線蟲液體培養(yǎng)和監(jiān)測過程關(guān)鍵參數(shù)的實驗研究

張 普，王 巍，盧盈宇，元姝棋，楊倩倩，鐘潤濤，孫野青

(大連海事大學環(huán)境科學與工程學院環(huán)境系統(tǒng)生物學研究所，大連116026)

1 引言

秀麗隱桿線蟲[1](Caenorhabditis elegans)具有個體小、抗逆性強、容易搭載等優(yōu)點，是一種非常適合空間生物學研究的模式生物[2]。 在生長環(huán)境對線蟲不利時，線蟲在L2 期后會激活一個特殊時期——道爾期[3]，進入道爾期的線蟲不再進食，停止發(fā)育，該時期的線蟲對惡劣環(huán)境抵抗力較強。 目前航天飛機計劃STS[4-6]及DELTA MISSION(ICE-FIRST)任務中[7-8]已搭載有很多線蟲實驗。 但這些研究表明，無論采用固體培養(yǎng)裝置還是液體培養(yǎng)裝置進行在軌培養(yǎng)，飛行器返回后線蟲都是多代混淆的群體狀態(tài)，這種混淆狀態(tài)對線蟲研究結(jié)果的穩(wěn)定性和重現(xiàn)性有很大影響。Xu 等[9]為了避免多代樣品間的干擾，利用無菌固體培養(yǎng)基誘導道爾期線蟲，進行了神舟8 號飛船搭載實驗，飛船返回后對野生型線蟲和微重力感受缺失線蟲及輻射損傷修復缺失型線蟲進行比較，研究了空間輻射與微重力效應，揭示了空間生物學效應的功能基因組和轉(zhuǎn)錄后調(diào)控相關(guān)的通路。 上述提到的所有研究均是線蟲在返回后進行的結(jié)果分析。 為了能在空間環(huán)境中在軌監(jiān)測當代線蟲的狀態(tài)，特別是線蟲個體發(fā)育的不同階段在微重力環(huán)境下的變化特點，需要利用微納流控技術(shù)[10]進行單線蟲的培養(yǎng)和監(jiān)測。

中國空間站使用微流控芯片在軌進行線蟲生長發(fā)育的觀察和分析，首先要解決線蟲的培養(yǎng)環(huán)境問題，因為自動化培養(yǎng)需要使用流體控制，而線蟲傳統(tǒng)培養(yǎng)環(huán)境為固體培養(yǎng)基；其次是芯片的設計問題，芯片的通道設計依賴培養(yǎng)線蟲的身體大小，并且芯片培養(yǎng)線蟲時的培養(yǎng)時間和換液時間也需要考慮到線蟲的生活習性；最后對線蟲進行觀測時的光照是否對線蟲產(chǎn)生影響及影響的程度也需要確認。

綜上，為實現(xiàn)線蟲在微流控芯片上的培養(yǎng)，本文使用小體系培養(yǎng)和篩選線蟲方法，解決如何獲取適應液體環(huán)境的秀麗隱桿線蟲問題，并且對適應液體環(huán)境的線蟲進行一系列指標的測量，獲取體長、體寬發(fā)育曲線、產(chǎn)卵期和存活曲線，并確認觀測時的光照對線蟲發(fā)育的抑制作用。

