甲醇溶解并定容，得到質(zhì)量濃度約為1 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，于-20 ℃保存。

混合標(biāo)準(zhǔn)溶液：將標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液用甲醇稀釋，得到質(zhì)量濃度為5、10、20、50、100 ng/mL的系列混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。

1.3 色譜條件

色譜柱：Zorbax SB-Aq柱(3.0 mm×100 mm，1.8 μm，美國安捷倫科技公司)；柱溫為30 ℃；進(jìn)樣體積為2 μL；流速為0.3 mL/min；流動(dòng)相：A為含0.1%甲酸的水溶液，B為乙腈，梯度洗脫程序：0～6.0 min，5%～90% B；6.0～9.0 min，90% B；9.0～9.1 min，90%～5% B；9.1～12 min，5% B。

1.4 質(zhì)譜條件

采集模式：正離子模式；離子源：雙噴霧電噴霧離子源(Dual-ESI源)，檢測時(shí)同時(shí)導(dǎo)入?yún)⒈入x子對(duì)儀器質(zhì)量軸進(jìn)行實(shí)時(shí)校正，參比離子的m/z為121.050 9和922.009 7；干燥氣溫度：350 ℃；干燥氣流速：10 L/min；毛細(xì)管電壓：3 500 V；錐孔電壓：65 V，碰撞氣：氮?dú)狻Ｓ萌珤呙?Scan)模式對(duì)準(zhǔn)分子離子[M+H]+進(jìn)行確認(rèn)后，進(jìn)一步對(duì)其進(jìn)行碰撞誘導(dǎo)解離(CID)，將樣品的二級(jí)質(zhì)譜圖與標(biāo)準(zhǔn)品圖譜進(jìn)行比對(duì)和確證。

1.5 樣品制備

取樣品約0.5 g，精密稱定，置于25 mL比色管中，加入20 mL甲醇，在渦旋振蕩儀上混勻30 s后超聲提取20 min，靜置至室溫，用甲醇定容，搖勻，提取液經(jīng)0.22 μm 濾膜過濾后分析。必要時(shí)用適量甲醇對(duì)樣品進(jìn)行稀釋后測定。

1.6 篩查分析方法

通過安捷倫MassHunter工作站的數(shù)據(jù)采集軟件對(duì)樣品進(jìn)行全掃描，用定性分析軟件對(duì)采集的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，同時(shí)對(duì)保留時(shí)間和精確質(zhì)量數(shù)進(jìn)行檢索，軟件打分80分以上認(rèn)為匹配成功，作為疑似陽性樣品進(jìn)行二級(jí)碎片離子掃描。若經(jīng)二級(jí)碎片離子掃描確證為陽性樣品，進(jìn)一步用定量分析軟件對(duì)其進(jìn)行定量。

2 結(jié)果與討論

2.1 儀器條件的優(yōu)化

2.1.1 色譜條件的優(yōu)化分別考察了BEH C18(2.1 mm×100 mm,1.7 μm)、HSS T3(2.1 mm×100 mm,1.8 μm)和Zorbax SB-Aq(3.0 mm×100 mm,1.8 μm)3種色譜柱對(duì)西咪替丁和雷尼替丁的分離效果，結(jié)果表明，目標(biāo)化合物在BEH C18色譜柱上拖尾較明顯，在HSS T3和Zorbax SB-Aq色譜柱上的峰形對(duì)稱，可選擇HSS T3和Zorbax SB-Aq色譜柱或其等效色譜柱進(jìn)行檢測。本實(shí)驗(yàn)選擇Zorbax SB-Aq色譜柱進(jìn)行分析。

實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)在不同時(shí)間檢測時(shí)，西咪替丁和雷尼替丁的保留時(shí)間變化較大，將同一標(biāo)準(zhǔn)品放置12 h后進(jìn)行測定時(shí)，保留時(shí)間與放置前相差約1.5 min，這可能與西咪替丁和雷尼替丁對(duì)流動(dòng)相的pH值變化敏感有關(guān)?？紤]到西咪替丁和雷尼替丁的胺基易接受H+形成[M+H]+的準(zhǔn)分子離子，在水相中加入適量的H+，利于有機(jī)胺類向其共軛酸轉(zhuǎn)化形成質(zhì)子化形式，一方面可提高質(zhì)譜分析的離子化效率，另一方面可使液相色譜的保留時(shí)間穩(wěn)定。在脂肪族的一元羧酸中，甲酸的酸性最強(qiáng)[11]，因此考察了流動(dòng)相水相中加入不同含量甲酸的分離效果，結(jié)果表明，當(dāng)水相中甲酸含量為0.1%時(shí)，西咪替丁和雷尼替丁的保留時(shí)間穩(wěn)定且響應(yīng)良好。最終選擇含0.1%甲酸的水溶液與乙腈作為流動(dòng)相。

