香蕉皮多酚對D-半乳糖致衰大鼠皮膚的改善作用

王昱

(隴南師范高等?？茖W校農(nóng)林技術(shù)學院，隴南特色農(nóng)業(yè)生物資源研究開發(fā)中心，甘肅 成縣 742500)

皮膚是人體最大的器官，具有保護、感覺、調(diào)節(jié)體溫、吸收、分泌與排泄、新陳代謝等生理功能.隨著年齡增加，皮膚結(jié)構(gòu)退變、功能衰退，臨床表現(xiàn)為皮膚變薄、彈性減退、干燥粗糙、色素沉著、皺紋出現(xiàn)、血管突顯等[1].然而皮膚衰老的具體機制仍不明確.越來越多研究表明，自由基損傷、免疫力功能減退、端粒酶活性下降、炎癥反應(yīng)等在皮膚衰老中具有關(guān)鍵作用[2-3].西醫(yī)多采用外科手術(shù)提緊皮膚、注射肉毒素、皮下注射膠原等方法進行治療，但存在風險性和副作用.研究表明，基質(zhì)金屬蛋白酶-1(matrix metalloproteinases-1,MMP-1)屬于細胞外基質(zhì)金屬蛋白酶家族(matrix metalloproteinases,MMPs)，是分解皮膚膠原蛋白和降解細胞外基質(zhì)的關(guān)鍵酶[4].水通道蛋白3(aquaporin3,AQP3)屬于水-甘油通道亞家族，主要分布于皮膚表皮層中，是皮膚水轉(zhuǎn)運過程中的關(guān)鍵蛋白[5-6].香蕉皮多酚(banana peels polyphenol)是香蕉皮的主要活性成分之一，具有抗真菌、抗癌、抗炎、抗氧化、抗氧化和降血脂等作用[7-8]，并在食品保鮮和化妝品等方面也有應(yīng)用[9-12].本研究擬采用D-半乳糖(D-galactose,D-gal)復制大鼠衰老模型，探討香蕉皮多酚對D-gal致衰大鼠皮膚的保護作用及機制.

1 材料與方法

1.1 香蕉皮多酚提取制備

香蕉皮多酚由本實驗室從香蕉皮中提取(98% HPLC)：參照文獻[13]，稱取100 g香蕉皮，切片，沸水中熱燙3～5 min，用80%乙醇溶液、浸提溫度80 ℃、時間為3 h、浸提2 次，合并濾液，離心，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)回收乙醇，有機溶劑萃取分離純化，冷凍干燥得到香蕉皮多酚提取物.

1.2 構(gòu)建衰老大鼠模型與分組給藥

健康SD大鼠30只(購于蘭州大學實驗動物中心，許可證編號：SCXK(甘)2005-0007，體質(zhì)量200～250 g，雌雄各半)，同條件飼養(yǎng)一周后隨機分為3組，每組10只，分為對照組、衰老模型組和香蕉皮多酚組.衰老模型組和香蕉皮多酚組大鼠頸背部皮下注射D-半乳糖(北京優(yōu)尼康生物科技，批號MG05201)溶液(以體質(zhì)量計)300 mg/kg[3]，同時香蕉皮多酚組灌胃(以體質(zhì)量計)120 mg/kg的香蕉皮多酚[10]，對照組每天注射等量的0.9%生理鹽水，1次/日，連續(xù)處理7周.

1.3 形態(tài)學和組織學觀察

構(gòu)建動物模型過程中每天觀察各組大鼠精神狀態(tài)、毛色、活動情況、飲食及飲水量等.于試驗第 43天，每個試驗組隨機選5只大鼠，采用頸椎脫臼法處死大鼠，用 8%硫化鈉溶液脫毛后立即取其背部正中皮膚(0.5 cm×0.5 cm大小)2塊，去掉皮下脂肪及結(jié)締組織，投入4%多聚甲醛液固定24 h，常規(guī)石蠟包埋切片(6 μm)，HE染色，在光學顯微鏡(Olympus，F(xiàn)X-35WA，Japan)下觀察并拍照.

