豬源大腸埃希菌喹諾酮類耐藥基因的檢測及分析

王婧，刁小龍，陳曉蘭，王帥兵，楊海峰

(1.江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學(xué)院，江蘇 泰州 225300；2.中崇信諾生物科技泰州有限公司，江蘇 泰州 225300)

大腸埃希菌是人醫(yī)和獸醫(yī)臨床最常見的致病菌之一，給畜牧養(yǎng)殖業(yè)造成嚴重的經(jīng)濟損失，同時大腸埃希菌也是革蘭氏陰性菌中最易產(chǎn)生耐藥性的細菌.喹諾酮類藥物是臨床廣泛應(yīng)用的抗感染藥物，伴隨這類藥物的長期應(yīng)用，細菌對其耐藥性已迅速發(fā)展.喹諾酮類藥物的耐藥機制主要有以下3種，喹諾酮類藥物作用靶點DNA促旋酶和拓撲異構(gòu)酶Ⅳ的突變，其中DNA促旋酶由GyrA和GyrB兩個亞單位構(gòu)成，拓撲異構(gòu)酶Ⅳ由ParC和ParE兩個亞單位構(gòu)成，突變位點多發(fā)生于GyrA和ParC亞單位；介導(dǎo)喹諾酮類耐藥質(zhì)粒的獲得，包括qnr，qepA，aac(6’)-Ib-cr，oqxA等[1]；染色體的突變降低喹諾酮類藥物的攝入或增加其流出，導(dǎo)致細胞內(nèi)藥物濃度降低而造成喹諾酮類藥物耐藥[2].染色體的突變通常可導(dǎo)致高水平的耐藥，而質(zhì)粒的獲得一般只引起低水平耐藥.然而，令人擔(dān)憂的是編碼可移動的抗生素耐藥基因在人類、動物和環(huán)境之間的跨界傳播[3].

抗生素耐藥基因通常和一些可移動的基因元件，例如插入序列，噬菌體，轉(zhuǎn)座子和質(zhì)粒等相聯(lián)系，這增強了耐藥基因在不同種細菌之間有效傳播的能力.不僅如此，移動基因元件還可頻繁獲得多種抗生素耐藥基因，使細菌具有多藥耐藥性.而喹諾酮類藥(plasmid mediated quinolone resistance,PMQR)就具有這樣的特性，它更容易由于基因的水平轉(zhuǎn)移而使耐藥性變得更為普遍，應(yīng)當(dāng)受到重視[1].

大腸埃希菌極易通過食物鏈或接觸等方式將其攜帶的耐藥基因進行傳播和擴散[4]，給人類健康和公共衛(wèi)生造成極大的威脅.因此開展豬源大腸埃希菌喹諾酮類耐藥基因的研究對于抑制質(zhì)粒介導(dǎo)的喹諾酮類耐藥迅速傳播具有重要意義.為了研究江蘇泰州地區(qū)豬源大腸埃希菌喹諾酮類藥物的耐藥情況，本研究對江蘇泰州地區(qū)豬場分離到的致病性大腸埃希菌耐喹諾酮類耐藥基因進行了檢測，為致病性大腸埃希菌的有效防治以及耐藥傳播機制的研究提供依據(jù).

1 材料與方法

1.1 試驗材料

2017年分離自江蘇省泰州市所轄地豬場采集的腹瀉仔豬肛門拭子，利用麥康凱瓊脂平板以及動物試驗最終分離得到致病性豬源大腸埃希菌81株.MH瓊脂培養(yǎng)基購自杭州百思生物技術(shù)有限公司，PCR相關(guān)試劑均購自TaKaRa試劑公司；藥敏紙片包括萘啶酸(naphthalene acid，NA)，氧氟沙星(ofloxacin，OFX)，環(huán)丙沙星(ciprofloxacin，CIP)，恩諾沙星(enrofloxacin，ENR)，諾氟沙星(norfloxacin，NOR)，購自杭州濱河微生物試劑有限公司.

1.2 試驗方法

1.2.1 藥敏試驗 利用紙片法對所有大腸埃希菌進行藥敏試驗，試驗結(jié)果根據(jù)美國臨床實驗室標準委員會公布的標準，按敏感，中介和耐藥3種形式對抑菌圈直徑大小進行判斷，為臨床治療選擇敏感藥物提供依據(jù)[5].

