褪黑素對鹽堿復(fù)合脅迫下垂絲海棠光合及生理特性的影響

高立楊 劉兵 張瑞 張夏燚 王延秀

(甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，甘肅 蘭州 730070)

我國是世界上最大的蘋果生產(chǎn)國[1]，西北黃土高原產(chǎn)區(qū)是我國四大蘋果主產(chǎn)區(qū)之一，具有海拔高、光照充足、晝夜溫差大等優(yōu)勢，但該區(qū)多為石灰質(zhì)土壤，70%以上的土壤為含NaCl與NaHCO3的鹽堿土壤，嚴(yán)重制約蘋果產(chǎn)業(yè)的發(fā)展[2].因此研究耐鹽堿砧木對于鹽堿地區(qū)的蘋果種植具有重要意義.

褪黑素(melatonin,MT)是廣泛存在于動(dòng)植物體內(nèi)一類重要的吲哚類化合物[3].有研究表明，雖然褪黑素在植物體內(nèi)含量極低，卻可以大大提高植物的耐性，緩解干旱、低溫、鹽堿等脅迫環(huán)境對植物造成的傷害[4].LI等[5]在湖北海棠上的研究發(fā)現(xiàn)，褪黑素可以有效緩解鹽脅迫下葉片葉綠素的降解，提高光合速率；王平等[6]證實(shí)褪黑素可以有效延緩植物葉片衰老，提高光合能力；此外，楊新元[7]在向日葵上的研究表明，外源褪黑素可顯著提升干旱脅迫下向日葵幼苗葉片的Pn、Gs、Tr,提高抗氧化酶活性和葉綠素含量.

有關(guān)鹽堿脅迫對植物生理特性的影響已有眾多報(bào)道[8-12]，土壤鹽漬化會(huì)對植物造成滲透脅迫、離子毒害、氧化脅迫以及改變液泡和細(xì)胞pH等危害，當(dāng)脅迫濃度超過植株最大耐受力，植物就會(huì)發(fā)生萎蔫，甚至枯死.張瑞等[9]研究發(fā)現(xiàn)，在鹽堿復(fù)合脅迫下，‘長富二號’和‘煙富六號’蘋果的凈光合速率、氣孔導(dǎo)度、蒸騰速率等光合參數(shù)隨脅迫時(shí)間的延長均出現(xiàn)下降趨勢；孫璐等[10]指出，鹽堿脅迫破壞了PSⅡ中心，抑制了光合電子傳遞，造成了植物葉綠素合成受阻及光合速率下降.郭淑華等[11]在葡萄上證實(shí)了鹽堿脅迫下光合色素含量呈降低趨勢；金微微等[12]則報(bào)道了在鹽堿脅迫下，由于滲透脅迫，使細(xì)胞膜系統(tǒng)受損，電解質(zhì)外滲造成相對電導(dǎo)率升高，葉片失水等;范海霞等[13]研究發(fā)現(xiàn)，鹽堿脅迫下，造成活性氧的積累，植物依靠抗氧化系統(tǒng)的啟動(dòng)，大量積累SOD、POD等抗氧化酶來清除活性氧，以緩解氧化脅迫.前人研究中對單鹽單堿的協(xié)迫研究較多，而對鹽堿復(fù)合脅迫對植物生理特性的影響鮮有研究.因此，探索外源物質(zhì)對植物在鹽堿復(fù)合脅迫下所受傷害的緩解作用，對生產(chǎn)中使用化學(xué)調(diào)控的手段來提高作物耐受性具有重要意義.

垂絲海棠(MalushallianaKoehne)原產(chǎn)于甘肅河西走廊，性喜陽光，可在微酸微堿條件下生長，是西北地區(qū)特色砧木[14].垂絲海棠作為一種珍貴的砧木資源，僅在國內(nèi)有幾篇在生產(chǎn)應(yīng)用方面的研究報(bào)道.故本研究選用7～8葉齡的垂絲海棠實(shí)生苗為試驗(yàn)材料，探討垂絲海棠幼苗外源噴施不同濃度褪黑素后，在鹽堿脅迫下生理生化指標(biāo)的變化，旨在篩選出緩解鹽堿脅迫對垂絲海棠傷害的最適褪黑素濃度，為西北產(chǎn)區(qū)利用化學(xué)手段調(diào)控作物耐受性提供依據(jù).

