基于質(zhì)譜特征碎裂片段的乳制品中真菌毒素非定向篩查方法研究

賈 瑋，樊子便 ，杜 安，石 琳，許牡丹，儲曉剛,2

(1.陜西科技大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院，陜西 西安 710021；2.中國檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院，北京 100123)

真菌毒素是霉菌在生長繁殖過程中在一定環(huán)境下產(chǎn)生的二次代謝有毒產(chǎn)物，按產(chǎn)毒素的菌種主要分為曲霉菌屬、青霉菌屬、鐮孢菌屬、麥角菌屬四大類，所產(chǎn)生的毒素主要包括黃曲霉毒素類、赭曲霉毒素類、玉米赤霉烯酮類、伏馬毒素類、脫氧雪腐鐮刀菌烯醇類、麥角堿類，飼料為養(yǎng)殖環(huán)節(jié)的主要污染源之一[1-2]。流行病學(xué)研究顯示，黃曲霉毒素B1與肝癌發(fā)生密切相關(guān)，已被國際衛(wèi)生組織國際癌癥研究總署確認(rèn)為A類致癌物質(zhì)[3-4]。近年來，隨著我國乳品行業(yè)的發(fā)展和消費(fèi)者食品安全意識的增強(qiáng)，乳品安全問題越來越受到關(guān)注，亟待發(fā)展真菌毒素的高通量非定向篩查分析方法[5]。

乳制品中真菌毒素的檢測方法主要有酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)、色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法等[6]，其中酶聯(lián)免疫法具有特異性強(qiáng)、靈敏度高、前處理簡單、易于推廣等優(yōu)點(diǎn)，但此法存在一定的假陽性與假陰性[7-9]。目前，我國頒布的《GB 5009.24-2016 食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中黃曲霉毒素M族的測定》等真菌毒素檢測國家標(biāo)準(zhǔn)采用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜實(shí)現(xiàn)了食品中真菌毒素的準(zhǔn)確定量分析，但受限于不同類別分析時色譜-質(zhì)譜的差異，無法實(shí)現(xiàn)多類別真菌毒素的高通量定性定量分析[10-11]。因此建立乳制品中真菌毒素非定向篩查檢測方法具有重要的現(xiàn)實(shí)意義和應(yīng)用價值，也符合國家食品安全發(fā)展方向[12-14]。超高效液相色譜-高分辨質(zhì)譜將液相良好的分離能力、精確質(zhì)量數(shù)與可提供溯源信息等優(yōu)勢相結(jié)合，具有高通量、高選擇性、高靈敏度等優(yōu)勢，適用于多種目標(biāo)化合物的篩查和確證分析[15-16]。

本研究采用超高效液相色譜-四極桿-靜電場軌道離子阱質(zhì)譜的數(shù)據(jù)依賴型掃描模式，對38種典型真菌毒素標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)化合物色譜信息、分子離子和二級碎裂片段進(jìn)行采集，建立了真菌毒素標(biāo)準(zhǔn)數(shù)據(jù)庫并完成裂解途徑解析與特征碎裂片段篩選；采用數(shù)據(jù)非依賴掃描，獲取可追溯的樣品質(zhì)譜信息，構(gòu)建了乳制品中真菌毒素的非定向篩查方法。該方法具有前處理簡單、分析時間短、靈敏度較高以及定性定量可靠的優(yōu)勢，可滿足乳制品中安全風(fēng)險(xiǎn)突發(fā)事件快速應(yīng)急處理工作中高通量、高可靠性確證和定量分析的要求，能夠?yàn)槠髽I(yè)及監(jiān)管部門提供有力的技術(shù)支撐。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 材料、試劑與儀器

