無創(chuàng)產(chǎn)前基因檢測診斷Pallister-Killian綜合征1例分析*

馮 暄，張 釧，張慶華，郝勝菊，鄭 雷，周秉博，王 興

(甘肅省婦幼保健院醫(yī)學(xué)遺傳中心，甘肅蘭州 730050)

Pallister-Killian綜合征(PKS)屬于染色體微缺失綜合征的一種，可導(dǎo)致患兒身體不同程度殘疾、生長發(fā)育遲緩或智力損傷等。PKS的臨床表現(xiàn)包括特征性顱面畸形、先天性心臟缺損、膈疝、癲癇和皮膚色素異常等[1]。PKS較為罕見，診斷困難，產(chǎn)前篩查是預(yù)防PKS患兒出生的有效手段[2]。本研究通過無創(chuàng)產(chǎn)前基因檢測(NIPT)診斷了1例PKS，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1 臨床資料

孕婦，27歲，孕2產(chǎn)1，孕18周，否認(rèn)近親婚配，無遺傳病家族史。于外院行超聲檢查提示：胎兒先天性膈疝，股骨、肱骨低于M-2SD線，心臟移位至右側(cè)胸腔，肺動(dòng)脈主動(dòng)脈比值增大，心包積液，三尖瓣反流(少量)。因血清學(xué)產(chǎn)前篩查18-三體綜合征高風(fēng)險(xiǎn)于本院就診，18-三體綜合征風(fēng)險(xiǎn)值為1/266。產(chǎn)科醫(yī)生咨詢后，建議直接行羊水穿刺產(chǎn)前診斷，但孕婦因擔(dān)心羊膜腔穿刺風(fēng)險(xiǎn)，自愿選擇NIPT，在充分了解NIPT的優(yōu)勢與局限性后，簽署知情同意書，并于孕22周時(shí)進(jìn)行檢測。

1.1NIPT 靜脈采集10 mL外周血，4 ℃下1 600×g離心10 min，取上清液2 mL分裝后再次于4 ℃下16 000×g離心10 min，獲得的血漿繼續(xù)進(jìn)行游離DNA 提取，剩余標(biāo)本于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?biāo)本DNA檢測合格后用PCR-free法進(jìn)行文庫制備，采用NextSeq CN500高通量測序儀(貝瑞基因公司)完成36 bp的單端測序，檢測試劑盒為貝瑞基因公司生產(chǎn)的胎兒染色體非整倍體檢測試劑盒(可逆末端終止測序法)，測序深度為0.3×，并進(jìn)行生物信息學(xué)分析。NIPT結(jié)果提示：13、18、21-三體無異常，但存在12號(hào)染色體短臂部分重復(fù)dup(12)(p13.33-p11.1),Z值為20.81，起始位置為chr12:200000-34499999,片段大小為34.3 Mb，代表12號(hào)染色體短臂部分三體，見圖1，需行進(jìn)一步的有創(chuàng)性診斷確診。

注：方框所示為染色體短臂重復(fù)部位，拷貝數(shù)為3。

圖1 NIPT 12號(hào)染色體拷貝數(shù)變異散點(diǎn)圖

1.2胎兒羊水細(xì)胞染色體核型分析 經(jīng)產(chǎn)科醫(yī)生咨詢，簽署知情同意書后，于孕24周時(shí)行羊水穿刺。抽取羊水30 mL，取10 mL用于高通量測序,其余20 mL分2管，以2 000 r/min離心10 min后棄上清，取沉淀細(xì)胞，加適量羊水細(xì)胞培養(yǎng)基，接種于無菌培養(yǎng)瓶內(nèi)，置于37 ℃、含5%二氧化碳的培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)8～9 d，常規(guī)收獲制片。以G顯帶染色制備染色體標(biāo)本，對(duì)每例標(biāo)本均按照《人類細(xì)胞遺傳學(xué)國際命名體制(2013)》標(biāo)準(zhǔn)，計(jì)數(shù)20個(gè)中期分裂相細(xì)胞，分析5個(gè)核型。胎兒羊水細(xì)胞染色體核型分析結(jié)果：47，XX,+i(12)(p10)[58]/46,XX[42]，說明該標(biāo)本為12號(hào)染色體短臂等臂染色體的嵌合體，見圖2。

