頭穴叢刺法聯(lián)合川芎嗪對大鼠腦梗死后神經(jīng)元突觸重建的影響*

韓 慧,賴智勇,蒲建萍,劉玉珍

1.四川衛(wèi)生康復(fù)職業(yè)學(xué)院臨床醫(yī)學(xué)系 (自貢 643000);2.四川省自貢市第一人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科(自貢 643000)

腦梗死所致神經(jīng)系統(tǒng)障礙相關(guān)研究為業(yè)界關(guān)注熱點(diǎn)。研究認(rèn)為[1]，急性腦梗死“治療窗”短暫，但因神經(jīng)結(jié)構(gòu)及自愈可塑性特點(diǎn)，神經(jīng)元突觸可在腦梗死發(fā)病較長時(shí)間內(nèi)調(diào)節(jié)改善，讓梗死患者神經(jīng)功能恢復(fù)成為可能[2]。故神經(jīng)可塑性調(diào)節(jié)亦成為腦梗死靶點(diǎn)治療主要研究方向。彭艷等[3]研究，神經(jīng)元突觸、星形膠質(zhì)細(xì)胞與腦梗死神經(jīng)功能恢復(fù)有著密切關(guān)聯(lián)。而中醫(yī)將腦梗死歸納“中風(fēng)”范疇，且經(jīng)歷代醫(yī)家積累豐富的腦血管疾病治療經(jīng)驗(yàn)，中藥及穴位針刺方案成為腦梗死神經(jīng)功能恢復(fù)優(yōu)勢方案，如川芎嗪、頭穴叢刺法等方案對腦梗死患者神經(jīng)功能恢復(fù)效果受到眾醫(yī)師認(rèn)可[4-5]。但對于川芎嗪聯(lián)合頭穴叢刺法促進(jìn)腦梗死神經(jīng)功能恢復(fù)的神經(jīng)行為學(xué)及神經(jīng)細(xì)胞變化機(jī)制尚未明晰。對此，本研究以大腦中動脈閉塞(Middle cerebral artery occlusion,MCAO)腦梗死模型大鼠為研究對象，探析頭穴叢刺法與川芎嗪對大鼠腦梗死后神經(jīng)元突觸重建的影響。

材料與方法

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動物：SD大鼠，雄性，周齡7～8周，體重200～280 g，平均(225±23)g，購自上海杰思捷實(shí)驗(yàn)動物有限公司，許可證號：SCXK(滬)2018-0004。

1.2 試劑：鹽酸川芎嗪，購自以嶺藥業(yè)(石家莊)股份有限公司，國藥準(zhǔn)字H20063094，規(guī)格2 ml：40 mg。0.9%氯化鈉溶液購自濱湖雙鶴藥業(yè)有限公司，多聚甲醛(4%)購自拜意爾(武漢)生物科技有限公司。兔抗人突觸素抗體、膠質(zhì)纖維酸性蛋白(Glial fibrillary acidic protein,GFAP)單克隆抗體均購自Sigma公司。

1.3 儀器：BH-2型光學(xué)顯微鏡購自日本 OLYMPUS 公司，CH型投射電鏡購自日本 OLYMPUS 公司。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 動物分組、模型備制及給藥：取72只雄性SD大鼠，標(biāo)準(zhǔn)繁殖飼料喂養(yǎng)，環(huán)境溫度22 ℃，相對濕度50%～60%，自適應(yīng)喂養(yǎng)3 d，于MCAO造模術(shù)前12 h禁食，以線栓改良法行大腦中動脈阻斷，包括頸總動脈分離、頸內(nèi)外動脈、剪斷頸外動脈并經(jīng)頸外動脈插管注入栓子，造成局部腦梗死。模型備制成功標(biāo)準(zhǔn)：SD大鼠蘇醒，行走呈偏左旋轉(zhuǎn)，提尾懸空上肢無法向前伸，肢體疼痛收縮反應(yīng)遲緩，伴或不伴“Horner征”。成功備制MCAO腦梗死模型后分為：A組18只(MCAO模型對照)，B組18只(頭穴叢刺法)，C組18只(川芎嗪)，D組18只(頭穴叢刺法+川芎嗪)。B組、D組取百會及穴位鄰近左側(cè)與右側(cè)2 mm處針刺；C組、D組以鹽酸川芎嗪注射液20 mg/(kg·d)；A組以同劑量0.9%氯化鈉溶液注射。持續(xù)干預(yù)28 d，行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.2 神經(jīng)元突觸、星形膠質(zhì)細(xì)胞個(gè)數(shù)觀察：于MCAO建模7、14、28 d各組均取6只SD大鼠處死，腦組織取材，經(jīng)70%～100%酒精脫水，浸蠟、包埋、切片、染色，CH型投射電鏡下，8200倍視野，取20個(gè)觀察區(qū)域，計(jì)算神經(jīng)元突觸、星形膠質(zhì)細(xì)胞個(gè)數(shù)。

