溫度脅迫對(duì)幼體大海馬基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)的影響

潘 霞 徐永健 寧 燕 沈錫權(quán)

(寧波大學(xué)海洋學(xué)院,浙江 寧波 315211)

海馬(Hippocampus)是中國水產(chǎn)經(jīng)濟(jì)中重要的高價(jià)值海水魚類,在中藥、海洋水族以及紀(jì)念品市場(chǎng)有很大的貿(mào)易成交量[1-2]。中醫(yī)認(rèn)為,海馬具有補(bǔ)氣活血、補(bǔ)腎壯陽的功效,是治療陽痿、不育等疾病的佳品[3-4]。大海馬(Hippocampus kudaBleeker)廣泛分布在熱帶印度洋-太平洋地區(qū),通常生活在較淺的近海棲息地,包括紅樹林、海草床和河口等[5]。海馬的生長適溫范圍為12～33℃,最適溫度為19～28℃,但其對(duì)溫度急性變化的適應(yīng)能力差,常由于水溫的急劇變化而患病甚至死亡[6]。水溫是影響魚類生長發(fā)育的重要環(huán)境因素之一,水溫驟變影響魚類的攝食、代謝、生長,還可能造成分解代謝加強(qiáng),合成代謝減弱[7]。為了減輕和避免海馬養(yǎng)殖過程中溫度驟變所產(chǎn)生的有害影響,有必要研究高/低溫影響大海馬的分子生理機(jī)制。

分析溫度驟變前后的轉(zhuǎn)錄組學(xué),可以較好地反映大海馬對(duì)溫度的應(yīng)激調(diào)控。轉(zhuǎn)錄組測(cè)序(RNA-Seq)結(jié)合了轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的實(shí)驗(yàn)方法和數(shù)字基因表達(dá)譜的信息分析方法,可用于研究特定生物過程中基因的差異表達(dá),具有通量高、重復(fù)性好、檢測(cè)范圍廣等優(yōu)點(diǎn)[8],已被證明是許多非模型魚對(duì)各種試驗(yàn)條件轉(zhuǎn)錄反應(yīng)的可靠評(píng)估方法[9],其中在硬骨魚研究中主要涉及發(fā)育、適應(yīng)性進(jìn)化、免疫應(yīng)答和應(yīng)激反應(yīng)等[10]。此外,RNASeq 也被用于研究硬骨魚溫度適應(yīng)和馴化所涉及的分子機(jī)制,如鯰魚[11]、虹鱒魚[12]和斑馬魚[13]。當(dāng)前,對(duì)海馬的研究主要集中在溫度、鹽度、疾病等生理生化層面,鮮有研究采用RNA-Seq 技術(shù)分析溫度脅迫下大海馬的轉(zhuǎn)錄表達(dá)變化。本研究以大海馬幼體為研究對(duì)象,采用RNA-Seq 技術(shù)對(duì)溫度驟變前后大海馬肝臟組織進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序,分析不同試驗(yàn)組之間基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)的差異,以期挖掘溫度應(yīng)激調(diào)節(jié)的候選標(biāo)志基因,為闡明其分子機(jī)制提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

大海馬(H.kuda)幼體由寧波大學(xué)海馬養(yǎng)殖研究實(shí)驗(yàn)室培育。挑選健康、活力良好的幼體,體重為0.301 2±0.027 6 g,體長為5.35±0.18 cm,兩者均無顯著性差異。在循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)中暫養(yǎng)1 周,以避免其他環(huán)境因素的干擾。暫養(yǎng)溫度為25±0.5℃,鹽度25‰,充氧DO＞5 mg·L-1,試驗(yàn)用海水為經(jīng)砂濾后的天然海水,每天定時(shí)投喂2 次,攝食2 h 后進(jìn)行吸污。試驗(yàn)水溫設(shè)置：對(duì)照組(CK)25℃,高溫脅迫組(H-test)31℃,低溫脅迫組(L-test)19℃,鹽度均為25‰。溫度脅迫12 h 后,每組隨機(jī)取5 尾大海馬的肝臟置于凍存管,液氮速凍,于-80℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 RNA 提取、文庫構(gòu)建和測(cè)序