1.4 細胞凋亡及膠原蛋白含量的測定

每個試驗組隨機選5只大鼠，取其背部皮膚，去除皮下脂肪，分離表皮和真皮層，將真皮放入盛有無血清HBSS液(Hanks平衡鹽緩沖溶液)的培養(yǎng)皿中沖洗，用眼科剪剪碎再用彎頭吸管反復吹打，0.125%胰蛋白酶和 0.01%的EDTA在37℃水浴消化液30 min，終止消化后棄去消化液，收集細胞用吖啶橙/溴化乙啶(Sigma公司)熒光雙染法(1∶1)染色，熒光顯微鏡(Olympas，IX71，Japan)計數(shù)分析細胞凋亡率，并按照ELISA檢測試劑盒(ELx800，美國BioTek公司)說明書操作，檢測Ⅰ型、Ⅱ型膠原蛋白的含量.

1.5 PCR檢測皮膚組織MMP-1、AQP3 mRNA的表達

引物由上海涵悅生物科技有限公司設(shè)計，引物序列見表1.引物由生工生物工程(上海)技術(shù)有限公司合成.取大鼠皮膚，放入2 m L的離心管，加入1 m L Trizol后用勻漿器反復研磨，離心(12 000 r/min)15 min，取上清液通過酚-氯仿抽提RNA，將抽提的RNA 進行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，實時熒光定量PCR擴增(RNA抽提試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑、實時熒光定量PCR試劑購自Taka Ra公司).PCR按照試劑盒說明書進行操作(7900 HT Sequence Detection System定量PCR儀，美國ABI)，反應(yīng)完畢采用 ABI 7500 軟件分析，用公式 2-△△Ct方法進行相對定量.

表1 目的基因引物序列

1.6 Western-blot各組蛋白質(zhì)表達

按照常規(guī)方法提取細胞總蛋白，BCA法測定總蛋白濃度.定量后稀釋好的樣品經(jīng)過SDS-PAGE凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜、封閉(5%脫脂奶粉，用TBST稀釋).將膜取出，加單克隆兔抗鼠水通道蛋白3、基質(zhì)金屬蛋白酶-1(濃度均為1∶2 000)，4 ℃冰箱過夜，充分洗滌，加偶聯(lián)辣根過氧化物酶(HRP)的二抗(濃度為1∶5 000)，室溫下作用1 h，洗膜后加ECL發(fā)光液，以β-actin作為內(nèi)參照，運用Image Lab 軟件進行曝光成像，采用Quantity one 軟件分析條帶灰度值，試驗重復3次.

1.7 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 大鼠衰老動態(tài)情況觀察

大鼠皮下連續(xù)注射D-gal，共7周，大鼠逐漸出現(xiàn)毛色晦暗，脫落，皮膚彈性差，嗜睡，精神萎靡，進食量明顯減少，呈現(xiàn)明顯衰老體征.而對照組和香蕉皮多酚組大鼠無明顯相關(guān)體征.

2.2 香蕉皮多酚對大鼠皮膚組織結(jié)構(gòu)的影響

對照組大鼠皮膚組織結(jié)構(gòu)正常，表皮、真皮及皮下組織結(jié)構(gòu)完整(圖1-A).衰老模型組大鼠皮膚結(jié)構(gòu)出現(xiàn)明顯病理行變化，層次不清，表皮變薄，毛囊和皮脂腺數(shù)目嚴重減少，結(jié)締組織增生明顯(圖1-B).與衰老模型組相比，香蕉皮多酚組大鼠皮膚組織結(jié)構(gòu)相對完整，毛囊與皮脂腺數(shù)目增多.表皮和真皮組織增厚，真皮層的膠原纖維分布均勻，排列整齊(圖1-C).

