豬流行性腹瀉病毒卵黃抗體的研制

潘建波

（廣西柳州市動物疫病預(yù)防控制中心 545001）

豬流行性腹瀉病毒（Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV）是引起豬流行性腹瀉的致病源，是一種高度接觸性、急性的傳染性疫病，可感染各日齡豬，主要臨床特征為嘔吐、腹瀉、發(fā)熱、食欲不振、精神沉郁等，仔豬的死亡率高達80%以上，給我國的養(yǎng)豬產(chǎn)業(yè)造成巨大經(jīng)濟損失。鑒于該病的流行病學特點及對小豬危害的嚴重性，提升小豬的被動免疫能力，將是控制該病發(fā)生與流行的關(guān)鍵環(huán)節(jié)[1]。卵黃抗體在動物疫病預(yù)防與治療方面已得到廣泛的應(yīng)用，具有成本低、易制備、使用方便的特點[2]。本研究用經(jīng)鑒定保存的PEDV 強毒，制備成滅活疫苗免疫產(chǎn)蛋雞制備特異性卵黃抗體，旨在為更加有效地防控PEDV 提供技術(shù)支持和物質(zhì)保障。

1 材料和方法

1.1 試驗用病毒

PEDV 由本實驗室分離并保存。

1.2 試驗用動物

約180 日齡產(chǎn)蛋雞。

1.3 PEDV 滅活苗的制備

1.3.1 水相制備

取發(fā)病后留存仔豬腸道組織，按1： 3 比例加入滅菌的磷酸鹽緩沖液繼續(xù)研磨，8000rpm 離心15min，取上清，加入抗生素后，再按0.4%福爾馬林混勻，于37℃滅活24h，每隔6h搖勻1 次，再加入4%吐溫-80，勻漿5min，即為水相，2～8℃保存。

1.3.2 油相制備

按96： 4 比例混合取10 號白油與司本，搖勻后再加入2%硬脂酸鋁，121℃高壓滅菌10min。

1.3.3 疫苗制備

以約3： 1 的比例混合油相與水相，攪勻油相5min，然后緩慢加入水相攪勻，加完后10000rpm 攪拌3min，靜置72h 不分層判為疫苗乳化合格。

1.4 特異性卵黃抗體的制備

1.4.1 疫苗免疫

取產(chǎn)蛋雞30 只，進行3 次免疫，首次免疫1ml/只，間隔10d 進行2 次加強免疫，免疫劑量為1.5ml/只，3 次免疫后7d，測卵黃抗體效價，抗體效價在1:32 以上開始收蛋。

1.4.2 抗體的制備

雞蛋清洗后用0.05%百毒殺浸泡5min 消毒，擦干后再用75%酒精擦拭消毒，在無菌條件下將蛋卵黃取出置于燒杯內(nèi)，3000rpm 勻漿1min，加等體積的磷酸鹽緩沖液攪勻后，加入青霉素（終濃度200IU/ml） 和鏈霉素（終濃度200ug/ml），分裝于滅菌瓶中，置4℃保存。

1.5 動物治療試驗

在本市一確診發(fā)生豬流行性腹瀉的豬場內(nèi)，對患病仔豬應(yīng)用特異性卵黃抗體進行干預(yù)治療，口服3ml/次，每天3 次，對照組在進行抗生素治療。

2 結(jié)果

2.1 卵黃抗體效價測定

取3 免疫后7d 的雞蛋，以保存組織毒的上清為瓊擴抗原，卵黃進行倍比稀釋，36h 后在1:32 處可見瓊擴沉淀線（見附圖）。

2.2 動物治療試驗結(jié)果

對出生3d 后發(fā)病的仔豬各10 頭進行干預(yù)治療，結(jié)果表明，特異性卵黃抗體組效果明顯，治愈率60%，抗生素組僅為20%，未治療組全部死亡（見附表）。

3 討論

PED 對仔豬而言屬于發(fā)病急、死亡率高的疾病，3 日齡內(nèi)感染發(fā)病的仔豬若不進行干預(yù)治療，死亡率可達100%。7 日齡以上的仔豬對該病有一定的抵抗力，但會成為病毒的傳染源。對于7 日齡內(nèi)的仔豬，靠自身的主動免疫來抵抗感染PEDV 是不科學的，因為疫苗產(chǎn)生堅強的免疫應(yīng)答一般需要一周的時間，同時，因為仔豬的免疫系統(tǒng)還沒有完全成熟，在較短時間內(nèi)通過疫苗免疫的方式刺激機體產(chǎn)生有效抗體是更大的挑戰(zhàn)[3]。因此，被動免疫是保護仔豬免受病毒感染的最理想的方式。高免血清或康復(fù)血清對仔豬進行被動免疫效果雖好，但制備過程煩瑣、產(chǎn)量低、成本高、不適于產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)。蛋雞作為卵黃抗體的主要提供者，易于規(guī)?；曫B(yǎng)，且產(chǎn)蛋量高，適合于工業(yè)化生產(chǎn)，同時降低了因使用同源物質(zhì)而造成疫病傳染的危險。臨床治療效果表明，本研究制備的特異性卵黃抗體對治療PEDV 有明顯的效果，為有效防控PED 的流行與發(fā)生奠定了物質(zhì)基礎(chǔ)。

附表 特異性卵黃抗體治療PEDV 感染試驗