玉米小G蛋白ZmRab7基因克隆及其鹽脅迫響應(yīng)分析

牛艷麗,賈明珠,韓 栓,付佳苗,劉凌云

(河南大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院,植物逆境生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,河南 開封 475004)

土壤鹽脅迫是影響作物產(chǎn)量的重要因素之一。高鹽導(dǎo)致根系吸水困難及Na+和Cl-過度積累,最終抑制植物生長(zhǎng),降低作物產(chǎn)量。為減少鹽脅迫影響,植物已經(jīng)在形態(tài)、生理及生化上進(jìn)化出一系列的應(yīng)對(duì)策略。鹽脅迫發(fā)生時(shí),處于營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)階段的玉米(Zeamays)水分吸收受影響,生長(zhǎng)明顯變緩,老葉中Na+積累,葉片組織壞死[1]；處于生殖生長(zhǎng)階段的玉米籽粒發(fā)育受影響,胚和胚乳發(fā)育被抑制,成熟籽粒數(shù)量明顯下降,最終導(dǎo)致減產(chǎn)[2]。

植物對(duì)鹽脅迫的反應(yīng)是一個(gè)涉及多種功能蛋白和調(diào)節(jié)蛋白共同參與的動(dòng)態(tài)調(diào)控過程[3]。典型的調(diào)節(jié)蛋白主要是轉(zhuǎn)錄因子、蛋白激酶及小G蛋白等分子。其中,小G蛋白R(shí)ab是一類協(xié)調(diào)囊泡轉(zhuǎn)運(yùn)參與多個(gè)生物與非生物脅迫響應(yīng)的“分子開關(guān)”。研究發(fā)現(xiàn),鹽脅迫能夠誘導(dǎo)冰葉日中花(Mesembryanthemumcrystallinum)Mcrab5[4]、谷類植物(Pennisetumglaucum)PgRab7[5]、鹽生植物(Aeluropuslagopoides)AlRab7[6]和鷹嘴豆(Cicerarietinum)CaRabC[7]基因的表達(dá)。其中,煙草和水稻中超表達(dá)PgRab7都表現(xiàn)出更耐鹽和耐旱的特征[5, 8]；超表達(dá)AtRab7的擬南芥耐鹽和耐滲透脅迫能力也得到了增強(qiáng)[9]；超表達(dá)OsRab7的水稻轉(zhuǎn)基因植株也更耐鹽、耐熱和耐旱[10]；此外,Rab2基因也參與了小麥抗葉銹病反應(yīng)[11]。這些研究結(jié)果表明,Rab基因在植物生物與非生物脅迫響應(yīng)中的功能可能是保守而多樣的。

玉米是世界范圍內(nèi)的主要糧食作物,其產(chǎn)量受氣候條件,尤其是干旱、鹽脅迫的制約。迄今為止,玉米中Rab蛋白還沒有鑒定,其功能研究進(jìn)行得更少。擬南芥AtRab6(與酵母ScRab6氨基酸序列同源性為78%)能夠回補(bǔ)酵母溫度敏感型ScRab6缺失突變體[12],說明真核生物中Rab蛋白功能比較保守。本研究通過生物信息學(xué)、基因表達(dá)分析及鹽脅迫下酵母生長(zhǎng)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn),ZmRab7響應(yīng)多種非生物脅迫過程,異源表達(dá)ZmRab7的酵母表現(xiàn)出鹽敏感表型,說明ZmRab7參與了玉米鹽脅迫響應(yīng)過程,為進(jìn)一步揭示玉米R(shí)ab類基因在非生物脅迫信號(hào)途徑中的功能奠定了基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

玉米(B73自交系)種子經(jīng)75%乙醇消毒后播于培養(yǎng)缽(土與蛭石比為1∶1)內(nèi),放培養(yǎng)箱(16 h光/8 h暗,28 ℃)中培養(yǎng)。待幼苗長(zhǎng)至三葉時(shí)取地上部分,液氮速凍后置于-80 ℃超低溫冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 玉米總RNA的提取及cDNA合成 采用TRIzol法提取玉米樣品中的總RNA[13]。提取完成后,使用Prime Script RT reagent Kit(寶生物,大連)試劑盒將提取的RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄得到cDNA。