2.3 突觸素、GFAP檢測：于MCAO建模7、14、28 d各組均取6只SD大鼠處死，腦組織取材，免疫組織化學(xué)SP染色制切片，按照兔抗人突觸素抗體、GFAP操作參照說明書執(zhí)行，BH-2型光學(xué)顯微鏡下評估突觸素、GFAP相關(guān)蛋白含量。

結(jié) 果

1 各組神經(jīng)元突觸、星形膠質(zhì)細(xì)胞個(gè)數(shù)比較 隨時(shí)間增長，各組神經(jīng)元突觸、星形膠質(zhì)細(xì)胞個(gè)數(shù)均有增長，其中B、C、D組增長明顯(P<0.05)；14 d、28 d D組神經(jīng)元突觸、星形膠質(zhì)細(xì)胞增長個(gè)數(shù)顯著高于A、B、C組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，其次B、C組14 d、28 d 神經(jīng)元突觸、星形膠質(zhì)細(xì)胞增長個(gè)數(shù)顯著高于A組(P<0.05)，B、C兩組7、14、28 d均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

表1 各組神經(jīng)元突觸、星形膠質(zhì)細(xì)胞比較(個(gè))

注：與A組比較,*P<0.05;與B組比較,#P<0.05;與C組比較,△P<0.05

2 各組突觸素、GFAP表達(dá)比較 隨時(shí)間增長，各組突觸素、GFAP表達(dá)均有提高，其中B、C、D組增長明顯，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；14 d、28 d D組突觸素、GFAP表達(dá)顯著高于A、B、C組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，其次B、C組14 d、28 d 突觸素、GFAP表達(dá)顯著高于A組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，B、C兩組7、14、28 d均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

表2 各組突觸素、GFAP表達(dá)比較(μm2)

注：與A組比較,*P<0.05;與B組比較,#P<0.05;與C組比較,△P<0.05

討 論

據(jù)調(diào)查[6]，國內(nèi)腦梗死發(fā)病率為100/10萬人，且超過80%因急性缺血性卒中所致。腦梗死可致失語、意識障礙、運(yùn)動障礙、偏癱等神經(jīng)功能損傷癥狀，嚴(yán)重影響患者生存質(zhì)量；同時(shí)腦梗死亦為國內(nèi)死亡主要病因[7]。故怎樣改善腦梗死患者神經(jīng)功能損傷癥狀成為臨床研究熱點(diǎn)。大量研究證實(shí)[8-11]，中醫(yī)療法在缺血性腦梗死相關(guān)疾病及神經(jīng)功能改善方面優(yōu)勢明顯。劉崢等[12]指出，中藥川芎成分提取物川芎嗪在缺血性腦損傷方面療效確切，可通過抗炎、拮抗Ca2+離子，清除氧自由基，調(diào)控凋亡蛋白及調(diào)節(jié)神經(jīng)可塑性等多個(gè)環(huán)節(jié)降低腦梗死損傷。針灸亦是世界衛(wèi)生組織(WHO)認(rèn)可且推薦的腦梗死神經(jīng)功能恢復(fù)主要方案之一。徐飛等[13]結(jié)合腦梗死“津血同源”生化病因機(jī)制及“缺血半暗帶”神經(jīng)可塑性論點(diǎn)，提出頭穴叢刺之法，以頭穴刺激調(diào)節(jié)氣血，活絡(luò)益髓，調(diào)節(jié)陰陽。王建勛等[14]認(rèn)為，針刺百會穴可抑制腦梗死組織脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，減少氧自由基生應(yīng)激，提高腦組織細(xì)胞存活率。黃金等[15]研究，針刺可促進(jìn)梗死區(qū)域組織血運(yùn)循環(huán)，提升神經(jīng)細(xì)胞增殖效率，促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)的恢復(fù)。但關(guān)于頭穴叢刺之法聯(lián)合中藥成分川芎嗪對腦梗死神經(jīng)突出重建的相關(guān)機(jī)制研究尚未明晰。故本研究以SD大鼠建立MCAO腦梗死模型，評估頭穴叢刺之法聯(lián)合中藥成分川芎嗪在腦梗死神經(jīng)元突觸及星形膠質(zhì)細(xì)胞的恢復(fù)促進(jìn)影響，為中醫(yī)療法治療腦梗死及神經(jīng)功能重建作用機(jī)理提供客觀依據(jù)。