1.2.2 耐藥基因的檢測 試驗所用引物由上海生物工程有限公司合成，見表1.取500 μL菌液離心后棄上清，用100 μL滅菌水重懸后煮沸5 min作為PCR模板.PCR擴增程序參照表1中所列參考文獻進行.

1.2.3 序列測定 取5 μL PCR產(chǎn)物進行1.5%瓊脂糖凝膠電泳，切膠回收陽性產(chǎn)物，連同PCR引物送上海生物工程有限公司進行測序.

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用BLAST，DNAMAN，Clustal等軟件對所得序列進行分析.

2 結(jié)果與分析

2.1 藥敏試驗分析

根據(jù)美國臨床試驗室國家標準化管理委員會標準判定菌株對喹諾酮類藥物的敏感情況，統(tǒng)計結(jié)果見表2.

由表1可知，氧氟沙星對致病大腸埃希菌的敏感性較好，敏感菌株可達76.5%.除萘啶酸耐藥率最高外，對環(huán)丙沙星的耐藥現(xiàn)象最為嚴重，51.9%的菌株表現(xiàn)為耐藥.進一步對耐藥表型統(tǒng)計分析發(fā)現(xiàn)，共有14株細菌為單一耐藥，有6株細菌表現(xiàn)為對5種抗生素均耐藥(表3).

表1 喹諾酮類耐藥菌基因檢測引物

表2 致病性大腸埃希菌的藥敏反應(yīng)

表3 致病性大腸埃希菌的多重耐藥性

2.2 PMQR基因的PCR擴增

對泰州地區(qū)豬源大腸埃希菌進行喹諾酮類藥物耐藥基因進行PCR擴增和測序，并采用BLAST分析對PCR結(jié)果進行驗證.結(jié)果顯示PCR擴增的序列與GNEBANK登錄的qnr類基因相似度高達99%，表明PCR擴增結(jié)果無誤.最終共檢出28株攜帶qnrA基因，2株攜帶qnrB基因，37株攜帶qnrS基因，19株攜帶qnrD基因，62株aac(6′)-Ib-cr基因為陽性，檢出率最高，為76.5%，未檢出qepA，具體結(jié)果如表4所示，各基因電泳結(jié)果如圖1～4所示.

2.3 大腸埃希菌喹諾酮類耐藥表型與耐藥基因符合率分析

通過對81株致病性豬源大腸埃希菌對喹諾酮類藥物的耐藥表型以及攜帶PMQR因子的基因型之間的符合率進行分析[12]，符合率=(PMQR因子陽性菌株數(shù)/耐藥菌株數(shù))×100%.分析結(jié)果表明耐藥表型與基因型之間符合率最高的為qnrS，其中對氧氟沙星的符合率最高，為50%，其次是對萘啶酸的符合率為32.1%；其次為aac(6′)-Ib-cr基因，對環(huán)丙沙星的符合率最高，為47.6%，其次是對萘啶酸的符合率為30.4%，對其他3代喹諾酮類藥物的符合率為25.0%～29.7%.

表4 大腸埃希菌PMQR基因的檢測

圖1 部分qnrA基因的PCR

圖2 qnrB基因的PCR

圖3 部分qnrD基因的PCR

圖4 部分qnrS基因的PCR

2.4 QRDRs突變分析

對所有菌株的喹諾酮類藥物耐藥決定區(qū)域基因進行克隆和測序，對序列進行翻譯后進行比對，檢測到了多處突變(表6).其中g(shù)yrA基因上主要有3個位點發(fā)生突變，83位絲氨酸突變?yōu)楫惲涟彼?Ser83→Ile)的檢出率最高，高達84.0%；其次共有61.7%在87位的天冬氨酸發(fā)生突變，除最常見的突變?yōu)樘於０吠?Asp87→Asn)，有2株檢測到突變?yōu)槔野彼?Asp 87→Tyr)，1株突變?yōu)楣劝彼?Asp 87→Glu)；另外還檢測到1株細菌的104位的天冬氨酸突變?yōu)樘於０?Asp 104→Asn).gyrB基因有35.8%的突變發(fā)生在第426位，由天冬氨酸突變?yōu)楦拾彼?Asp 426→Gly).parC基因80位絲氨酸突變?yōu)楫惲涟彼?Ser80→Ile)檢出率為60.5%，只有1株檢測到64位丙氨酸突變?yōu)楦彼?Ala64→Pro)，分別檢出2株84位谷氨酸突變?yōu)楸彼?Glu 84→Ala)和91位谷氨酰胺突變?yōu)榻M氨酸(Gln 91→His).