2.1.2 質(zhì)譜條件的優(yōu)化定性分析：高分辨質(zhì)譜通過對(duì)二級(jí)碎片離子指紋圖譜的比對(duì)進(jìn)行定性，考察了碰撞能量為10～40 eV時(shí)西咪替丁和雷尼替丁的母離子及碎片離子豐度比。結(jié)果表明，當(dāng)碰撞能量為10 eV時(shí)，二者的母離子被碰撞誘導(dǎo)解離的程度較低(相對(duì)豐度比高于80%)；當(dāng)碰撞能量≥20 eV時(shí)，母離子基本完全被碰撞誘導(dǎo)解離(相對(duì)豐度比小于1%)，且碰撞能量為20 eV時(shí)，西咪替丁和雷尼替丁的主要碎片離子具有較高的相對(duì)豐度，可提高定性分析時(shí)子離子比對(duì)的準(zhǔn)確性。相對(duì)豐度為西咪替?。簃/z95.060 7(100%),m/z159.069 8(73%)；雷尼替?。簃/z176.049 0(100%),m/z130.055 8(61%)。因此，選擇碰撞能量為20 eV。

定量分析：與低分辨質(zhì)譜不同，高分辨質(zhì)譜的定量分析可選擇用母離子或子離子[12-17]，由于母離子的響應(yīng)更強(qiáng)，且一級(jí)全掃描具有更快的速度，因此選用母離子進(jìn)行定量分析。西咪替丁的定量離子為m/z253.123 5，雷尼替丁的定量離子為m/z315.149 1。

2.2 方法學(xué)考察

2.2.1 空白實(shí)驗(yàn)分別取甲醇、空白基質(zhì)提取液按優(yōu)化的色譜條件和質(zhì)譜條件進(jìn)行測定，結(jié)果表明空白基質(zhì)中西咪替丁和雷尼替丁的提取色譜圖均無干擾。

2.2.2 線性范圍分別用甲醇、空白基質(zhì)配制質(zhì)量濃度為5、10、20、50、100 ng/mL的溶劑標(biāo)準(zhǔn)工作溶液和基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，以西咪替丁、雷尼替丁的質(zhì)量濃度(x，ng/mL)為橫坐標(biāo)，對(duì)應(yīng)峰面積(y)為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性擬合。結(jié)果表明，西咪替丁和雷尼替丁分別在5.65～113 ng/mL和4.95～99.0 ng/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)r>0.999(見表1)。

2.2.3 檢出限與定量下限采用本方法對(duì)基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)工作溶液進(jìn)行測定，以信噪比分別為3、10時(shí)樣品的質(zhì)量濃度作為方法的檢出限和定量下限。結(jié)果表明，西咪替丁的檢出限和定量下限分別為1.1、5.6 ng/mL，雷尼替丁的檢出限和定量下限分別為0.99、5.0 ng/mL。當(dāng)取樣量為0.5 g時(shí)，西咪替丁的檢出濃度和定量濃度分別為0.057、0.28 μg/g，雷尼替丁的檢出濃度和定量濃度分別為0.050、0.25 μg/g。

2.2.4 基質(zhì)效應(yīng)質(zhì)譜分析時(shí)，基質(zhì)中的共提取物可能會(huì)對(duì)西咪替丁和雷尼替丁產(chǎn)生抑制或增強(qiáng)作用，影響結(jié)果的準(zhǔn)確性。本實(shí)驗(yàn)采用標(biāo)準(zhǔn)曲線測定法對(duì)基質(zhì)效應(yīng)進(jìn)行考察，通過空白基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率與溶劑標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率的比值(簡稱斜率比)進(jìn)行評(píng)價(jià)，若斜率比<100%，則表示基質(zhì)對(duì)分析物存在抑制作用；若斜率比>100%，則表示基質(zhì)對(duì)分析物存在增強(qiáng)作用；若斜率比=100%，則表示不存在基質(zhì)效應(yīng)。當(dāng)斜率比為80%～120%時(shí)，表明基質(zhì)干擾作用較小[18]。對(duì)液態(tài)水基、乳液、膏霜類化妝品的基質(zhì)效應(yīng)進(jìn)行了考察，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，乳液、膏霜類基質(zhì)對(duì)西咪替丁、雷尼替丁的測定干擾作用較小，液態(tài)水基類基質(zhì)對(duì)測定具有一定程度的抑制作用(見表1)。本實(shí)驗(yàn)采用基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線外標(biāo)法進(jìn)行定量分析，以消除或降低基質(zhì)效應(yīng)的影響。