1.2.2 玉米ZmRab7序列分析 以擬南芥AtRab7(G3f)蛋白序列為query從https://phytozome.jgi.doe.gov/pz/網(wǎng)站Blast得到序列同源性最高的玉米R(shí)ab蛋白(GRMZM2G044368),命名為ZmRab7；從NCBI網(wǎng)站分別下載單子葉及雙子葉代表性植物Rab7蛋白氨基酸序列；使用DNAMAN軟件進(jìn)行氨基酸序列比對(duì)及同源性分析,采用MEGA X軟件(Neighbor-joining method)構(gòu)建進(jìn)化樹。在https://fold.weizmann.ac.il/fldbin/findex及https://www.predictprotein.org網(wǎng)站上進(jìn)行蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)在線分析,三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)則采用同源建模的方法在Swiss-Model上完成。利用PlantCARE進(jìn)行植物脅迫響應(yīng)順式作用元件的分析。

1.2.3 玉米ZmRab7基因表達(dá)分析 從www.maizegdb.org/gene下載RNA-seq數(shù)據(jù)進(jìn)行ZmRab7組織特異性表達(dá)分析,其中根、莖、葉均選擇玉米三葉期幼苗相應(yīng)組織,基因表達(dá)水平根據(jù)FPKM(Fragments per kilobase of exon model per million mapped reads)數(shù)值進(jìn)行計(jì)算。另從https://bar.utoronto.ca/efp_maize/獲取玉米不同脅迫條件下的ZmRab7基因表達(dá)數(shù)據(jù)。

1.2.4 玉米ZmRab7基因的克隆及酵母表達(dá)載體的構(gòu)建 在前期序列比對(duì)分析的基礎(chǔ)上,確定玉米ZmRab7(GRMZM2G044368)基因?yàn)檠芯繉?duì)象。據(jù)此序列設(shè)計(jì)構(gòu)建酵母表達(dá)載體引物：F為5′-ATAGG TACCATGGCCTCGCGCCGCCGCAC-3′；R為5′-GGG CTCGAGTTAACAGCACCCGGATGATC-3′。以上述cDNA為模板擴(kuò)增ZmRab7基因CDS,PCR產(chǎn)物經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證正確后重組入pYES2載體中,再次測(cè)序正確后轉(zhuǎn)入釀酒酵母INVSC1菌株中備用。

1.2.5 酵母生長(zhǎng)試驗(yàn) 將含有ZmRab-pYES2重組質(zhì)粒的酵母菌株液體培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期,誘導(dǎo)表達(dá)6 h后將其濃度調(diào)整至OD600=1.0,將調(diào)整好的菌液分別按照1,1∶10,1∶100,1∶1 000,1∶10 000的比例梯度稀釋。隨后分別取1 μL點(diǎn)到含150 mmol/L或300 mmol/L NaCl的YPD固體培養(yǎng)基(含10%半乳糖和10%棉子糖)上,30 ℃培養(yǎng),2 d后觀察并記錄結(jié)果。設(shè)置空白對(duì)照組,將含有pYES2空質(zhì)粒的酵母菌,按照上述步驟同步進(jìn)行處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 玉米ZmRab7的鑒定及進(jìn)化關(guān)系分析

以擬南芥AtRab7蛋白序列為query在https://phytozome.jgi.doe.gov/pz/網(wǎng)站Blast,找到并下載與之同源性最高的玉米ZmRab7蛋白序列。DNAMAN序列比對(duì)顯示,ZmRab7與雙子葉植物擬南芥、花生、楊樹、番茄及葡萄Rab7氨基酸序列同源性分別為89.37%，86.96%，87.92%，88.41%和88.41%；與單子葉植物水稻、高粱和短柄草Rab7氨基酸序列同源性分別為97.58%，99.52%，97.10%?？梢钥闯?ZmRab7蛋白明顯地和單子葉植物Rab7序列一致性高,其中序列相似性最高的是高粱SbRab7蛋白。已知Rab蛋白具有4個(gè)(G1：GDSGVGKT；G3：WDTAGQ；G4：GNKXD；G5：ETSAK)與GTP酶活性密切相關(guān)的基序和一個(gè)G2(YKATIGADF)效應(yīng)器基序,位于蛋白質(zhì)C末端的2個(gè)半胱氨酸殘基是潛在異戊烯化修飾位點(diǎn),該位點(diǎn)和Rab蛋白與膜的附著及囊泡運(yùn)輸功能相關(guān)。隨后的氨基酸序列分析中也發(fā)現(xiàn),玉米ZmRab7含有Rab蛋白保守的G1、G2、G3、G4和G5序列,并且其C末端也含有2個(gè)保守的Cys殘基(圖1)。這些結(jié)果暗示,通過序列比對(duì)找到的ZmRab7蛋白可能會(huì)具有類似于擬南芥AtRab7通過水解GTP參與囊泡融合及轉(zhuǎn)運(yùn)的能力。