本研究中，MCAO腦梗死模型備制，經(jīng)川芎嗪、頭穴叢刺干預(yù)后，SD大鼠神經(jīng)元突觸、星形膠質(zhì)細(xì)胞個(gè)數(shù)均明顯增加，且隨治療期間增長逐步增多；其中又屬川芎嗪聯(lián)合頭穴叢刺組改善情況最顯著。分析機(jī)理可知，川芎嗪在活血(擴(kuò)張血管)、化瘀(抑制血小板聚集)方面效果明顯，改善腦梗死區(qū)域微環(huán)境，間接保護(hù)腦頂葉皮質(zhì)細(xì)胞突觸，同時(shí)川芎嗪抗氧自由基作用較好，調(diào)節(jié)缺血細(xì)胞自由基活性動態(tài)平衡，降低神經(jīng)細(xì)胞損傷。而頭穴叢刺亦刺激腦血流量增加，加速神經(jīng)細(xì)胞增殖，提高突觸效能傳遞，與李曉娜等[16]研究相符。證實(shí)川芎嗪、頭穴叢刺可促進(jìn)腦梗死大鼠神經(jīng)元突觸恢復(fù)，為神經(jīng)功能恢復(fù)提供關(guān)鍵物質(zhì)基礎(chǔ)。

研究證實(shí)[17]，突觸素密度與神經(jīng)元突觸發(fā)育有密切關(guān)聯(lián)，同時(shí)突觸素亦為神經(jīng)可塑性主要評估標(biāo)志物之一。GFAP則是評估腦梗死程度主要指標(biāo)，亦是反應(yīng)星形膠質(zhì)細(xì)胞增殖及神經(jīng)功能狀態(tài)標(biāo)志物[18]。故本研究重點(diǎn)觀察突觸素、GFAP，以此來客觀評價(jià)川芎嗪、頭穴叢刺在腦梗死大鼠神經(jīng)功能恢復(fù)作用。本研究結(jié)果中，MCAO腦梗死大鼠突觸素、GFAP表達(dá)隨時(shí)間增長，均呈逐步升高進(jìn)展，提示即便腦梗死發(fā)生后，神經(jīng)功能亦有神經(jīng)元突觸調(diào)整與自我神經(jīng)修復(fù)機(jī)制，而川芎嗪與頭穴叢刺干預(yù)則可極大的加速神經(jīng)重建。但通過比較發(fā)現(xiàn)，各組MCAO腦梗死7 d內(nèi)突觸素、GFAP表達(dá)并無明顯差異，而在14 d后各組突觸素、GFAP表達(dá)差異才明顯表現(xiàn)。分析可知，腦梗死后神經(jīng)系統(tǒng)重建恢復(fù)是調(diào)整、代替、適應(yīng)等一系列的過程，在這一神經(jīng)可塑環(huán)節(jié)前期，相關(guān)神經(jīng)功能指標(biāo)亦呈緩慢增長，至神經(jīng)元突觸及相關(guān)遞質(zhì)調(diào)節(jié)到一定程度才逐步顯現(xiàn)差異。結(jié)合研究結(jié)果證實(shí)，川芎嗪聯(lián)合頭穴叢刺對突觸素、GFAP表達(dá)促進(jìn)效果最為明顯，提高神經(jīng)元突觸發(fā)育及重塑性，調(diào)節(jié)神經(jīng)元超微結(jié)構(gòu)。

綜上所述，川芎嗪聯(lián)合頭穴叢刺可促進(jìn)MCAO腦梗死大鼠神經(jīng)元突觸增殖，增強(qiáng)突觸素、GFAP表達(dá)，提高突觸效能傳遞，為神經(jīng)功能重塑提供基礎(chǔ)，保護(hù)神經(jīng)元超微結(jié)構(gòu)，修復(fù)神經(jīng)功能。