表1 西咪替丁與雷尼替丁的回歸方程、相關(guān)系數(shù)、線性范圍及基質(zhì)效應(yīng)Table 1 Regression equations,correlation coefficients,linear ranges and matrix effects for cimetidine and ranitidine

2.2.5 回收率與重復(fù)性通過標(biāo)準(zhǔn)加入法，在液態(tài)水基、膏霜、乳液空白基質(zhì)中分別加入標(biāo)準(zhǔn)溶液，按樣品制備方法，對(duì)低、中、高濃度水平的待測樣品進(jìn)行加標(biāo)回收率考察，實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線外標(biāo)法進(jìn)行定量分析。其中，西咪替丁的加標(biāo)濃度分別為11.3、56.4、90.2 ng/mL，雷尼替丁的加標(biāo)濃度分別為9.90、49.5、79.2 ng/mL。結(jié)果表明，在不同基質(zhì)中西咪替丁和雷尼替丁的回收率為86.7%～110%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為0.90%～6.0%。另制備6份低濃度平行樣品，測定目標(biāo)化合物的含量，對(duì)方法重復(fù)性進(jìn)行考察，RSD 均小于10%。低濃度樣品放置3 d，每天檢測1次，日間精密度RSD不大于8.5%(見表2)。

表2 不同基質(zhì)中的回收率(n=3)、重復(fù)性(n=6)及日間精密度(n=3)Table 2 Recoveries(n=3),repeatability(n=6) and inter-day precision(n=3)of cimetidine and ranitidine spiked to different matrix samples (%)

圖1 西咪替丁和雷尼替丁的結(jié)構(gòu)Fig.1 Structures of cimetidine and ranitidine

2.3 裂解規(guī)律解析

根據(jù)化學(xué)結(jié)構(gòu)不同，組胺H2受體拮抗劑可分為含柔性連接鏈類和二元芳環(huán)或芳雜環(huán)類。西咪替丁和雷尼替丁均屬于含柔性連接鏈類結(jié)構(gòu)[1]，結(jié)構(gòu)通式為：氫鍵鍵合的極性基團(tuán)—柔性鍵—芳環(huán)(見圖1)。對(duì)西咪替丁和雷尼替丁主要碎片離子(相對(duì)豐度比>50%)的精確質(zhì)量數(shù)(見表3、圖2)及分子離子式進(jìn)行分析，推斷西咪替丁和雷尼替丁的裂解規(guī)律。

西咪替丁的分子式為C10H16N6S，在正離子模式下獲得質(zhì)子，形成C10H17N6S的準(zhǔn)分子離子(精確質(zhì)量數(shù)為253.123 0)，經(jīng)碰撞誘導(dǎo)解離，與芳雜環(huán)連接的一側(cè)柔性鍵斷裂，形成C5H11N4S(精確質(zhì)量數(shù)為159.069 9)及C5H7N2(精確質(zhì)量數(shù)為95.060 4)的離子。C5H11N4S離子可在極性基團(tuán)一側(cè)發(fā)生斷裂，即圖1中與X連接的鍵斷裂，脫去NCNH2后形成C4H9N2S的離子(精確質(zhì)量數(shù)為117.048 1)。

雷尼替丁的分子式為C13H22N4O3S，在正離子模式下獲得質(zhì)子，形成C13H23N4O3S的準(zhǔn)分子離子(精確質(zhì)量數(shù)為315.148 5)。雷尼替丁的分子式中有3個(gè)O原子，分布在柔性連接—S—的兩側(cè)，分別為芳雜環(huán)上的1個(gè)O原子和極性基團(tuán)末端—NO2中的2個(gè)O原子。依據(jù)分子離子式中O原子的數(shù)量可對(duì)裂解途徑進(jìn)行輔助判斷。準(zhǔn)分子離子C13H23N4O3S被碰撞誘導(dǎo)解離后—S—與芳雜環(huán)連接的鍵斷裂，脫去芳雜環(huán)分子C8H13NO，形成C5H10N3O2S的離子(精確質(zhì)量數(shù)為176.048 8)，該離子進(jìn)一步脫去1分子NO2，形成C5H10N2S的離子(精確質(zhì)量數(shù)為130.055 9)。