表5 攜帶PMQR因子大腸埃希菌耐藥表型與基因的符合率

表6 QRDRs突變檢測

3 討論

喹諾酮類藥物在臨床上被廣泛應(yīng)用，其在國內(nèi)用藥量僅次于β-內(nèi)酰胺類藥物位居第二，腸桿菌科細菌對該類藥物的耐藥水平也在不斷提高.探究動物源性大腸埃希菌對喹諾酮的耐藥基因的流行情況對研究耐藥性的傳播機制和控制耐藥性的傳播具有重要意義.本試驗對前期從臨床分離到的豬源致病性大腸埃希菌對喹諾酮類藥物的藥物敏感性以及耐藥機制進行了研究.結(jié)果表明，這些菌株對萘啶酸的耐藥率最高，對氧氟沙星敏感性最好，且耐藥菌多數(shù)存在多藥耐藥現(xiàn)象.

PMQR介導(dǎo)的喹諾酮類耐藥基因主要有3類.1類是Qnr蛋白，它屬于五肽重復(fù)家族，主要通過物理保護DNA回旋酶和拓撲異構(gòu)酶Ⅳ介導(dǎo)喹諾酮類耐藥性的產(chǎn)生.QnrA是1998年第1個被發(fā)現(xiàn)的質(zhì)粒介導(dǎo)的喹諾酮類耐藥基因，至今已有100多種Qnr及其變異體被陸續(xù)報道，并被分為6類，分別為QnrA，QnrB，QnrS，QnrC，QnrD和QnrVC[13].另1種PMQR基因aac(6’)-Ib-cr是在2006年發(fā)現(xiàn)的，由于氨基糖苷乙酰轉(zhuǎn)移酶基因中2個重要氨基酸發(fā)生突變，Trp102Arg，Asp179Tyr，該突變可乙?；Z酮類藥物哌嗪環(huán)中C7未被取代的N原子，可以滅活環(huán)丙沙星和諾氟沙星，從而產(chǎn)生喹諾酮類耐藥[13].QepA是另1種質(zhì)粒介導(dǎo)的外排泵，使細菌降低對親水性氟喹諾酮類藥物如環(huán)丙沙星，諾氟沙星和恩諾沙星的敏感性[14].

PMQR通常介導(dǎo)細菌對喹諾酮類藥物產(chǎn)生低水平耐藥，且常常在各種來源的腸桿菌科細菌，諸如大腸埃希菌、克雷伯氏菌和沙門氏菌等中被檢測到，偶爾在一些非發(fā)酵細菌諸如假單胞菌，鮑曼不動桿菌等中發(fā)現(xiàn)，其中qnr類基因和aac(6’)-Ib-cr被報道的最多[13].本次試驗檢測的81株致病性大腸埃希菌PMQR基因中，aac(6′)-Ib-cr基因檢出率最高，為76.5%，這可能是造成檢測菌株對環(huán)丙沙星耐藥率的原因之一；其次是qnrS基因高達45.7%，未檢出qepA基因.qnr基因的檢出率均遠高于其他報道.aac(6′)-Ib-cr和qnrS的檢出率和國內(nèi)報道的其他種屬細菌檢出率類似[15-16].

2010年，張維秋等[17]對來自于江蘇、上海等地的403 株禽源大腸埃希菌的耐藥基因進行檢測，結(jié)果表明PMQR檢出率均較低，qnrB，qnrS，aac(6′)-Ib-cr和qepA基因的檢出率最高為1.5%，而藥敏試驗結(jié)果顯示這些菌株對喹諾酮類藥物都呈現(xiàn)不同程度的耐藥性.2012年，張麗等[18]對分離自連云港地區(qū)的88株大腸埃希菌的PMQR基因進行鑒定，未檢測到qnrA基因，而其qnrB，qnrS和aac(6′)-Ib-cr基因的檢出率最高為6.82%.2006年，王明貴等[19]對分離自上海78株人源大腸埃希菌檢測，發(fā)現(xiàn)只有7.7%呈現(xiàn)qnr基因陽性.2016年，坤清芳等[20]對采自四川的兔源大腸埃希菌喹諾酮藥物耐藥基因進行檢測，aac(6′)-Ib-cr的檢出率高達80.4%，qnrD和qnrS檢出率均為59.8%，并未檢測到qnrA，qnrB，qnrC，qepA.2018年，田亞凱等[21]在針對102 株犬源大腸埃希菌的PMQR基因進行檢測，qnrS檢出率為14.7%，qnrA，qnrB，qnrC，qnrD，qepA基因均未檢出.但其藥敏試驗表明這些細菌對恩諾沙星和環(huán)丙沙星的耐藥率分別達到71.57%和64.71%.這些數(shù)據(jù)表明可能隨著時間的推移qnr類基因檢出率有增高的趨勢，而田亞凱的研究中qnr檢出率較低可能是由于菌株來源主要是非食品源動物.