1.3胎兒羊水高通量染色體拷貝數(shù)變異檢測(CNV-seq) 提取羊水基因組DNA，進(jìn)行文庫構(gòu)建：通過片段化-連接、PCR前純化、PCR擴(kuò)增、PCR后純化等過程，采用 NextSeq CN500高通量測序儀(貝瑞基因公司)，進(jìn)行CNV-seq，測序結(jié)果經(jīng)貝瑞基因公司Enliven?變異注釋系統(tǒng)標(biāo)注。CNV-seq結(jié)果為：dup(12)(p13.33-p11.1)(mos)，提示該標(biāo)本12號(hào)染色體 p13.33-p11.1處檢測到拷貝數(shù)為3.5，片段大小為 34.70 Mb 的嵌合重復(fù)區(qū)域，起始位置為chr12:160001-34860000，見圖3、4。經(jīng)查閱數(shù)據(jù)庫[包括Decipher數(shù)據(jù)庫、在線人類孟德爾遺傳數(shù)據(jù)庫(OMIM)、PubMed數(shù)據(jù)庫及UCSC Genome Browser數(shù)據(jù)庫]，得出該標(biāo)本的變異包含了PKS的全部區(qū)域，結(jié)合羊水細(xì)胞染色體核型分析與CNV-seq的結(jié)果，該標(biāo)本確診為PKS。

1.4孕婦及其配偶外周血染色體核型分析 為明確變異來源，對(duì)該孕婦及其配偶進(jìn)行了外周血染色體核型分析，夫妻雙方G顯帶核型結(jié)果均未見異常，見圖5，說明胎兒染色體變異為新發(fā)。

注：胎兒染色體核型為47,XX,+i(12)(p10)；箭頭所示1個(gè)額外染色體，為12號(hào)染色體短臂等臂染色體。

圖2 胎兒羊水細(xì)胞染色體核型圖

注：方框所示為染色體拷貝數(shù)異常。

圖3 CNV-seq 12號(hào)染色體測序散點(diǎn)圖

注：A為12號(hào)染色體拷貝數(shù)變異測序圖，方框所示為染色體短臂重復(fù)部位，拷貝數(shù)為3.5；B為12號(hào)染色體，方框所示為12號(hào)染色體短臂重復(fù)部位示意圖。

圖4 CNV-seq 12號(hào)染色體拷貝數(shù)變異圖

注：A為孕婦外周血染色體核型：46,XX；B為孕婦配偶外周血染色體核型：46,XY。

圖5 孕婦及其配偶外周血染色體核型圖

2 討 論

PKS的細(xì)胞遺傳學(xué)特點(diǎn)是特定組織中以嵌合體形式存在的12號(hào)染色體短臂等臂染色體，故也稱為等臂12p綜合征或12p四體綜合征。PKS的嵌合效應(yīng)是由于額外染色體上攜帶的基因最終導(dǎo)致顱面部、心血管、腎臟和其他系統(tǒng)異常。PKS可累及體內(nèi)所有器官及系統(tǒng)，其典型臨床表現(xiàn)如下：(1)特殊面容包括皮膚色素異常、粗狂面容、眼距寬、高腭弓、前額突出、短頸等；(2)神經(jīng)系統(tǒng)異常包括腦結(jié)構(gòu)異常、癲癇、肌張力減退；(3)心臟缺陷包括心房和室間隔缺損；(4)胸部受累包括肺發(fā)育不全、膈疝；(5)胃腸道表現(xiàn)包括腸旋轉(zhuǎn)不良及肛門移位；(6)骨骼肌肉系統(tǒng)發(fā)育異常包括PKS特有的生長模式，即在宮內(nèi)提示明顯的生長過度現(xiàn)象，但在出生后立即表現(xiàn)為生長發(fā)育遲緩；(7)75%的PKS患兒還有一定程度的視力損傷[2-3]。PKS胎兒在妊娠中期超聲檢查中可顯示出明顯的異常，包括羊水過多、膈疝、中樞神經(jīng)系統(tǒng)異常、胎兒水腫、顏面部異常、心室擴(kuò)張、短肢畸形等。當(dāng)超聲檢查提示羊水過多、膈疝、肢根骨短小，尤其伴有生長過度時(shí)，應(yīng)首先考慮PKS[4]。本研究中該孕婦妊娠中期超聲檢查提示：胎兒先天性膈疝，股骨、肱骨低于M-2SD線，心臟移位至右側(cè)胸腔，肺動(dòng)脈主動(dòng)脈比值增大，心包積液，三尖瓣反流(少量)。符合PKS超聲檢查的主要特征。