2 材料與方法

2.1 材料

實驗室中線蟲主要在NGM (Nematode Growth Medium)培養(yǎng)基上生長[2]，以尿嘧啶營養(yǎng)缺陷型大腸桿菌OP50 為食，Szewczyk[11]，Samuel 等[12]的研究已經(jīng)證實，線蟲除用NGM 固體培養(yǎng)基之外，還可以生長在液體培養(yǎng)基中。 液體培養(yǎng)基又分為有菌液體培養(yǎng)基和無菌液體培養(yǎng)基，其中有菌液體培養(yǎng)基以S.Medium[2]為代表，無菌液體培養(yǎng)基以C.elegansMaintenance Medium(CeMM)[11]和C.elegansHabituation and Reproduction Media (mCeHR)[12]為代表。 S.Medium 培養(yǎng)基基本成分與NGM 培養(yǎng)基類似，通過添加大腸桿菌OP50 作為食物，但是在S.Medium生長中的線蟲比NGM 上的線蟲更細更長。CeMM 和mCeHR 培養(yǎng)基中明確添加了線蟲生長所需的全部營養(yǎng)元素，不需要額外添加大腸桿菌作為線蟲的食物來源，所以可以減少耗氧需求，比傳統(tǒng)的NGM 方法培育起來更簡單。 適應CeMM 培養(yǎng)環(huán)境的線蟲從卵至成蟲的發(fā)育周期為6 ～8 天，適應mCeHR 培養(yǎng)基的線蟲發(fā)育周期較快，為2 ～3 天。 CeMM 培養(yǎng)基曾被多次應用于線蟲的空間搭載實驗中[7-8]，并且CeMM 近似黃色透明狀態(tài)，視野清晰，不影響線蟲生長狀態(tài)的觀察。 mCeHR 培養(yǎng)基規(guī)定的營養(yǎng)成分與CeMM 相似，額外添加了血紅素/脫脂牛奶等，但由于脫脂牛奶成分并不明確，mCeHR 并不能稱之為完全穩(wěn)定化學成分定義的培養(yǎng)基。 李孟惠[13]實驗證明，不同品牌牛奶會對線蟲的發(fā)育有不同的影響，并且由于mCeHR 里含有的牛奶具有膠體性質(zhì)，相對于CeMM 更加渾濁。 根據(jù)在軌線蟲監(jiān)測的需要，CeMM 相對更占優(yōu)勢，所以選用CeMM 培養(yǎng)基為實驗用的液體無菌培養(yǎng)基。

秀麗隱桿線蟲野生型N2來自美國線蟲遺傳中 心( Caenorhabditis Genetics Center， CGC)。CeMM 培養(yǎng)基配制參考Szewczyk[11]的研究，其中部分藥品調(diào)整如表1 所示。

表1 CeMM 配置藥品調(diào)整表Table 1 Reagent modification for CeMM preparation

2.2 線蟲同步化

在超凈臺中將培養(yǎng)瓶中處于妊娠期的線蟲取出至15 mL 離心管中。 1 000 rpm離心1 min，棄上清。 加入無菌水洗滌，重復3 次。 最后一次棄上清，剩下3.5 mL 包含線蟲的液體。 離心管內(nèi)加入0.5 mL 5M 氫氧化鈉和1 mL 次氯酸鈉(有效氯濃度≥5%)，搖晃混勻，每隔2 min 混勻一次，肉眼觀察至線蟲蟲體溶解時，加入M9 溶液終止反應，裂解時間約5 min 30 s(當觀察到液體變渾濁，大部分線蟲溶解時停止)。 反應完成后4 000 rpm離心1 min。 棄上清，加入10 mL 無菌M9 進行沖洗，搖晃混勻。 重復該步驟2 次至PH約為7，離心后的沉淀即為蟲卵。 再將蟲卵轉(zhuǎn)移至加有CeMM 的6 孔板中，將含蟲卵的6 孔板放置于脫色搖床上孵化。 待蟲卵孵化后，用移液器將聚集漂浮于液面上未孵化的線蟲卵及雜質(zhì)吸除，留下的即為同步化后的L1 期線蟲。