巴氏殺菌乳、超高溫瞬時滅菌乳、含乳飲料與嬰幼兒配方乳粉購于當(dāng)?shù)爻校?.22 μm微孔濾膜(美國Pall公司)；C18吸附劑(粒徑為40～60 μm，60 ?平均孔徑)、PSA吸附劑(粒徑為40～60 μm，60 ?平均孔徑)、陶瓷均質(zhì)石(美國Agilent Technologies公司)；無水硫酸鎂和無水乙酸鈉為優(yōu)級純(美國Supelco公司)；乙腈、甲醇、甲酸、乙酸、甲酸銨均為色譜純，購自美國Sigma公司；38種真菌毒素標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)購于英國LGC Standards公司和瑞士Fluka公司。

高速冷凍離心機(jī)(美國Beckman Coulter公司)；Vortex.Genie2T型旋渦混合器(美國Scientific Industries公司)；超聲波清洗器(江蘇昆山超聲儀器有限公司)；分析天平(瑞士Mettler Toledo公司)；ED-115型恒溫干燥箱(德國Binder公司)；超高效液相色譜-四極桿-靜電場軌道離子阱質(zhì)譜(美國Thermo Fisher Scientific公司)；Milli-Q Integral型純水儀(美國Millipore公司)。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

稱取真菌毒素標(biāo)準(zhǔn)品各1.0 mg(精確至0.01 mg)，分別置于10 mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容，配成單標(biāo)儲備液，于-20 ℃避光保存。精密移取單標(biāo)儲備液各1 mL于100 mL容量瓶中，用甲醇-水(體積比1∶1)稀釋并定容，配成質(zhì)量濃度均為1 mg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，于-20 ℃棕色密閉瓶中避光保存。

1.3 樣品前處理

對于乳粉等粉狀樣品，稱取嬰幼兒配方乳粉3.0 g(精確至0.01 g)于50 mL具塞聚苯丙烯離心管中，加入(45±5) ℃的超純水(20 mL)后渦旋振蕩使其充分混勻。分別稱取混勻的巴氏殺菌乳、超高溫瞬時滅菌乳、含乳飲料和已溶解的嬰幼兒配方乳粉試樣各15 g(精確至0.01 g)，于50 mL具塞聚苯丙烯離心管中，加入10 mL乙酸-乙腈-水(體積比1∶84∶15)混合溶液，渦旋混合30 s后加入6.0 g無水硫酸鎂、1.45 g無水乙酸鈉與陶瓷均質(zhì)石，再次渦旋30 s，振蕩提取1 min，然后在4 ℃以10 000 r/min離心5 min，移取8 mL上層溶液于預(yù)先加有405 mg C18、108 mg PSA及1.2 g無水硫酸鎂的離心管中，高速渦旋30 s,在4 ℃以10 000 r/min條件下離心5 min。移取上清液過0.22 μm有機(jī)系微孔濾膜，取200 μL濾液至2 mL進(jìn)樣小瓶中后加入300 μL甲醇及500 μL 8 mmol/L甲酸銨水溶液，采用超高效液相色譜-四極桿-靜電場軌道離子阱質(zhì)譜測定。

1.4 基質(zhì)匹配溶液的配制

移取乳制品前處理提取液12份各5 mL于10 mL容量瓶中，氮吹至近干，分別加入真菌毒素標(biāo)準(zhǔn)品混合溶液10、20、40、80、100、200、400、800、1 000、2 000、4 000、5 000 μL于該容量瓶中，各加入5 mL甲醇后，用8 mmol/L甲酸銨水溶液定容，配成1.0、2.0、4.0、8.0、10、20、40、80、100、200、400、500 μg/L的基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液，用于標(biāo)準(zhǔn)校正曲線的繪制。

1.5 分析條件

色譜條件：Accucore C-18 aQ預(yù)柱(10 mm×2.1 mm，1.9 μm)和Hypersil Gold C-18 aQ柱(100 mm×2.1 mm，1.9 μm，美國Thermo Fisher Scientific公司)，柱溫：35 ℃；流動相：A為0.1%(體積分?jǐn)?shù))甲酸-4 mmol/L甲酸銨水溶液，B為0.1%(體積分?jǐn)?shù))甲酸-4 mmol/L甲酸銨甲醇溶液；梯度洗脫程序：0～1 min，100% A；1～7 min，100%～ 0% A；7～12 min,0% A；12～13 min，0%～100% A，13～15 min，100% A，流速為300 μL·min-1，進(jìn)樣量5 μL。