PKS具有特殊的細(xì)胞遺傳學(xué)特點(diǎn)，即異常的染色體有組織特異性，通常在皮膚成纖維細(xì)胞中可以檢測到異常。因此，由于嵌合體的組織特異性，PKS的診斷可能經(jīng)常被遺漏，并且通常在快速分裂的細(xì)胞，如外周血淋巴細(xì)胞中不能檢測到[5-6]。已報(bào)道的病例中均未在外周血淋巴細(xì)胞中診斷出異常染色體i(12)(p10)[7]。據(jù)不同組織中期染色體核型分析統(tǒng)計(jì)，包含有異常染色體i(12)(p10)的組織包括：淋巴細(xì)胞(檢出率為0%～2%)、成纖維細(xì)胞(檢出率為50%～100%)、羊水細(xì)胞和骨髓細(xì)胞(檢出率均為100%)[8]。皮膚成纖維細(xì)胞中檢測嵌合體的成功率高于外周血，因?yàn)槠洚惓＜?xì)胞的損耗率低于T淋巴細(xì)胞[9]。本病例羊水細(xì)胞中i(12)(p10)檢出率為58%,說明CNV-seq技術(shù)可以精準(zhǔn)地檢測出比例高于5%的嵌合體，也證明了在PKS的診斷方面，羊水細(xì)胞的檢出率較高。羊水CNV-seq結(jié)果顯示，12號(hào)染色體短臂重復(fù)，其拷貝數(shù)為3.5。一般來說，單純的染色體重復(fù)檢測到的拷貝數(shù)應(yīng)為3，但該標(biāo)本是12號(hào)染色體短臂等臂四倍體的嵌合體，所以導(dǎo)致其拷貝數(shù)為3.5。目前，診斷PKS的方法主要為細(xì)胞遺傳學(xué)及分子遺傳學(xué)兩類，本病例采用的細(xì)胞遺傳學(xué)技術(shù)為染色體核型分析，其是染色體檢查的“金標(biāo)準(zhǔn)”；但由于PKS特殊的細(xì)胞遺傳學(xué)特點(diǎn)，在不同組織中的檢出率有很大差別，所以染色體核型分析技術(shù)對(duì)PKS的檢出率并不高。本病例采用的分子遺傳學(xué)技術(shù)為CNV-seq，其不針對(duì)特定區(qū)域設(shè)計(jì)探針，而是進(jìn)行全基因組測序，覆蓋了23對(duì)染色體，精確度高，可檢測到相對(duì)分子質(zhì)量為100×103以上的染色體變異，并具有很好的重復(fù)性與擬合度，與芯片技術(shù)比較，具有成本低、通量高、覆蓋范圍廣及穩(wěn)定性更高等優(yōu)點(diǎn)。

PKS屬于染色體微缺失綜合征的一種。染色體的微缺失或微重復(fù)都屬于染色體的拷貝數(shù)變異,可引起微缺失或微重復(fù)綜合征，導(dǎo)致患兒身體出現(xiàn)不同程度器官功能異常、生長發(fā)育遲緩或智力損傷等[10]。有研究顯示，有1.65%的孕婦在產(chǎn)前診斷中可檢出有臨床意義的染色體微缺失或微重復(fù)[11]。要想有效預(yù)防出生缺陷，就需要進(jìn)行大規(guī)模的產(chǎn)前篩查，并對(duì)高風(fēng)險(xiǎn)人群進(jìn)行產(chǎn)前診斷。NIPT作為高通量測序在臨床應(yīng)用最成熟的領(lǐng)域，其檢測胎兒染色體非整倍體異常已經(jīng)成為臨床產(chǎn)前篩查的重要部分。2015年國際產(chǎn)前診斷協(xié)會(huì)針對(duì)NIPT出臺(tái)了最新臨床應(yīng)用指南，明確指出NIPT可對(duì)染色體微缺失或微重復(fù)進(jìn)行檢測[12]。近年來，隨著測序技術(shù)的進(jìn)一步發(fā)展，一些實(shí)驗(yàn)室引入了染色體微缺失或微重復(fù)的無創(chuàng)產(chǎn)前篩查，作為除了整個(gè)染色體非整倍體檢測之外的另一種選擇，稱之為擴(kuò)展性的無創(chuàng)產(chǎn)前篩查技術(shù)[13]。擴(kuò)展病種的無創(chuàng)性產(chǎn)前檢測，篩查的范圍擴(kuò)大到全染色體基因組7 Mb的片段變異和常見的微缺失或微重復(fù)[14]，但目前并沒有充足的臨床應(yīng)用反饋數(shù)據(jù)。本研究中采用NIPT篩查出胎兒12號(hào)染色體短臂重復(fù)片段大小為34.3 Mb,并通過CNV-seq證實(shí)與胎兒有創(chuàng)產(chǎn)前診斷結(jié)果相符，證明了NIPT對(duì)檢測染色體大片段的重復(fù)有較高的靈敏度和特異度。

綜上所述，PKS是一種散發(fā)的罕見染色體疾病，具有復(fù)雜的臨床表現(xiàn)及特殊的遺傳學(xué)特征，臨床上往往容易漏診,所以準(zhǔn)確有效的產(chǎn)前診斷是避免缺陷患兒出生，減輕患兒家庭和社會(huì)負(fù)擔(dān)的最佳手段。臨床上，在產(chǎn)前發(fā)現(xiàn)羊水過多、先天性膈疝、過度發(fā)育的胎兒時(shí)應(yīng)該高度警惕，同時(shí)建議孕婦完善產(chǎn)前診斷。此外，隨著NIPT技術(shù)的飛速發(fā)展，相信其在產(chǎn)前檢測領(lǐng)域?qū)?huì)做出更大的貢獻(xiàn)。