參考Liu 等[11]的方法,通過混樣以消除個(gè)體之間的差異。采用RNAiso plus 試劑盒(大連寶生物有限公司)從肝臟樣品中提取總RNA。采用K5500 分光光度計(jì)(北京凱奧科技發(fā)展有限公司)測(cè)量260、280 nm波長處的吸光度值,并用1%瓊脂糖電泳檢查RNA 樣品的純度和完整性。采用Bioanalyzer 2100 系統(tǒng)(Agilent Technologies,美國)評(píng)估RNA 的濃度和完整性。每個(gè)樣品各取2 μg RNA,采用NEBNext? UltraTMRNA 文庫制備試劑盒(New England Biolabs,美國)按照制造商的建議構(gòu)建測(cè)序文庫。在Illumina 平臺(tái)上測(cè)序,測(cè)序策略為PE150[安諾優(yōu)達(dá)基因科技(北京)有限公司]。

1.3 轉(zhuǎn)錄組的組裝、注釋和差異表達(dá)基因分析

使用Perl 腳本處理原始數(shù)據(jù)以確保用于信息分析的數(shù)據(jù)質(zhì)量,包括去除接頭污染的Reads、低質(zhì)量的Reads 以及含N 比例大于5%的Reads。過濾后得到的Clean Data,統(tǒng)計(jì)其質(zhì)量、數(shù)據(jù)量等性狀,包括過濾后的總序列中質(zhì)量值大于30(錯(cuò)誤率小于0.1%)的堿基數(shù)的比例(clean Q30 bases rate,Q30)、數(shù)據(jù)量、堿基含量等。采用Trinity 軟件進(jìn)行組裝,對(duì)得到的全長轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行評(píng)估,然后進(jìn)行開放閱讀框(open reading frame,ORF)預(yù)測(cè)和功能分析。采用RPKM 方法計(jì)算基因表達(dá)量[14],DEGseq v1.18.0 軟件[15]用于差異表達(dá)基因(differentially expressed genes,DEGs)分析。選取Q≤0.05 和｜log2 ratio ｜≥1 的基因?yàn)镈EGs,對(duì)其進(jìn)行GO基因本體(Gene Ontology)富集分析和京都基因與基因組百科全書KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)通路富集分析。

1.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RT－qPCR)分析

選取13 個(gè)DEGs 對(duì)RNA-Seq 結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證,根據(jù)轉(zhuǎn)錄組文庫中的Unigene 序列,用Primer Premier 5 軟件設(shè)計(jì)特異性引物(表1)。以β2-微球蛋白(beta-2microglobulin,B2M)為內(nèi)參基因,采用2-ΔΔCt法[16]計(jì)算目的基因的相對(duì)表達(dá)水平。采用TB Green Premix Ex TaqTMⅡ(Tli RNaseH Plus)(TaKaRa,大連)進(jìn)行定量表達(dá)檢測(cè),在Eppendorf realplex4中進(jìn)行。每組共9 尾魚,3 尾大海馬肝臟為一個(gè)混樣,設(shè)3 個(gè)重復(fù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 大海馬肝臟mRNA 測(cè)序結(jié)果及從頭組裝

高通量測(cè)序顯示(表2),CK、H-test 和L-test 組分別獲得49 556 386、49 404 042、48 043 100 個(gè)原始讀段(raw reads)。過濾后分別獲得47 880 348、47 987 534和46 520 778 個(gè)clean reads。Q30 值均在94%以上,說明該數(shù)據(jù)可靠。由表3可知,高質(zhì)量的測(cè)序數(shù)據(jù)用Trinity 軟件組裝后生成了86 712 個(gè)轉(zhuǎn)錄本,長度在200～2 000 bp 之間,平均長度為1 443.25 bp,N50 長度為2 485 bp。所得轉(zhuǎn)錄本序列進(jìn)一步組裝處理后獲得42 264 個(gè)單基因簇(Unigene),平均長度為1 122.71 bp,N50 為2 223 bp。其中,在200～600 bp 范圍內(nèi)的Unigenes 占53.27%,600～1 000 bp 占12.41%,1 000～2 000 bp 占16.30%,2 000 bp 以上的Unigenes 為18.02%。