2.3 線蟲的馴化

線蟲在實驗室內(nèi)主要在NGM 平板上生長，為了得到適應CeMM 液體生存環(huán)境的線蟲，需要對線蟲進行馴化，從而獲取穩(wěn)定的CeMM 品系線蟲，過程如下：將NGM 上的N2線蟲同步化后得到蟲卵，將蟲卵轉(zhuǎn)移至20 管預先加入200 μL CeMM 的PCR 管中，在20 ℃下培養(yǎng)至第7 ～10天，開始每天觀察，篩選出未染菌的PCR 管，并且觀察管中線蟲是否處于正常生長狀態(tài)，直至觀察到有成蟲出現(xiàn)時，將成蟲取出至6 孔板中CeMM培養(yǎng)，該線蟲即為初代馴化線蟲。 將該線蟲的后代擴大培養(yǎng)，再重復進行同步化操作獲取下一代線蟲，直至線蟲培養(yǎng)體系穩(wěn)定不染菌，并且線蟲從卵至成蟲的發(fā)育時期穩(wěn)定在一個固定時間(不同品系的線蟲發(fā)育時間不一致，CeMM 中的N2從蟲卵發(fā)育到成蟲約為6 ～8 天)，即視為獲取到適應液體無菌培養(yǎng)基的線蟲。 獲取到馴化線蟲后，可使用細胞培養(yǎng)瓶和CeMM 進行大體系培養(yǎng)。

2.4 體長及體寬測量

適應CeMM 環(huán)境的線蟲生長指標有非常明顯的變化，所以需要測量生長發(fā)育關(guān)鍵指標如從幼蟲發(fā)育至成蟲過程中的體長和體寬的增長、產(chǎn)卵期、壽命等來為微流控芯片設計提供參考支持。

采用Motic 顯微鏡配套圖像分析軟件Motic Image Plus 3.0 進行線蟲顯微圖像分析和測量。測量體長時選取線蟲身體的中間位置，測量線蟲體寬時選取線蟲咽部位置。 體長、體寬測量如圖1所示。

圖1 體長(左)體寬(右)測量示意圖Fig.1 Schematic of body length (left) and body width (right) measurement

2.5 產(chǎn)卵期測定

將同步化后的線蟲稀釋加樣至96 孔板中，選取只有1 條線蟲的孔進行跟蹤，第4 天開始連續(xù)每天觀察，直到觀察到孔內(nèi)出現(xiàn)子代L1 期幼蟲，向前推一天，即為產(chǎn)卵的起始時間(觀察時顯微鏡的光強用光度計調(diào)至700 lux)。 每天對幼蟲計數(shù)并記錄，幼蟲數(shù)量即視為產(chǎn)卵數(shù)量。 數(shù)據(jù)統(tǒng)計直至母代線蟲所產(chǎn)下的子代產(chǎn)卵或者一些孔內(nèi)已無法用肉眼進行計數(shù)為止。

2.6 壽命測定

由于線蟲產(chǎn)的卵發(fā)育成子代后很快就會發(fā)育成母體大小，導致分辨不清母代和子代，因此對線蟲壽命的測定通常使用FudR (5-fluoro-2′-deoxyuridine) 抑制線蟲產(chǎn)卵，Van raamsdonk 等[14]研究表明FudR 對野生型線蟲壽命影響很小。 將同步化后的線蟲稀釋加樣至96 孔板中并記錄加入的線蟲數(shù)量，在20 ℃下培養(yǎng)至第3 天時，用移液槍向孔內(nèi)CeMM 培養(yǎng)基中加入FUdR 抑制線蟲產(chǎn)卵(FUdR 在去離子/蒸餾水中稀釋并添加到CeMM 至終濃度為40 mol/L)。 觀察記錄孔內(nèi)線蟲是否存活(若線蟲不動，則用振動刺激線蟲，觀察線蟲是否有反應)，每天記錄存活的線蟲數(shù)量，并和加入的線蟲總數(shù)量對比，從而計算出每天線蟲群體的存活率，繪制出線蟲的存活曲線，通過存活曲線可觀察線蟲的整體壽命。

2.7 顯微鏡光照梯度實驗

線蟲正常生長在黑暗中，對適應黑暗培養(yǎng)環(huán)境的線蟲來說，顯微鏡持續(xù)觀察時的光照會引起線蟲發(fā)育的不穩(wěn)定。 夏志濤[15]研究指出不同波長的光對線蟲發(fā)育有不同的影響，為了確定在軌監(jiān)測中顯微鏡光照因素對線蟲的影響，需進行光照強度參數(shù)的分析。