質(zhì)譜條件：電噴霧離子化(ESI)，采用正模式；鞘氣流速18 L/min，鞘氣壓力275 kPa，輔助氣流速3 L/min；毛細(xì)管電壓：正離子模式3 500 V；負(fù)離子模式3 000 V；離子源溫度：50 ℃；毛細(xì)管溫度：320 ℃。全掃描模式(Full scan)，分辨率設(shè)定70 000 FWHM，自動增益控制的目標(biāo)值(AGC)定為1.0×107，容許質(zhì)量誤差范圍5 ppm，最大注入時間250 ms，動態(tài)背景扣除(Dynamic exclusion)設(shè)定為10.0 s。

全掃描/數(shù)據(jù)依賴掃描模式(Full MS/dd-MS2)參數(shù)：分辨率為17 500 FWHM，自動增益控制的目標(biāo)值定為5.0×106，出峰后的觸發(fā)時間(Apex trigger)為3～6 s，最大注入時間120 ms，動態(tài)背景扣除為10.0 s，選擇TOP 5模式。待碎裂的目標(biāo)分析物在特定的信息列表(Inclusion list)中設(shè)定，容許質(zhì)量誤差范圍設(shè)定為10 ppm。當(dāng)待碎裂的離子響應(yīng)強(qiáng)度達(dá)到強(qiáng)度閾值8.3×104時，即送往高能碰撞解離(HCD)碰撞池，通過3個不同的碰撞能量分別進(jìn)行碰撞，最終疊加得到一張子離子譜圖，碰撞能量分別為17.5、35.0、52.5 eV。

可變的數(shù)據(jù)非依賴采集Variable Data Independent Acquisition(vDIA)參數(shù)：掃描時間0～15 min；自動增益控制的目標(biāo)值設(shè)定為5.0×106，最大注入時間為120 ms；分辨率采用17 500 FWHM；信息列表分為：112.801 16、137.812 53、162.823 90、187.835 27、212.846 63、237.858 00、262.869 37、287.880 74、312.892 11、337.903 48、362.914 85、387.926 22、412.937 58、437.948 95、462.960 32、487.971 69、550.500 11、650.545 59、750.591 06、850.636 54，其中112.801 16～487.971 69設(shè)定為第一個vDIA掃描，隔離窗口范圍(Isolation window)設(shè)為25.0 Da，Loop Count設(shè)定為16(即16個掃描段)，550.500 11～850.636 54設(shè)為第二個vDIA掃描，動態(tài)背景扣除10.0 s，隔離窗口范圍設(shè)為100.0 Da，Loop Count設(shè)定為4。碰撞能量分別為17.5、35.0、52.5 eV。