圖1 玉米與其他植物Rab7氨基酸序列比對(duì)Fig.1 Sequence alignment of ZmRab7 with Rab7 proteins of other species

為進(jìn)一步說明Rab7在玉米及不同植物進(jìn)化中的親緣關(guān)系,利用MEGA X對(duì)不同來源Rab7蛋白進(jìn)行了進(jìn)化樹的構(gòu)建。在選取的9種代表性植物中,很顯然,Rab7蛋白在進(jìn)化中按照單、雙子葉物種的不同分為2類,其中楊樹(Populustrichocarpa)、葡萄(Vitisvinifera)、大豆(Glycinemax)、番茄(Solanumlycopersicum)及擬南芥(Arabidopsisthaliana)Rab7蛋白歸為一類,短柄草(Brachypodiumdistachyon)、水稻(Oryzasativa)、玉米(Zeamays)和高粱(Sorghumbicolor)歸為另一類,與玉米ZmRab7親緣關(guān)系最近的是高粱的SbRab7(圖2),暗示在進(jìn)化中它們有共同的祖先,并且進(jìn)化的時(shí)間也非常相近。

圖2 ZmRab7與其他同源蛋白間的進(jìn)化關(guān)系Fig.2 Phylogenetic relationship of ZmRab7 and other homologous proteins

2.2 ZmRab7蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)分析

蛋白質(zhì)無序化區(qū)域是一類連接保守結(jié)構(gòu)的柔性部位,與有序折疊結(jié)構(gòu)相比,前者在蛋白質(zhì)進(jìn)化中其氨基酸殘基更容易被更換。FoldIndex軟件序列分析顯示,ZmRab7有2個(gè)無序化區(qū)域且位于蛋白質(zhì)的C末端(圖3-A),占氨基酸殘基總數(shù)的21.36%(44/206),這說明不同的Rab蛋白之間,其C末端是高度可變區(qū),該區(qū)是Rab蛋白翻譯后異戊烯化修飾的位點(diǎn)。此外,https://www.predictprotein.org網(wǎng)站分析結(jié)果也顯示，ZmRab7二級(jí)結(jié)構(gòu)中α-螺旋占28.64%,β-折疊占20.87%,突環(huán)/無規(guī)卷曲則占整個(gè)結(jié)構(gòu)的一半(50.49%),突環(huán)/無規(guī)卷曲結(jié)構(gòu)往往是蛋白質(zhì)活性部位所在的區(qū)域(圖3-B)。這些結(jié)果進(jìn)一步說明ZmRab7在玉米中應(yīng)該是一個(gè)有Rab活性的功能分子。

2.3 ZmRab7蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

Rab是一類超家族小G蛋白,該類蛋白質(zhì)在結(jié)合GTP的活性狀態(tài)和結(jié)合GDP的失活狀態(tài)之間轉(zhuǎn)換。當(dāng)其結(jié)合GTP時(shí),Rab蛋白與膜系統(tǒng)及效應(yīng)器分子結(jié)合,起著傳遞信號(hào)、調(diào)節(jié)囊泡融合的作用。為進(jìn)一步分析ZmRab7是否具有小G蛋白的功能,通過SWISS-MODEL同源建模對(duì)ZmRab7蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行在線分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn),ZmRab7蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)由4個(gè)α螺旋和多個(gè)β-折疊及無規(guī)卷曲組成；保守的G1、G2、G3、G4和G5區(qū)域位于該蛋白質(zhì)一個(gè)相對(duì)集中的區(qū)域,具有明顯的結(jié)構(gòu)域特征；與已知功能的擬南芥AtRab7的三級(jí)結(jié)構(gòu)非常相似(圖4)。已知Rab蛋白G1、G3-G5區(qū)是其識(shí)別、結(jié)合、水解GTP的區(qū)域,G2區(qū)是結(jié)合效應(yīng)器分子向下游傳遞信號(hào)的區(qū)域。因此,這些結(jié)果暗示ZmRab7在生化上可能具有類似AtRab7的小G蛋白屬性,有可能通過水解GTP傳遞或者響應(yīng)細(xì)胞信號(hào)。

A. ZmRab7蛋白折疊狀態(tài)分析；B. ZmRab7蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)。A. Analysis of the folding state of ZmRab7; B. Prediction of the ZmRab7 secondary structure.