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料及設(shè)計(jì)

試驗(yàn)于2018年3月～2018年9月在甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)避雨棚中進(jìn)行.2018年3月對垂絲海棠種子進(jìn)行消毒并層積處理，4月在穴盤播種，5月份移栽至盛裝0.6 kg基質(zhì)(20%蛭石、20%珍珠巖、60%泥炭)，直徑12 cm，深30 cm的花盆內(nèi)，每盆1株，進(jìn)行統(tǒng)一管理，待幼苗生長至7～8葉齡時(shí)開始處理.噴施50(T1)、100(T2)、200(T3)、300(T4)、400 μmol/L(T5)的褪黑素溶液，每株噴施20 mL，每2 d噴施1次，共噴施3次.于最后一次噴施后的第2天每株一次性澆灌500 mL加鹽Hogland營養(yǎng)液(100 mmol/L，50 mmol/L NaCl與 50 mmol/L NaHCO3按摩爾比1∶1混合)，對照CK1(未噴施褪黑素+Hogland營養(yǎng)液)，CK2(未噴施褪黑素 +Hogland營養(yǎng)液+100 mmol/L鹽)澆灌體積相同；每個(gè)處理15株，3次重復(fù)，每重復(fù)5株，之后每3天澆灌1次Hogland營養(yǎng)液，并在花盆底部放置托盤，第2次澆灌時(shí)用營養(yǎng)液沖洗托盤澆入花盆，防止鹽的流失，保證脅迫一致.

1.2 測定指標(biāo)與方法

1.2.1 光合指標(biāo)及葉綠素含量的測定 分別于脅迫0、3、6、9 d后，采用LI-6400(LI-COR，Linco ln，NE，USA)便攜式光合儀于晴天早上9∶00～11∶00，選取接穗向陽、成熟的葉片測定凈光合速率(Pn)、蒸騰速率(Tr)、胞間CO2濃度(Ci)、氣孔導(dǎo)度(Gs)，重復(fù)6次.光合儀系統(tǒng)控制葉片溫度25 ℃，測定系統(tǒng)采用開放式氣路，自然光源，光合有效輻射為400～600 μmol/(m2·s)，葉室內(nèi)空氣流量設(shè)定為500 mL/min，室內(nèi)CO2體積分?jǐn)?shù)為(385±10)μL/L.

與氣體交換參數(shù)測定同步進(jìn)行，采用葉綠素計(jì)(Minolta SPAD-502Chloropyhll Meter,Japan)測定相對葉綠素含量.

1.2.2 相對電導(dǎo)率的測定 測定時(shí)間同1.2.1，相對電導(dǎo)率采用電導(dǎo)法[9]，用電導(dǎo)率儀(DDS-307)測定.

1.2.3 葉片相對含水量的測定 測定時(shí)間同1.2.1，從植株上用剪刀分離葉片，稱取鮮質(zhì)量后裝入紙袋，105 ℃殺青1 h，在80 ℃下烘干至恒質(zhì)量后稱取干質(zhì)量，葉片相對含水量計(jì)算公式：

1.2.4 SOD、POD酶活性測定 測定時(shí)間同1.2.1，超氧化物歧化酶(SOD)和過氧化物酶(POD)活性采用李合生[16]的方法測定.

1.3 數(shù)據(jù)分析

用Microsoft Office Excel 2013及Origin 2017進(jìn)行數(shù)據(jù)處理及作圖，采用SPSS 22.0單因素ANOVA的LSD進(jìn)行差異顯著性分析.