2 結(jié)果與討論

2.1 數(shù)據(jù)庫的建立

同類真菌毒素分子存在結(jié)構(gòu)及質(zhì)譜碎裂方式的共性。將標(biāo)準(zhǔn)溶液逐級稀釋配成質(zhì)量濃度為500 μg/L用于標(biāo)準(zhǔn)數(shù)據(jù)庫的信息采集。首先運(yùn)用Full MS/dd-MS2掃描模式采集真菌毒素標(biāo)準(zhǔn)品的MS/MS譜圖。其次，從實(shí)驗(yàn)譜圖中記錄各個碎片離子的分子離子主要離子化形式(響應(yīng)最高)質(zhì)荷比(理論值)、二級碎裂片段質(zhì)荷比與保留時間等信息?；诿糠N真菌毒素的碎裂途徑和各個碎片離子間的相對強(qiáng)度，選擇豐度比較高且大于10%、同時可用于區(qū)分同類別化合物的碎片作為定量信息(表1)[17-18]。構(gòu)建了MS/MS譜圖數(shù)據(jù)庫，數(shù)據(jù)庫包括黃曲霉毒素類(黃曲霉毒素M1、黃曲霉毒素G2、黃曲霉毒素G1、黃曲霉毒素B2、黃曲霉毒素B1)、赭曲霉毒素類(α-赭曲霉毒素、赭曲霉毒素B、赭曲霉毒素A)、玉米赤霉毒素類(β-玉米赤霉烯醇、α-玉米赤霉烯醇、α-玉米赤霉醇、玉米赤霉酮、玉米赤霉烯酮、β-玉米赤霉醇)、伏馬毒素類(伏馬毒素B3、伏馬毒素B2)、鐮刀菌毒素類(雪腐鐮刀菌烯醇、脫氧雪腐鐮刀菌烯醇、葡萄糖苷化嘔吐毒素、鐮刀菌烯酮X、去環(huán)氧-脫氧雪腐鐮刀菌烯醇、3-乙酰基脫氧雪腐鐮刀菌烯醇、15-乙?；撗跹└牭毒┐?、麥角堿類(田麥角堿、麥角克堿、麥角辛、麥角異柯寧堿、麥角異卡里堿、雙氫麥角汀)、其他類(黃綠青霉素、雜色曲毒霉素、鈣激活鉀通道阻斷劑、T-2四醇、青霉酸、T-2三醇、騰毒素、橘毒素、HT-2毒素)共38種真菌毒素的正、負(fù)離子掃描模式和多種加合物形式([M+H]+、[M+NH4]+、[M+HCOO]-、[M-H]-)合計(jì)95張譜圖。

表1 38種真菌毒素的標(biāo)準(zhǔn)數(shù)據(jù)庫信息Table 1 Standard database information for 38 mycotoxins

(續(xù)表1)

No.CompoundCASMolecular formulaRetention time/minPrecursor(m/z)Ionization modeFragment 1(m/z)Fragment 2(m/z)28Penicilic Acid(青霉酸)90-65-3C8H10O45.0171.065 19[M+H]+C7H7O+3(139.032 56)C7H11O+2(127.077 89)293-Acetyldeoxynivalenol(3-乙?；撗跹└牭毒┐?50722-38-8C17H22O75.4339.143 83[M+H]+C14H15O+3(231.101 13)C8H9O+2(137.059 81)3015-Acetyldeoxynivalenol(15-乙?；撗跹└牭毒┐?88337-96-6C17H22O75.4356.170 38[M+NH4]+C16H33O+6(321.133 26)C13H15O+2(203.106 45)31T-2 Triol(T-2三醇)34114-98-2C20H30O76.3400.232 98[M+NH4]+C15H21O+5(281.137 91)C12H29O+3(221.113 32)32Ergocorninine(麥角異柯寧堿)564-37-4C31H39N5O56.5560.287 842 8[M-H]-C16H16N3O-(266.120 90)C16H15N3O-(265.120 41)33HT-2 Toxin(HT-2毒素)26934-87-2C22H32O86.8442.243 54[M+NH4]+C16H35O+6(323.110 48)C14H17O+3(233.110 71)34Ergocryptinine(麥角異卡里堿)511-10-4C32H41N5O56.8576.318 05[M+H]+C20H22N3O+(320.175 64)C16H18N3O+(268.138 12)35Beta-Zearalanol(β-玉米赤霉醇)42422-68-4C18H26O56.8323.185 30[M+H]+C18H27O+5(323.188 44)C12H13O+2(189.091 03)36Dihydroergocristine(雙氫麥角汀)17479-19-5C35H41N5O56.7612.318 05[M+H]+C21H24N3O+2(350.177 42)C16H20N3O+(270.166 59)37Tentoxin(騰毒素)28540-82-1C22H30O4N46.8413.219 43[M-H]-C10H+15(135.117 20)C9H+13(121.102 01)38Citrinin(橘霉素)518-75-2C13H14O56.4249.076 85[M-H]-C6H7O+5(159.028 32)C8H+13(109.102 29)

2.2 特征碎裂片段篩選及其在真菌毒素殘留篩查中的應(yīng)用

圖1 黃曲霉毒素G1的四極桿-靜電場軌道離子阱質(zhì)譜圖Fig.1 Quadrupole-orbitrap mass spectrum of aflatoxin G1