2.3 各試驗組大鼠皮膚Ⅰ、Ⅱ型膠原蛋白的含量

與對照組相比，衰老模型組成纖維細胞Ⅰ、Ⅱ型膠原蛋白含量顯著降低(P<0.01).與衰老模型組相比，香蕉皮多酚組成纖維細胞Ⅰ、Ⅱ型膠原蛋白含量明顯增多(P<0.05，P<0.01，圖2).

2.4 各試驗組大鼠皮膚的細胞凋亡

吖啶橙和溴化乙啶染料與DNA結(jié)合后在熒光下有不同的吸收值，亦可見細胞核中染色質(zhì)濃縮的形態(tài)學特點，從而觀察細胞的凋亡情況.在熒光顯微鏡下活細胞呈現(xiàn)均勻的綠色；早期凋亡細胞呈綠色，染色質(zhì)凝聚或核裂解，細胞核中有鮮綠色的斑點；晚期凋亡細胞呈橙色，細胞核凝聚并常常裂解；壞死細胞呈橙色，無染色質(zhì)凝聚.由圖3可知，各實驗組大鼠皮膚細胞均有不同程度的細胞死亡情況.與對照組相比，衰老模型組大鼠皮膚的細胞凋亡率顯著升高(P<0.01)，對照組和香蕉皮多酚組大鼠皮膚的細胞凋亡率顯著低于衰老模型組(P<0.01，表2).

A：對照組；B：衰老模型組；C：香蕉皮多酚組；D：真皮；E：表皮；H：皮下組織；標尺示50 μm.

與對照組比較 * P<0.05，** P<0.01；與衰老模型組比較 ▲P<0.01，▲▲ P<0.01.

表2 香蕉皮多酚對大鼠皮膚細胞凋亡率的影響

與對照組比較 *P<0.05，**P<0.01；與衰老模型組比較▲P<0.01，▲▲P<0.01.

*P<0.05，**P<0.01,vs.control group；▲P<0.01，▲▲P<0.01,vs.aging model group.

A：對照組；B：衰老模型組；C：香蕉皮多酚組，標尺示20 μm.

2.5 香蕉皮多酚對大鼠皮膚組織MMP-1和AQP-3表達的影響

MMP-1、AQP-3 和β-actin 的分子量分別為27，36，43 kb，條帶清晰.以β-actin 的吸光度值作為內(nèi)參照，對各組條帶的吸光度值校正后進行半定量分析.與對照組相比，衰老模型組大鼠皮膚組織MMP-1蛋白含量極顯著升高，而AQP-3蛋白含量極顯著降低(P<0.01).經(jīng)香蕉皮多酚干預后，大鼠皮膚組織MMP-1蛋白含量明顯降低，而AQP3 蛋白含量明顯升高(P<0.05，P<0.01).以上結(jié)果與PCR檢測MMP-1和AQP-3 mRNA結(jié)果一致(表3，圖4).

表3 香蕉皮多酚對大鼠皮膚組織MMP-1和AQP3 mRNA表達的影響

與對照組比較 *P<0.05，**P<0.01；與衰老模型組比較▲P<0.01，▲▲P<0.01.

*P<0.05，**P<0.01,vs.control group；▲P<0.01，▲▲P<0.01,vs.aging model group.

1：對照組；2：衰老模型組；3：香蕉皮多酚組；與對照組比較 * P<0.05，** P<0.01；與衰老模型組比較 ▲P<0.01，▲▲ P<0.01.

