光化學衍生-高效液相色譜法測定蠐螬中黃曲霉毒素含量

趙 磊，劉仕聰，劉云菲，李正剛，王路宏，孫艷濤*

(1.四平市食品藥品檢驗所，吉林 四平 136000；2.吉林師范大學 化學學院，吉林 四平 136000)

蠐螬為金龜子科昆蟲朝鮮黑金龜子HolotrichiadiomphaliaBates的干燥幼蟲[1]。蠐螬收載于《中國藥典》2015年版四部成方制劑中“本版藥典未收載的藥材和飲片”項下，《中國藥典》2015年版一部中收載的大黃蟲丸、大黃蟲膠囊、大黃蟲片處方中均用到蠐螬[2-3]。民族藥中朝鮮族的習用藥材，朝藥圖志收載的功能主治為“破血，利水消腫”，常用于太陰人跌打損傷、羸瘦腹?jié)M、癥瘕、經閉、浮腫等病癥[4]。

近年來，中藥中真菌毒素安全性已是中藥行業(yè)十分關注的問題之一[5-7]?！吨袊幍洹?015版藥典收載多個中藥材及飲片的黃曲霉毒素測定項目。黃曲霉毒素被世界衛(wèi)生組織(WHO)的癌癥研究機構劃定為1類致癌物，是一種毒性極強的劇毒物質。黃曲霉毒素破壞人及動物肝臟組織，嚴重時，可導致肝癌甚至死亡。在天然污染的食品中以黃曲霉毒素B1最為多見，其毒性和致癌性也最強[8-10]。

目前，檢測蠐螬中黃曲霉毒素的方法暫無文獻報道。本研究通過采用光化學衍生-高效液相色譜法測定10批蠐螬藥材中黃曲霉毒素的含量[11-13]，檢測出1批次藥材中含有黃曲霉毒素B1與黃曲霉毒素B2成分。測定結果說明，蠐螬藥材的加工處理過程及貯存條件應引起足夠重視。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

安捷倫1260型高效液相色譜儀，配有熒光檢測器(安捷倫科技有限公司)；2001B型系列超純水器(北京普析通用儀器有限責任公司)；電子天平BT125D型萬分之一分析天平(上海精密科學儀器有限公司天平儀器廠制造)；光化學衍生器(254 nm)(普瑞邦科技有限公司)。

1.2 試藥

黃曲霉毒素混合對照品，來源：中國食品藥品檢定研究院，批號；610001-201804，濃度(AFB10.93 μg·mL-1、AFB20.30 μg·mL-1、AFG10.93 μg·mL-1、AFG20.35 μg·mL-1)；蠐螬(收集十批藥材，規(guī)定編號為qc1-qc10經鑒定均為正品蠐螬)。甲醇、乙腈為色譜純；水為超純水；色譜柱為Agilent ZORBAX SB-C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)。

2 方法與結果

2.1 混合對照品溶液的制備

精密移取黃曲霉毒素混合對照品0.5 mL，置10 mL量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，作為貯備溶液。精密量取貯備溶液1 mL，置25 mL量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，即得黃曲霉毒素混合對照品溶液。

2.2 供試品溶液制備

取供試品粉末約15 g(過二號篩)，精密稱定，置于均質瓶中，加入氯化鈉3 g，精密加入70%甲醇溶液75 mL，高速攪拌1 min，離心5 min，精密移取上清液15 mL，置50 mL量瓶中，用水稀釋至刻度，搖勻，用微孔濾膜(0.45 μm)濾過，量取續(xù)濾液20.0 mL，通過免疫親合柱，流速3 mL·min-1，用水20 mL洗脫，洗脫液棄去，使空氣進入柱子，將水擠出柱子，再用適量甲醇洗脫，收集洗脫液，置2 mL量瓶中，并用甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得。光化學衍生器(254 nm)，以熒光檢測器檢測，激發(fā)波長λex=365 nm，發(fā)射波長λex=450 nm。

2.3 測定方法

精密吸取上述供試品溶液20 μL，注入液相色譜儀，測定峰面積，從標準曲線上讀出供試品中相當于黃曲霉毒素B1、黃曲霉毒B2、黃曲霉毒素G1、黃曲霉毒素G2的量，計算，即得。