2 結(jié)果與分析

2.1 鹽堿復(fù)合脅迫下褪黑素對垂絲海棠相對電導(dǎo)率的影響

由圖1可得，隨著脅迫時(shí)間的延長，T1～T5和CK2葉片相對電導(dǎo)率均呈逐漸升高趨勢，而CK1基本無變化.脅迫至第3天時(shí)，CK1的相對電導(dǎo)率顯著低于CK2，T1、T2、T4、T5顯著高于CK1，且顯著低于CK2(P<0.05)，T3顯著低于CK2且與CK1無顯著差異(P<0.05).脅迫至第9天時(shí)，CK1的相對電導(dǎo)率顯著低于CK2，T1、T2、T3、T4、T5的相對電導(dǎo)率均顯著高于CK1，且顯著低于CK2(P<0.05)，比CK1分別升高了47.19%、35.64%、26.24%、40.17%和45.18%.由此可見T3膜受損害的程度最小.

圖1 鹽堿脅迫下不同濃度褪黑素處理對垂絲海棠相對電導(dǎo)率的影響

2.2 鹽堿復(fù)合脅迫下褪黑素對垂絲海棠葉片相對含水量的影響

由圖2可得，隨著脅迫時(shí)間的延長，T1～T5和CK2的葉片相對含水量呈逐漸降低趨勢，CK1無顯著變化，脅迫至第3天時(shí)，T1～T5的葉片相對含水量均顯著低于CK1，而顯著高于CK2(P<0.05).脅迫至第9天時(shí)，T1～T5的葉片相對含水量均顯著低于CK1，且顯著高于CK2，較CK2分別提高了45.48%、64.24%、80.91%、66.16%和55.41%.由此可見T3的耐性最強(qiáng).

2.3 鹽堿復(fù)合脅迫下褪黑素對垂絲海棠相對葉綠素含量的影響

由圖3可得，隨著脅迫時(shí)間延長，所有處理組的相對葉綠素含量均呈降低趨勢.脅迫至第3天時(shí)，T1、T2、T4、T5相對葉綠素含量顯著低于T3和CK1，而顯著高于CK2(P<0.05)，T3與CK1無顯著差異，但顯著高于CK2(P<0.05).脅迫至第9天時(shí)，所有處理的相對葉綠素含量均顯著低于CK1，而顯著高于CK2(P<0.05)，分別比CK2高131.10%、99.90%、166.69%、123.22%和105.93%.

2.4 鹽堿復(fù)合脅迫下褪黑素對垂絲海棠氣體交換參數(shù)的影響

由圖4可得，脅迫至第9天時(shí)，T1～T5的Pn、Gs、Tr均顯著低于CK1，而顯著高于CK2(P<0.05)；Ci顯著高于CK1，而顯著低于CK2(P<0.05).Pn分別比CK2提高32.20%、55.41%、71.30%、52.25%、24.54%；Gs分別比CK2提高40.38%、65.25%、110.17%、65.57%、41.25%；Tr分別比CK2提高14.10%、27.27%、50.79%、45.27%、29.31%；Ci比CK2分別降低15.25%、22.88%、31.36%、22.03%、13.98%.

圖3 鹽堿脅迫下不同濃度褪黑素處理對垂絲海棠相對葉綠素含量的影響

圖4 鹽堿脅迫下不同濃度褪黑素處理對垂絲海棠氣體交換參數(shù)的影響

2.5 鹽堿復(fù)合脅迫下褪黑素對垂絲海棠抗氧化酶活性的影響

由圖5可得，隨著脅迫時(shí)間的延長，所有處理組的SOD活性均呈先升后降的趨勢，脅迫至第3天，所有處理SOD活性均高于處理前，其中T1和T5達(dá)到峰值，分別為106.89 U/g和104.99 U/g；脅迫至第6天時(shí)，T2、T3、T4的SOD活性達(dá)到峰值，分別為120.31、130.89、119.61 U/g；脅迫至第9天時(shí)，所有處理的SOD活性均顯著高于CK2(P<0.05)，較CK2分別提高9.75%、34.35%、53.02%、33.50%和8.47%，且CK1與CK2無顯著差異(P<0.05).