圖4 ZmRab7和AtRab7蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)Fig.4 Predicted tertiary structures of ZmRab7 and AtRab7

2.4 玉米不同組織中ZmRab7基因的表達(dá)譜分析

AtRab5和AtRab7均參與了擬南芥根系發(fā)育的調(diào)控[14-15],基于玉米R(shí)NA-seq的FPKM數(shù)值[16],對(duì)玉米B73自交系的根、莖、葉、雄穗、花絲、花藥和幼胚等組織進(jìn)行基因表達(dá)剖析。結(jié)果發(fā)現(xiàn),ZmRab7基因在玉米的各個(gè)組織中均有表達(dá),在根及幼胚中表達(dá)量較高,在雄穗中表達(dá)量最低(僅是根中表達(dá)量的1/2)(圖5),暗示ZmRab7基因參與了玉米各個(gè)組織發(fā)育的調(diào)控,但更多作用于根及幼胚的發(fā)育過程。

2.5 玉米ZmRab7參與非生物脅迫響應(yīng)的功能分析

植物Rab蛋白作為一個(gè)胞內(nèi)信號(hào)分子參與了多種生長(zhǎng)發(fā)育及脅迫響應(yīng)的調(diào)節(jié)過程。為進(jìn)一步解析ZmRab7可能的生物學(xué)功能,利用PlantCARE分析了玉米ZmRab7基因啟動(dòng)子序列鹽脅迫相關(guān)的順式作用元件。結(jié)果發(fā)現(xiàn),玉米ZmRab7基因上游2 000 bp序列含有4個(gè)GT1GMSCAM4(GAAAAA,分別位于-254,-640,-785,-1 045 bp處)和2個(gè)DRECRTCOREAT(RCCGAC,分別位于-697,-1 386 bp處)元件,這2種保守序列均是與鹽脅迫響應(yīng)相關(guān)的順式作用元件,暗示ZmRab7基因可能參與了玉米鹽脅迫響應(yīng)的調(diào)節(jié)過程。

圖5 玉米ZmRab7基因的組織特異性表達(dá)模式Fig.5 Tissue expression pattern of ZmRab7 in maize

接下來,基于RNA-seq數(shù)據(jù)[17]分析了玉米B73中ZmRab7基因在模擬干旱(PEG8000處理)、低溫(5 ℃)、高溫(50 ℃)及高鹽(NaCl處理)等非生物脅迫處理下的響應(yīng)情況。如圖6所示,不同的干旱脅迫處理能夠誘導(dǎo)ZmRab7基因的表達(dá),但低溫及高溫處理均顯著下調(diào)該基因的表達(dá),高鹽處理只是輕微抑制其表達(dá)(對(duì)照組基因表達(dá)量為161.21,試驗(yàn)組為158.16)。這些試驗(yàn)結(jié)果說明,玉米ZmRab7基因的確參與了干旱、極端溫度及鹽害等非生物脅迫響應(yīng)過程,進(jìn)而使其更好地適應(yīng)各種各樣的不利環(huán)境。

圖6 不同脅迫處理下玉米ZmRab7的基因表達(dá)Fig.6 Expression levels of ZmRab7 gene withdifferent stress treatments in maize