上述裂解途徑表明，西咪替丁及雷尼替丁的準(zhǔn)分子離子經(jīng)碰撞誘導(dǎo)解離后，與芳雜環(huán)連接的一側(cè)柔性鍵易發(fā)生斷裂，脫去芳雜環(huán)分子，形成—S—與極性基團(tuán)連接的離子，該離子末端的含N基團(tuán)隨后發(fā)生斷裂(見表3)。對(duì)裂解規(guī)律的研究有利于發(fā)現(xiàn)、識(shí)別和檢測該類組胺受體拮抗劑，為化妝品中含柔性連接鏈類結(jié)構(gòu)的組胺H2受體拮抗劑的非靶向篩查提供依據(jù)。

表3 西咪替丁和雷尼替丁主要碎片離子的精確質(zhì)量數(shù)Table 3 Exact mass numbers of main fragment ions for cimetidine and ranitidine

圖2 西咪替丁(A)和雷尼替丁(B)的二級(jí)碎片離子質(zhì)譜圖Fig.2 Secondary fragment ion mass spectra of cimetidine(A) and ranitidine(B)

2.4 樣品測定

在銷售環(huán)節(jié)采購祛痘類化妝品51批，對(duì)其中的西咪替丁和雷尼替丁進(jìn)行篩查和確證。經(jīng)高效液相色譜-四極桿/飛行時(shí)間高分辨質(zhì)譜進(jìn)行全掃描，用MassHunter定性分析軟件對(duì)樣品中母離子的精確質(zhì)量數(shù)及保留時(shí)間與標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行匹配，發(fā)現(xiàn)有3批樣品中西咪替丁的保留時(shí)間差在±0.2 min，母離子精確質(zhì)量數(shù)誤差在20 ppm以內(nèi)，疑似為西咪替丁陽性樣品。根據(jù)2002/657/EC準(zhǔn)則[19]對(duì)于質(zhì)譜方法4個(gè)識(shí)別點(diǎn)的規(guī)定，高分辨質(zhì)譜的母離子為2個(gè)識(shí)別點(diǎn)，子離子為2.5個(gè)識(shí)別點(diǎn)，即只要找到母離子及1個(gè)子離子或找到2個(gè)子離子即可對(duì)目標(biāo)化合物進(jìn)行確證。因此進(jìn)一步對(duì)疑似陽性樣品進(jìn)行二級(jí)碎片離子全掃描，在20 eV的碰撞能量下，將陽性樣品的二級(jí)碎片指紋圖譜與標(biāo)準(zhǔn)圖譜進(jìn)行比對(duì)(圖3)，在樣品中至少可找到2個(gè)西咪替丁的子離子與標(biāo)準(zhǔn)品一致，例如二者中均存在m/z95.060 4、117.047 9、159.069 6碎片離子，確證為陽性樣品。對(duì)3批陽性樣品進(jìn)行定量分析，其中1批西咪替丁的含量高于檢出限，低于定量下限，另2批樣品中西咪替丁的含量分別為6.67 mg/g、10.6 mg/g。51批樣品均未檢出雷尼替丁。采用液相色譜-三重四極桿質(zhì)譜對(duì)51批樣品進(jìn)行定性和定量分析，結(jié)果與本方法一致。

圖3 西咪替丁陽性樣品(A)與標(biāo)準(zhǔn)品(B)的比對(duì)譜圖Fig.3 Comparison of mass spectra for cimetidine positive samples(A) and standard(B)

3 結(jié) 論

本文采用高效液相色譜-四極桿/飛行時(shí)間高分辨質(zhì)譜建立了化妝品中西咪替丁及雷尼替丁的測定方法。應(yīng)用高分辨質(zhì)譜技術(shù)，不僅前處理方法簡單、儀器掃描速度快，且無需標(biāo)準(zhǔn)品即可完成定性篩查和確證，提高了實(shí)驗(yàn)效率，節(jié)約了實(shí)驗(yàn)成本。此外，本文對(duì)西咪替丁和雷尼替丁的裂解規(guī)律進(jìn)行了研究，提出碰撞誘導(dǎo)解離的可能路線，為化妝品中抗組胺類化合物的非靶向篩查提供了研究基礎(chǔ)，也為化妝品安全監(jiān)管提供了技術(shù)支持。