2.4 色譜條件

以甲醇-乙腈-水(40∶18∶42)為流動相；流速：1.0 mL·min-1；柱溫：30 ℃。

采用柱后衍生法檢測：光化學衍生法：光化學衍生器(254 nm)，以熒光檢測器檢測，激發(fā)波長λex=360 nm，發(fā)射波長λex=450 nm?；旌蠈φ掌?、加標供試品色譜，見圖1。

2.5 方法學考察

2.5.1 線性考察 精密移取黃曲霉毒素混合對照品0.5 mL，置10 mL量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，作為貯備溶液。精密移取該貯備溶液1 mL，置25 mL量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，即得黃曲霉毒素混合對照品溶液。

分別精密吸取上述混合對照品溶液5 μL、10 μL、15 μL、20 μL、25 μL，注入液相色譜儀，測定峰面積，以峰面積為縱坐標，進樣量為橫坐標，繪制標準曲線。見表1。

A.黃曲霉標準品；B.蠐螬加混合黃曲霉標樣：1.黃曲霉毒素G2、2.黃曲霉毒素G1、3.黃曲霉毒素B2、4.黃曲霉毒素B1

圖1 黃曲霉高效液相色譜圖

表1 黃曲霉混合標準品標準曲線

2.5.2 精密度試驗 取黃曲霉毒素B1、黃曲霉毒素B2、黃曲霉毒素G1、黃曲霉毒素G2混合對照品溶液，濃度為37.2、12、37.2、14 ng·mL-1，精密吸取對照品溶液20 μL，注入液相色譜儀，連續(xù)進樣6次，測定，即得。測定結果以峰面積計算RSD均小于2%，結果表明儀器精密度良好。

2.5.3 穩(wěn)定性試驗 取同一供試品溶液，加入混合標準溶液使?jié)舛确謩e為37.2、12、37.2、14 ng·mL-1。按照色譜條件測定，分別于配制后0、3、6、9、12、15 h，精密吸取20 μL，注入液相色譜儀，記錄峰面積，測定結果以峰面積計算RSD均小于2%，結果表明供試品溶液在15 h內穩(wěn)定，證明該方法穩(wěn)定性良好。

2.5.4 回收率試驗 取qc1供試品粉末約15 g(過二號篩)6份，精密稱定，分別置于均質瓶中，精密加入黃曲霉毒素混合對照品50 μL，按“3.2”項依法操作，精密吸取上述供試品溶液20 μL，注入液相色譜儀，測定峰面積，從標準曲線上讀出供試品中相當于黃曲霉毒素B1、黃曲霉毒B2、黃曲霉毒素G1、黃曲霉毒素G2的量，計算回收率。見表2-表5。

表2 黃曲霉毒素B1回收率

表3 黃曲霉毒素B2回收率

序號試樣取樣量(g)樣中黃曲霉毒素G1含量(ng)黃曲霉毒素G1加入量(ng)實測量(ng)回收率(%)平均回收率(%)RSD(%)115.0101046.5047.78102.75215.0103046.5057.92124.56315.0036046.5045.3397.48415.0021046.5045.6098.06103.3110.6515.0048046.5043.8894.37615.0012046.5047.72102.62

表5 黃曲霉毒素G2回收率

2.6 樣品含量測定

按“2.4”項下色譜條件測定10批供試品溶液，進樣量20 μL。結果蠐螬中有1批檢出了含有黃曲霉毒素B1與黃曲霉毒素B2成分，其余9批均未檢出黃曲霉毒素。見表6。

表6 樣品含量測定

3 討論

近年來中藥中真菌毒素安全性已是中藥行業(yè)十分關注的問題之一。中國藥典2015版藥典收載多個中藥材及飲片的黃曲霉毒素測定項目，并規(guī)定了具體限值：每1 000 g含黃曲霉毒素B1不得過5 μg，含黃曲霉毒素G2、黃曲霉毒素G1、黃曲霉毒素B2和黃曲霉毒素B1總量不得超過10 μg。由于蠐螬屬于昆蟲類藥材，采用燙死后干燥處理，在干燥過程中，處理不當極易被有害真菌污染。因此，對蠐螬進行黃曲霉毒素的考察十分必要。在采用樣品檢測方法中，比較碘衍生化方法與光化學衍生方法，發(fā)現光化學衍生方法優(yōu)于碘衍生化方法，光化學衍生化具有操作簡便、靈敏度高的特點。

本實驗研究在蠐螬樣本中檢測出1批次含有黃曲霉毒素B1與黃曲霉毒素B2成分。測定結果表明，在蠐螬藥材加工處理及貯存條件方面應引起重視。