使用96 孔板培養(yǎng)線蟲，每天分別用鹵素燈光源顯微鏡(Motic AE21)和LED 光源顯微鏡(Motic AE2000)持續(xù)對每孔中的線蟲照射2 min，觀察同步化后的線蟲在CeMM 中的發(fā)育情況，按光照強度分為700 lux，5 000 lux，15 000 lux 3 組。 在光照刺激的同時，拍攝線蟲圖像，進行體長、體寬的測量。 黑暗組提前準備好每天使用的孔板，拍照測量完之后即丟棄該板，第2 天使用新的孔板進行測量。 從L1 幼蟲觀察至發(fā)育為成蟲。 上述步驟涉及到的含線蟲的96 孔板，除光照刺激時，均在溫度20 ℃，相對濕度80%的恒溫恒濕培養(yǎng)箱中避光培養(yǎng)。

3 結(jié)果與討論

3.1 N2 線蟲在CeMM 中的馴化

按照2.3 節(jié)中的實驗方法，在CeMM 中成功馴化了來源為固體NGM 培養(yǎng)的N2線蟲，馴化后的線蟲可以在完全無菌的CeMM 培養(yǎng)基中生長繁殖(圖2)，并且從L1 幼蟲發(fā)育至成蟲穩(wěn)定在(7±1)天(圖3)，可以進行大體系的擴繁和同步化操作(實驗所用液體培養(yǎng)環(huán)境的線蟲來源均為此次馴化后的野生型線蟲)。 需要注意的是在獲取初代線蟲時(即從NGM 首次轉(zhuǎn)移至CeMM)極易染菌，所以將其分裝到多管小體系的PCR 管中，分散染菌風險，并且可以通過篩選小體系中發(fā)育較好的線蟲，單獨分離培養(yǎng)，加快獲取適應液體環(huán)境的線蟲速度。

圖2 適應CeMM 的N2 線蟲生存狀態(tài)Fig.2 Survival status of N2adapted to CeMM

對馴化后的CeMM 線蟲進行了一系列生長指標的測量，并與NGM 上生長的線蟲進行比較，包括體長、體寬、產(chǎn)卵期、壽命等。 這些指標與NGM 線蟲相比存在較大差異。

圖3 馴化后的線蟲在CeMM 中第1 ～8 天的發(fā)育過程Fig.3 Developmental process of domesticated nematodes from day 1 to day 8 in CeMM

3.1.1 N2線蟲在CeMM 發(fā)育的體長體寬

通過跟蹤馴化后的CeMM 線蟲發(fā)育，測量每天的線蟲體長、體寬的增長幅度。 與NGM 上生長的野生型線蟲相比(圖4、圖5)，發(fā)現(xiàn)適應CeMM 環(huán)境的線蟲生長緩慢，在相同的發(fā)育天數(shù)，CeMM 中的線蟲體長比NGM 上的線蟲短，體寬比NGM 上的線蟲細。 線蟲體寬變細對微流控芯片的線蟲控制通道的設計和加工制作提出了更加精細的要求。 線蟲每天的體長和體寬變化數(shù)據(jù)(圖6)可以給線蟲微流控芯片提供設計理論支持，其體長由發(fā)育第1 天L1 期平均184.65 μm 增長到成蟲期平均996.60 μm，最長可達1 128.94 μm；體寬由L1 期平均14.62 μm 增長至成蟲期35.32 μm，最寬可達39.23 μm。

圖4 CeMM 中生長的線蟲與NGM 上線蟲的體長對比(N≥15)Fig. 4 Comparison of body length of nematodes grown in CeMM and nematodes grown on NGM (N≥15)