3 討論

D-gal 是公認的致衰劑，廣泛用于動物衰老模型和細胞體外衰老模型的復制，其構(gòu)建衰老模型動物的各種生理、生化指標均與自然衰老相似[14-17].本研究采用D-gal 復制大鼠衰老模型，衰老模型組大鼠皮膚組織結(jié)構(gòu)出現(xiàn)了明顯的形態(tài)病理改變，皮膚組織結(jié)構(gòu)不完整，層次不清，表皮變薄，附屬器官減少，結(jié)締組織增生，Ⅰ、Ⅱ型膠原蛋白含量明顯減少，大量的細胞凋亡.已有研究報道，衰老的皮膚細胞出現(xiàn)核固縮、凋亡小體形成、粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腫脹、空泡形成等改變[18]，膠原纖維減少，皮膚在形態(tài)學上則表現(xiàn)為表皮變薄，表皮突和真皮乳頭減少，真皮層膠原纖維排列紊亂，皮膚彈性降低[19]，這提示皮膚的衰老與膠原蛋白結(jié)構(gòu)改變、數(shù)量減少及皮膚細胞凋亡有密切關(guān)系.本研究在復制大鼠衰老模型過程中灌胃香蕉皮多酚干預皮膚衰老進程，結(jié)果顯示，皮膚組織結(jié)構(gòu)相對完整，表皮增厚，真皮內(nèi)膠原纖維增多，毛囊與皮脂腺數(shù)目增多，細胞凋亡率明顯降低，這表明香蕉皮多酚能有效拮抗D-gal對大鼠皮膚的致衰作用.

現(xiàn)代衰老生物學理論認為，隨年齡增加機體組織器官逐漸出現(xiàn)結(jié)構(gòu)退變，而皮膚的衰老過程極其復雜，與遺傳、免疫、自由基、細胞外基質(zhì)、細胞因子等許多因素相關(guān)[1].本試驗用實時熒光定量PCR檢測大鼠皮膚組織MMP-1和AQP3mRNA基因的表達水平時，同時采用Western-blotting檢測了大鼠皮膚組織MMP-1和AQP3蛋白的含量.正常皮膚組織中MMP-1蛋白的表達量極少，但在皮膚損傷、炎性浸潤、創(chuàng)傷修復等情況下，MMP-1大量表達，從而破壞膠原纖維和彈性纖維的正常結(jié)構(gòu)，皮膚膠原蛋白分解增多，皮膚變薄，導致皮膚出現(xiàn)皺縮細紋等衰老癥狀[20].本試驗結(jié)果顯示，衰老模型組大鼠皮膚中MMP-1基因表達顯著升高，經(jīng)香蕉皮多酚干預后，大鼠皮膚組織中MMP-1表達顯著降低，提示香蕉皮多酚可通過下調(diào)MMP-1基因的表達來降低MMP-1蛋白的合成，延緩膠原降解、恢復纖維結(jié)構(gòu)，從而發(fā)揮延緩皮膚衰老的作用.

AQP3可通過增加表皮水分和水合作用，提高皮膚甘油和尿素等溶質(zhì)的通透性，從而減少水分的丟失，起到保濕作用[21-22].也可與中間絲相關(guān)蛋白協(xié)同完成皮膚的屏障修復[23].亦有研究表明，AQP3與皮膚自然衰老及光老化有密切關(guān)系，當皮膚缺失AQP3或暴露于紫外線時，會導致皮膚干燥和老化[24-25].因此，AQP3可作為抗衰老藥物的作用靶點，在皮膚衰老過程中及延緩衰老治療中有很重要的研究意義.本試驗結(jié)果顯示，衰老模型組大鼠皮膚中AQP3基因表達顯著降低，經(jīng)香蕉皮多酚作用后，大鼠皮膚組織中AQP3表達顯著上調(diào)，提示香蕉皮多酚可通過增加AQP3的表達量，使皮膚細胞的水合能力、甘油的轉(zhuǎn)運能力增加，從而改善皮膚表面粗糙等衰老表現(xiàn)，起到抗皮膚衰老的作用.

4 結(jié)論

綜上所述，香蕉皮多酚對衰老大鼠皮膚組織的損傷有明顯的保護作用，這種作用可能與增加膠原蛋白含量、抑制皮膚細胞凋亡、調(diào)節(jié)MMP-1和AQP3基因的表達有關(guān).香蕉皮多酚作為一種天然產(chǎn)物，可開發(fā)用于美容治療及美容保健的功能性食品.