QRDRs的突變可導(dǎo)致藥物靶蛋白的結(jié)構(gòu)改變或與藥物的親和力發(fā)生變化，通常導(dǎo)致細菌產(chǎn)生高水平耐藥.在大腸埃希菌中，GyrA亞基的83位絲氨酸是最常見的突變位點，其次是87位天冬氨酸，在絲氨酸和這個酸性氨基酸殘基之間有4個保守的氨基酸，通常認為83和87位是喹諾酮類藥物結(jié)合的關(guān)鍵氨基酸，當(dāng)其突變?yōu)樯彼峄蛄涟彼峥山档椭Z氟沙星和依諾沙星與酶-DNA復(fù)合物的結(jié)合.不同種屬GyrA和ParC基因的這兩個位點突變頻率類似，此處絲氨酸及其相鄰的酸性殘基的不同突變可導(dǎo)致回旋酶和拓撲異構(gòu)酶Ⅳ的催化效率降低5～10倍[2].

本研究中，gyrA基因上有3個位點發(fā)生突變，83位絲氨酸突變?yōu)楫惲涟彼?Ser83→Ile)的檢出率最高，其次有61.7%在87位的天冬氨酸發(fā)生突變，主要突變?yōu)樘於０?，還有2株突變?yōu)槔野彼幔?株突變?yōu)楣劝彼?parC基因80位絲氨酸突變?yōu)楫惲涟彼釞z出率為60.5%，有2株細菌84位谷氨酸突變?yōu)楸彼?，這幾處突變類型與之前的研究類似[13]，與臨床分離的耐喹諾酮藥物的屎腸球菌突變型一致[22].而在宋內(nèi)志賀菌和奈瑟淋球菌等GyrA亞基83位絲氨酸多突變?yōu)榱涟彼醄15，23]，本研究對于parC基因還檢測到1株細菌64丙氨酸突變?yōu)楦彼幔?株91位谷氨酰胺突變?yōu)榻M氨酸，在大腸埃希菌中尚未見報道.

GyrB和ParE亞基的突變頻率比GyrA和ParC亞基低得多，GyrB亞基主要是426位精氨酸和447位賴氨酸突變可導(dǎo)致耐藥性的產(chǎn)生，GyrB中426位的天冬氨酸突變?yōu)樘於０泛?，由于電荷發(fā)生改變影響了藥物和酶的相互作用[24].本研究中發(fā)現(xiàn)也檢測到35.8%的菌株GyrB的第426位突變成為甘氨酸，雖然和前述突變表型不同，但是甘氨酸和天冬酰胺同屬于極性氨基酸，且結(jié)構(gòu)更為簡單.

4 結(jié)論

本試驗對前期從臨床分離到的豬源致病性大腸埃希菌對喹諾酮類藥物的藥物敏感性進行檢測，試驗表明這些菌株對萘啶酸的耐藥率最高，其次是環(huán)丙沙星；對氧氟沙星敏感性最好，且耐藥菌多數(shù)存在多藥耐藥現(xiàn)象；進一步對相關(guān)耐藥基因進行檢測分析發(fā)現(xiàn)，PMQR基因中aac(6′)-Ib-cr基因檢出率最高，為76.5%，其次是qnrS基因檢出率高達45.7%，未檢出qepA基因；QRDR中g(shù)yrA基因83位和87位突變率較高，parC基因80位突變率達60.5%，在parC基因64位和91位還檢測到新的突變類型.本次試驗發(fā)現(xiàn)PMQR檢出率以及QRDR突變頻率均較高，提示應(yīng)當(dāng)加強抗菌藥的監(jiān)管以及合理使用，從而減少耐藥性在不同物種之間的擴散.