3.1.2 N2線蟲在CeMM 發(fā)育的產(chǎn)卵期

線蟲除了體長和體寬發(fā)生變化，適應CeMM的線蟲的產(chǎn)卵期也發(fā)生了改變。 目前利用96 孔板進行液體培養(yǎng)無法清除線蟲的卵，卵發(fā)育至成蟲會產(chǎn)生混淆導致無法統(tǒng)計，所以該實驗只能進行到發(fā)育的第14 天。 統(tǒng)計如圖7 所示，NGM 上線蟲的產(chǎn)卵從第3 天開始，第6 天后基本結(jié)束；而CeMM 上的線蟲產(chǎn)卵從第7 天開始，直至第14 天時線蟲體內(nèi)仍可觀察到有卵未產(chǎn)出，所以CeMM上的線蟲產(chǎn)卵起始時間向后推遲并且整個產(chǎn)卵期被延長，并且其產(chǎn)卵量少于在NGM 固體培養(yǎng)基上生長的線蟲產(chǎn)卵量。 實驗結(jié)果證實，線蟲可以滿足在軌的相對長期觀察，并且可以在第7 天后開始利用微流控技術(shù)進行液體培養(yǎng)基的換液，將線蟲產(chǎn)生的子代在發(fā)育前回收至培養(yǎng)袋內(nèi)，在不影響當代在軌監(jiān)測的同時，還能獲得多代混合的線蟲子代供返回后分析。

圖5 CeMM 中生長的線蟲與NGM 上生長的線蟲的體寬對比(N≥15)Fig.5 Comparison of body width of nematodes grown in CeMM and nematodes grown on NGM (N≥15)

圖6 在CeMM 中馴化后的野生型線蟲體長體寬發(fā)育情況(N≥15)Fig.6 Body length and body width development of wild-type nematodes acclimated in CeMM (N≥15)

3.1.3 N2線蟲在CeMM 發(fā)育的壽命

通過FudR 處理可以避免子代對母代線蟲的混淆。 經(jīng)過連續(xù)跟蹤觀察，在CeMM 培養(yǎng)基中的線蟲平均壽命可延長至30 天以上，而NGM 中的線蟲最長壽命僅為18 天(圖8)。 在空間在軌實驗中，線蟲的暴露時間越長，接受的輻射量越大，所以線蟲壽命的延長有利于得到更多有效的輻射損傷數(shù)據(jù)。 但在壽命觀察實驗中使用了FUdR 抑制線蟲產(chǎn)卵，實驗證實FUdR 對線蟲的產(chǎn)卵行為有高效的抑制作用，在30 天內(nèi)并無線蟲產(chǎn)卵。Van raamsdonk 等[14]研究證實FUdR 不會影響生長于NGM 培養(yǎng)基上野生型線蟲的壽命測定，但CeMM 中的線蟲是否會被影響壽命暫時還未有文獻報導。 所以不排除本實驗中FUdR 對線蟲壽命增長有促進作用，在線蟲微流控芯片投入使用后將會進一步確認是否受FUdR 的影響。

圖7 CeMM 中線蟲與NGM 中線蟲的產(chǎn)卵對比(N≥90)Fig.7 Comparison of nematodes oviposition data in CeMM and NGM(N≥90)

圖8 CeMM 線蟲與NGM 線蟲壽命對比(N≥133)Fig.8 The lifespan of CeMM nematodes and NGM nematodes.(N≥133)

3.2 顯微觀察過程中的光照影響

實驗過程中發(fā)現(xiàn)，每天定時利用顯微鏡觀察產(chǎn)生的光照刺激對線蟲的發(fā)育產(chǎn)生一定的生長抑制，使部分線蟲發(fā)育不同步，甚至不能正常發(fā)育到成蟲期(圖9)。 為研究顯微鏡的光照強度對線蟲發(fā)育的影響，確定顯微鏡光源的限制條件，分別利用鹵素燈光源和LED 燈光源進行了3 個不同光照強度700 lux、5 000 lux、15 000 lux培養(yǎng)和黑暗培養(yǎng)線蟲的對比實驗，其中700 lux 強度是不影響對線蟲的體長等數(shù)據(jù)測量的最低光照強度。