2.2.1 斷裂途徑與機(jī)理研究實(shí)驗(yàn)研究了38種真菌毒素的碎裂機(jī)理，得到了所有片段的質(zhì)譜裂解反應(yīng)途徑。以黃曲霉毒素G1(Aflatoxin G1)為例，其dd-MS2譜圖如圖1所示。

圖2 黃曲霉毒素G1的碎裂機(jī)理示意圖Fig.2 Fragmentation mechanism of aflatoxin G1

表2 真菌毒素特征碎裂片段Table 2 Characteristic fragmentations of mycotoxins

2.2.3 特征碎裂片段在真菌毒素篩查中的應(yīng)用將特征碎裂片段與真菌毒素標(biāo)準(zhǔn)數(shù)據(jù)庫相結(jié)合應(yīng)用于乳制品中真菌毒素的非定向篩查。運(yùn)用Full MS/vDIA掃描模式，采用表2中真菌毒素特征碎裂片段的精確質(zhì)量數(shù)提取并分析呈正態(tài)分布的色譜峰；比對真菌毒素的標(biāo)準(zhǔn)數(shù)據(jù)庫信息，判斷該物質(zhì)的歸屬類別之后通過其質(zhì)荷比、同位素豐度比、片段豐度比等質(zhì)譜信息及碎裂途徑，推斷其元素組成和分子結(jié)構(gòu)式。最后利用標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的色譜質(zhì)譜信息進(jìn)行確證和定量。目標(biāo)物濃度由乳制品中真菌毒素化合物與標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的峰面積比乘以標(biāo)準(zhǔn)物濃度計(jì)算而得。例如，在篩查乳及其制品中的真菌毒素時運(yùn)用外源性風(fēng)險(xiǎn)物質(zhì)特征碎裂片段m/z494.348 25提取出呈正態(tài)分布且在標(biāo)準(zhǔn)信息庫中沒有的色譜峰(其質(zhì)譜圖見圖3)。通過質(zhì)荷比、同位素豐度比、片段豐度比信息推斷該物質(zhì)分子式為CxHyNOz,將豐度較高的片段與真菌毒素標(biāo)準(zhǔn)信息庫的其他化合物斷裂途徑進(jìn)行對比，發(fā)現(xiàn)該未知化合物與伏馬毒素B2、伏馬毒素B3的碎裂片段斷裂機(jī)理相似(圖4)，通過對譜圖與標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)比對分析，判斷該化合物為伏馬毒素B1，最終定量濃度為0.11 μg/kg。

2.3 基質(zhì)效應(yīng)

乳制品基質(zhì)復(fù)雜，在電噴霧離子化模式下化合物的質(zhì)譜響應(yīng)易受基質(zhì)干擾，因此實(shí)驗(yàn)通過繪制純?nèi)軇?biāo)準(zhǔn)溶液和空白基質(zhì)提取液匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液的標(biāo)準(zhǔn)曲線來判斷基質(zhì)效應(yīng)的強(qiáng)弱。基質(zhì)效應(yīng)按公式計(jì)算：C%=(1-Ss/Sm)×100；式中，C%為基質(zhì)效應(yīng)；Ss為純?nèi)軇┡渲频哪繕?biāo)化合物標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率；Sm為空白基質(zhì)配制的目標(biāo)化合物標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率。|C%|在20%以內(nèi)為較弱基質(zhì)效應(yīng)，在20%～50%為中等基質(zhì)效應(yīng)，50%～100%為強(qiáng)基質(zhì)效應(yīng)。結(jié)果顯示，38種真菌毒素中大部分化合物存在基質(zhì)效應(yīng)，其中10.5%屬于中等強(qiáng)度的基質(zhì)效應(yīng)，86.8%為較弱基質(zhì)效應(yīng)，其余的少數(shù)真菌毒素屬于強(qiáng)基質(zhì)效應(yīng)。為盡量降低基質(zhì)效應(yīng)干擾，建立校準(zhǔn)曲線時，混合標(biāo)準(zhǔn)溶液采用基質(zhì)匹配法配制，以最大限度地消除基質(zhì)效應(yīng)對于靈敏度和準(zhǔn)確性的影響。