由圖6可得，隨著脅迫時(shí)間的延長，所有處理組的POD活性均呈先升后降的趨勢，脅迫至第3天時(shí)，所有處理POD活性均出現(xiàn)上升，其中T1和T5達(dá)到峰值，分別為180.96、180.21 μmol/(g·min)；脅迫至第6天時(shí)，T2、T3、T4的SOD活性達(dá)到峰值，分別為190.32、213.85、192.21 μmol/(g·min)；脅迫至第9天時(shí)，所有處理和CK1的SOD活性均顯著高于CK2(P<0.05)，較CK2分別提高19.99%、65.55%、90.51%、67.29%、18.24%和21.97%，且CK1與CK2無顯著差異(P<0.05).

圖5 鹽堿脅迫下不同濃度褪黑素處理對垂絲海棠SOD活性的影響

圖6 鹽堿脅迫下不同濃度褪黑素處理對垂絲海棠SOD活性的影響

3 討論

3.1 鹽堿復(fù)合脅迫下褪黑素對垂絲海棠相對電導(dǎo)率的影響

細(xì)胞膜是細(xì)胞維持穩(wěn)定胞內(nèi)代謝環(huán)境的必要屏障[17]，其選擇透過性可以調(diào)節(jié)物質(zhì)的進(jìn)出.大量研究表明，植物在鹽堿復(fù)合脅迫下，由于離子毒害、pH和滲透脅迫作用，會(huì)造成細(xì)胞膜受損，進(jìn)而造成離子外滲[18].相對電導(dǎo)率可以反映植物在逆境條件下透性變化和膜受損程度，相對電導(dǎo)率越高，說明植物受傷害程度越高[19].本試驗(yàn)中，隨著脅迫時(shí)間延長，所有處理的相對電導(dǎo)率均呈上升趨勢，說明鹽堿復(fù)合脅迫下垂絲海棠的膜系統(tǒng)被破壞造成了電解質(zhì)外滲，這與王碩[20]在紫花苜蓿上的研究結(jié)果相一致.此外，Dinneny等[21]研究表明，鹽堿脅迫下，植物離子吸收平衡被破壞，Na+大量積累，對細(xì)胞產(chǎn)生了專性毒害作用，進(jìn)而使電導(dǎo)率升高.脅迫9 d時(shí)，所有處理的相對電導(dǎo)率相比于CK1均有所上升，T3上升幅度最小，說明T3的膜受損傷程度最低，即200 μmo/L的褪黑素對垂絲海棠在鹽堿復(fù)合脅迫下所受傷害緩解作用最好.劉旭等[22]在煙草上也證實(shí)了鹽堿脅迫下褪黑素可以有效緩解煙草所受傷害.此外，Murch等[3]研究發(fā)現(xiàn)，植株葉片中離子通道 Na+和 K+轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因(NHX1和 AKT1)顯著上調(diào)，液泡膜中的NHX能夠?qū)⑦^量的Na+區(qū)隔于液泡中，降低胞質(zhì)中 Na+含量，減輕過量 Na+對細(xì)胞質(zhì)中代謝酶的毒害，維持離子穩(wěn)態(tài)，進(jìn)而提高植株耐鹽性.因此，本試驗(yàn)中，褪黑素緩解垂絲海棠葉片細(xì)胞膜傷害可能與Na+和 K+轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因(NHX1和AKT1)的上調(diào)有關(guān).