通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)構(gòu)建基因敲除或超表達(dá)植株是鑒定基因功能最好的辦法[18-19],但玉米基因組比較大(B73基因組為2 106 Mb,水稻基因組為430 Mb),且遺傳轉(zhuǎn)化周期比較長(zhǎng),為了能快速證明ZmRab7在生物體內(nèi)是否參與非生物脅迫響應(yīng)過程,將玉米ZmRab7基因的CDS序列克隆到pYES2載體上,并將該重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入INVSC1酵母細(xì)胞中,同時(shí)將pYES2空載體轉(zhuǎn)入同樣的酵母細(xì)胞作為對(duì)照,觀察不同酵母株系在NaCl處理下的生長(zhǎng)情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn),當(dāng)OD600<0.001時(shí),與對(duì)照相比,ZmRab7-pYES2轉(zhuǎn)基因酵母對(duì)NaCl(150,300 mmol/L)脅迫處理非常敏感,可以看到只有很少的酵母細(xì)胞在培養(yǎng)基上生長(zhǎng)。事實(shí)上,當(dāng)OD600=0.1,ZmRab7-pYES2酵母已經(jīng)表現(xiàn)出不耐鹽的表型(圖7)。因此,玉米非生物脅迫表達(dá)分析及酵母生長(zhǎng)試驗(yàn)結(jié)果均顯示,ZmRab7基因介導(dǎo)了鹽脅迫及其他脅迫的響應(yīng)過程。

圖7 不同濃度NaCl脅迫處理對(duì)ZmRab7-pYES2轉(zhuǎn)化酵母生長(zhǎng)的影響Fig.7 Effects of NaCl stress with different concentrations on the growth of ZmRab7-pYES2 yeast transformant strains

3 結(jié)論與討論

真核生物主要通過質(zhì)膜上受體或者感受子識(shí)別并傳遞環(huán)境信號(hào)。截至目前,酵母、哺乳動(dòng)物及擬南芥細(xì)胞中參與質(zhì)膜融合調(diào)節(jié)的Rab蛋白已經(jīng)研究得比較清楚,但玉米中Rab類小G蛋白的功能研究還非常少見。玉米作為一種主要糧食作物,其對(duì)不利條件環(huán)境的耐受能力會(huì)嚴(yán)重影響最終產(chǎn)量。因此,ZmRab7的研究對(duì)于解析玉米通過囊泡運(yùn)輸調(diào)節(jié)介導(dǎo)特定的環(huán)境響應(yīng)顯得尤為重要。

自然界中Rab蛋白因其成員眾多而組成小G蛋白超家族,其序列和功能都比較保守[20-23]。本研究通過擬南芥AtRab7蛋白序列比對(duì)并克隆到玉米ZmRab7基因,序列分析及進(jìn)化樹構(gòu)建都顯示,ZmRab7蛋白不僅與其他植物Rab蛋白同源性非常高(最高達(dá)99.52%),同時(shí)還具有該類蛋白質(zhì)典型的序列特征和特定的保守位點(diǎn)及相似的高級(jí)結(jié)構(gòu)。這些結(jié)果都暗示,ZmRab7蛋白在植物體內(nèi)可能作為一個(gè)小G蛋白類分子開關(guān),通過參與類似于AtRab7介導(dǎo)的囊泡運(yùn)輸和質(zhì)膜融合過程響應(yīng)外界環(huán)境信號(hào)。

植物中不同的Rab基因可能介導(dǎo)不同的發(fā)育與非生物脅迫響應(yīng)過程。ZmRab7在玉米的根及幼胚中表達(dá)量較高,暗示ZmRab7可能參與了玉米根系及胚的發(fā)育調(diào)控及信號(hào)響應(yīng)。玉米rab17[23]、rab28[24]都能夠被ABA誘導(dǎo)表達(dá)。OsRab7超表達(dá)轉(zhuǎn)基因水稻和AtRab7超表達(dá)轉(zhuǎn)基因擬南芥在苗期生長(zhǎng)階段均展現(xiàn)出耐鹽的特征[9-10]。然而,本研究表明,玉米ZmRab7基因含有鹽脅迫響應(yīng)元件,其表達(dá)受高鹽抑制；與此相一致的是,ZmRab7轉(zhuǎn)基因酵母表現(xiàn)出不耐鹽表型。這些結(jié)果說明了鹽脅迫調(diào)控機(jī)制的復(fù)雜性,同時(shí)也說明不同植物Rab7基因?qū)}脅迫處理做出的響應(yīng)可能不同,因此,進(jìn)一步詳細(xì)解析玉米ZmRab7對(duì)鹽脅迫響應(yīng)的詳細(xì)分子機(jī)制，有助于將來利用分子育種手段提高玉米抗非生物脅迫的能力并進(jìn)行品種改良。