2.4 方法學(xué)考察

方法學(xué)參數(shù)依據(jù)歐盟標(biāo)準(zhǔn)2002/657/EC[26]與SANCO/12571/2013[27]。結(jié)果表明，檢測方法中外源性風(fēng)險(xiǎn)物質(zhì)在各自濃度范圍內(nèi)呈良好的線性，相關(guān)系數(shù)(r2)均大于0.99。本實(shí)驗(yàn)中檢出限與定量下限通過確定限(CCα)和檢測容量(CCβ)進(jìn)行考察和表征。CCα指等于和高于此值時，用α誤差概率計(jì)算得出，認(rèn)為所測樣品不符合規(guī)定的結(jié)論限度；CCβ指用β誤差概率檢測、鑒別、定量得到的樣品中物質(zhì)的最低含量，CCβ數(shù)值等于CCα取值時重現(xiàn)性標(biāo)準(zhǔn)偏差的1.64倍與CCα數(shù)值之和。CCα采用校準(zhǔn)曲線法測定，向乳及乳制品基質(zhì)中等距離梯度添加真菌毒素混合標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，分別以添加濃度與峰面積為坐標(biāo)繪圖，CCα數(shù)值為可觀察到響應(yīng)時縱坐標(biāo)軸上的濃度值與對應(yīng)的重現(xiàn)性標(biāo)準(zhǔn)偏差的2.33倍之和。計(jì)算得CCα和CCβ分別為0.01～0.36 μg/kg與0.03～0.57 μg/kg。在基質(zhì)中添加低、中、高3個水平的真菌毒素系列混合標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)溶液，經(jīng)樣品前處理后，運(yùn)用四極桿-軌道離子阱質(zhì)譜檢測，計(jì)算得平均回收率與相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)分別為81.9%～111%和1.1%～6.1%(表3)，所建立的方法準(zhǔn)確性和精密度良好。

表3 巴氏殺菌乳中38種真菌毒素的線性范圍、確定限、檢測容量、相關(guān)系數(shù)、平均回收率及相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=6)Table 3 Linear ranges,decision limits,detection capabilities,correlation coefficients(r2),recoveries and RSDs of 38 mycotoxin in pasteurised milk(n=6)

2.5 實(shí)際樣品檢測

采用所建立的方法篩查40個批次巴氏殺菌乳、超高溫瞬時滅菌乳、含乳飲料與嬰幼兒配方乳粉中的真菌毒素，其中一個巴氏殺菌乳樣品中檢出伏馬毒素B1，含量為0.11 μg/kg，未超過我國國家限量標(biāo)準(zhǔn)《GB 2761-2017 食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中真菌毒素限量》[28]。

3 結(jié) 論

本文建立了基于超高效液相色譜-四極桿-軌道離子阱質(zhì)譜技術(shù)的乳制品中常見真菌毒素的快速識別和定量方法，使用dd-MS2與vDIA兩種二級掃描模式分析了真菌毒素特征斷裂片段，獲得了真菌毒素標(biāo)準(zhǔn)數(shù)據(jù)庫并完成裂解途徑解析和特征碎裂片段篩選，獲取了可追溯的樣品質(zhì)譜信息，最終實(shí)現(xiàn)了乳制品中真菌毒素的非定向篩查。方法學(xué)考察及實(shí)際樣品的檢測證明該方法具有靈敏度高、選擇性強(qiáng)、質(zhì)量精確度高的特點(diǎn)，方法的檢出限、回收率及精密度滿足國內(nèi)外標(biāo)準(zhǔn)的要求，適用于多組分真菌毒素低含量殘留的定量檢測與定性確證，能夠?yàn)槠髽I(yè)及相關(guān)安全監(jiān)管部門提供有力的技術(shù)支撐。