3.2 鹽堿復(fù)合脅迫下褪黑素對垂絲海棠光合、葉片相對含水量的影響

光合作用可作為判斷植物長勢和抗逆性強(qiáng)弱的重要指標(biāo).大量的研究表明，鹽堿脅迫下影響光合作用的因素包括氣孔和非氣孔因素,當(dāng)Ci和Gs同時(shí)降低時(shí)，光合速率降低是由氣孔因素引起，反之，則為非氣孔因素[23-24]，這與本文研究結(jié)果相一致.在鹽堿復(fù)合脅迫下，脅迫至第9天時(shí)，所有處理和CK2的Pn、Gs、Ci、Tr均顯著高于CK1，說明本試驗(yàn)中引起垂絲海棠光合能力下降的主導(dǎo)因素為非氣孔因素.這可能是鹽堿復(fù)合脅迫誘導(dǎo)的滲透脅迫、離子毒害和高pH損害PSⅡ氧化側(cè)的放氧復(fù)合物的功能，使它向PSⅡ反應(yīng)中心提供的電子數(shù)量減少，進(jìn)而導(dǎo)致植株光合能力下降[25].本試驗(yàn)所有處理中，T2的Pn和Gs最高，Ci最低，說明較高的Gs為T2葉片提供了充足的水分，使其保持了較高的Pn和同化率這與本試驗(yàn)中葉片相對含水量的研究結(jié)果相吻合，也與范慧玲等[26]在蕓芥上的研究結(jié)果相一致.閆萌萌等[27]研究表明，不同光質(zhì)對花生幼苗葉片葉綠素含量的影響不同，葉綠素含量增加,則光合效率高.本試驗(yàn)中，相對葉綠素含量的變化趨勢與Pn相同.于爽等[28]在龍葵幼苗上也得出相同結(jié)論，即鹽堿復(fù)合脅迫下，葉綠素含量呈降低趨勢，進(jìn)而使光合速率下降.以上說明非氣孔因素對植物光合的影響是多方面的.此外李猛等[22]在煙草應(yīng)對鹽脅迫的研究中，植株的Ci呈降低趨勢，而本試驗(yàn)中Ci則呈上升趨勢，可能是作物特性不同和氣孔因素造成的.

3.3 鹽堿復(fù)合脅迫下褪黑素對垂絲海棠抗氧化酶活性的影響

鹽堿復(fù)合脅迫下，由于植物光合作用被抑制，過剩的光能會(huì)對植物的膜系統(tǒng)造成破壞，產(chǎn)生大量的活性氧、自由基，形成氧化脅迫，對植物造成嚴(yán)重傷害[29].SOD、POD能夠清除生物體內(nèi)超氧陰離子自由基，延緩植株衰老，保護(hù)機(jī)體免受自由基的傷害[30].本試驗(yàn)中，所有處理的SOD、POD活性均呈先升后降趨勢，T1、T5、CK2的兩種抗氧化酶活性在第3天時(shí)達(dá)到峰值，T2、T3、T4則是在第6天時(shí)達(dá)到峰值，達(dá)到峰值說明已經(jīng)達(dá)到了植株最大耐受性，突破此臨界值時(shí)后又開始下降.與王鑫[31]在羊草上的研究結(jié)果相一致，在鹽堿脅迫下，羊草的SOD、POD活性呈先升后降的趨勢.這是由于植物通過抗氧化酶系統(tǒng)的啟動(dòng)來清除活性氧，緩解植物在脅迫下所受的滲透傷害，當(dāng)脅迫超過植株最大耐受力后，抗氧化酶系統(tǒng)完全被破壞，SOD、POD活性出現(xiàn)下降[32].王平等[6]在平邑甜茶上的研究發(fā)現(xiàn)，外源褪黑素可延緩葉片衰老，且抑制與植物衰老有關(guān)的基因(SAG12)的轉(zhuǎn)錄水平，這一結(jié)果被認(rèn)為是外源褪黑素增強(qiáng)了植株抗氧化能力.本試驗(yàn)中，T3的兩種酶活性峰值出現(xiàn)的時(shí)間晚于T1和T5，且T3峰值高于所有處理，說明T3的抗氧化能力最強(qiáng).

4 結(jié)論

綜上所述，鹽堿復(fù)合脅迫下適宜濃度的褪黑素通過提高垂絲海棠相對葉綠素含量、葉片相對含水量、光合能力，增強(qiáng)抗氧化酶活性，改善滲透調(diào)節(jié)來緩解鹽堿復(fù)合脅迫對植物的傷害.且褪黑素具有濃度效應(yīng)，200 μmol/L為最佳濃度.