圖9 線蟲發(fā)育不同步Fig.9 Inconsistent development of nematodes

結(jié)果發(fā)現(xiàn)，鹵素燈光源照射對CeMM 培養(yǎng)的N2 線蟲的發(fā)育有明顯的抑制作用， 體長發(fā)育對比見圖10， 體寬發(fā)育對比見圖11，并且隨著光照強度的增強，抑制作用越明顯；LED 光源照射與黑暗對照組相比對線蟲也有生長抑制作用，體長發(fā)育對比見圖12，體寬發(fā)育對比見圖13，但抑制作用較弱，與鹵素燈不同的是，生長抑制的程度并沒有隨著光照強度的增強而明顯增強。 2 種光源照射下第7 天時不同光照組與黑暗組的體長、體寬顯著性差異分析見表2。 分析原因發(fā)現(xiàn)，2 種光源最大的區(qū)別是LED 為冷光源，幾乎不會產(chǎn)熱，而鹵素燈為熱光源，產(chǎn)熱。 所以鹵素燈與LED 光源相比會隨著光強的增加而增強熱效應。 線蟲生長溫度以20 ℃為最佳，高溫會抑制線蟲的生長，所以鹵素燈會有更強的抑制效應。

實驗結(jié)果和夏志濤[15]研究中提到的光照抑制線蟲發(fā)育的現(xiàn)象一致，但文獻[15]中使用的是NGM 培養(yǎng)的線蟲，本實驗是CeMM 中培養(yǎng)的線蟲，這可以證明在不同培養(yǎng)基上線蟲的生長都會受到光照抑制。 實驗結(jié)果提示在空間站線蟲在軌監(jiān)測過程中，數(shù)據(jù)采集模塊的光源要采用冷光源，并且在保證獲取實驗數(shù)據(jù)的前提下，盡量減少光照強度和光照時間，最大化減弱光照對線蟲的影響。

表2 不同光強光照與黑暗培養(yǎng)線蟲發(fā)育顯著性差異分析(DAY 7)Table 2 Analysis of significant difference between the light groups and the dark group (DAY 7)

圖10 3 個光照處理組和黑暗對照組的體長發(fā)育對比(鹵素燈)Fig.10 Comparison of body length development between three light treatment groups and the dark control group (Halogen lamp)

圖11 3 個光照處理組和黑暗對照組的體寬發(fā)育對比(鹵素燈)Fig.11 Comparison of body width development between three light treatment groups and the dark control group (Halogen lamp)

圖12 3 個光照處理組和黑暗對照組的體長發(fā)育對比(LED)Fig.12 Comparison of body length development between three light treatment groups and the dark control group (LED)

圖13 3 個光照處理組和黑暗對照組的體寬發(fā)育對比(LED)Fig.13 Comparison of body width development between three light treatment groups and the dark control group (LED)

4 結(jié)論

本文對在CeMM 培養(yǎng)基中生長的線蟲的體長、體寬、壽命、產(chǎn)卵期以及光照條件進行分析，為在微流控芯片上使用液體培養(yǎng)基實現(xiàn)線蟲自動化培養(yǎng)的設計提供了技術(shù)參數(shù)。

1)馴化后的N2秀麗隱桿線蟲可以適應CeMM 無菌液體培養(yǎng)，并完成生命周期，這為微流控芯片實現(xiàn)自動化培養(yǎng)所需的液體環(huán)境提供基礎。

2)CeMM 培養(yǎng)線蟲的發(fā)育速度、產(chǎn)卵期和壽命與NGM 培養(yǎng)基相比均被延長，較長的壽命有利于觀察當代樣品長期暴露在太空中接受宇宙射線產(chǎn)生的變化；芯片通道的設計可以按照實驗需求并根據(jù)CeMM 線蟲每天的發(fā)育數(shù)據(jù)進行調(diào)整；產(chǎn)卵期數(shù)據(jù)提示可以在使用微流控芯片培養(yǎng)線蟲至第7 天時執(zhí)行換液。

3)在空間站線蟲在軌監(jiān)測過程中，采集光源要采用冷光源，光照強度推薦設置為700 lux，光照時間盡量減少，以最大化減弱光照對線蟲的影響。