2.2 基因功能注釋

將獲得的Unigene 數(shù)據(jù)信息分別在蛋白質(zhì)家族域數(shù)據(jù)庫(Pfam)、蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)庫(Swiss-Prot)、非冗余蛋白數(shù)據(jù)庫(Nr)、真核生物蛋白相鄰類的聚簇(KOG)、基因本體論數(shù)據(jù)庫(GO)和東京基因與基因組百科全書(KEGG)等數(shù)據(jù)庫比對(duì)注釋。由表4可知,Nr 數(shù)據(jù)庫中注釋的Unigenes 所占比例最多,達(dá)53.64%；核酸序列數(shù)據(jù)庫(Nt)注釋的Unigenes 占44.49%；19 506 個(gè)Unigenes 在GO 數(shù)據(jù)庫中得到了注釋,占46.15%；KEGG 數(shù)據(jù)庫注釋的Unigenes 最少,共12 046 個(gè)。GO 分為分子功能(molecular function)、生物過程(biological process)和細(xì)胞組成(cellular component)3 個(gè)部分。利用Trinotate 的注釋結(jié)果,統(tǒng)計(jì)每個(gè)GO 條目中注釋到的基因,并根據(jù)二級(jí)GO 條目得到統(tǒng)計(jì)結(jié)果(圖1)。生物學(xué)過程的主要類別是細(xì)胞過程,占74.74%,其次是生物調(diào)節(jié)和代謝過程,分別占56.7%和49.7%；在分子功能類別中最主要的類別是結(jié)合功能(72.88%)和催化活性(35.33%)；細(xì)胞組成部分中代表性的類別為細(xì)胞部分(87.25%)、細(xì)胞器(57.24%)和細(xì)胞器部分(45.36%)。在KOG 數(shù)據(jù)庫中15 454 個(gè)基因注釋到了25 個(gè)直系同源組(圖2),其中信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制(T,21.26%)與一般功能預(yù)測(cè)(R,21.06%)代表了最大的類群,其次是翻譯后修飾/蛋白質(zhì)周轉(zhuǎn)/分子伴侶(O,8.29%)。

表1 RT-qPCR 所用基因及其引物序列Table 1 Genes used in RT-qPCR and their primer sequences

表2 大海馬測(cè)序數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)匯總Table 2 Statistic summary of the sequencing data of H.kuda

由圖3可知,H-test vs CK 獲得14 009 個(gè)差異表達(dá)基因,其中顯著上調(diào)5 543 個(gè),顯著下調(diào)8 466 個(gè)；Ltest vs CK 獲得20 030 個(gè)差異表達(dá)基因(14 016 個(gè)差異基因顯著上調(diào),6 014 個(gè)差異表達(dá)基因顯著下調(diào))。高溫脅迫組上調(diào)基因數(shù)量低于下調(diào)基因,而低溫脅迫組中上調(diào)基因數(shù)量占比更高。由圖4可知,兩兩比對(duì)后三組均顯著差異表達(dá)的基因有2 851 個(gè),H-test vs CK 與L-test vs CK 之間有7 324 個(gè)差異表達(dá)基因相同,而6 685 個(gè)差異基因僅在H-test vs CK 顯著表達(dá),12 706 個(gè)差異基因僅在L-test vs CK 顯著表達(dá)。

圖1 GO 統(tǒng)計(jì)柱狀圖Fig.1 GO statistics histogram

表3 組裝結(jié)果統(tǒng)計(jì)表Table 3 Assembly result statistics

表4 各個(gè)數(shù)據(jù)庫的注釋匯總表Table 4 Summary of comments in each database

2.3 差異基因的KEGG 富集分析

KEGG 是一個(gè)綜合數(shù)據(jù)庫,大致分為系統(tǒng)信息、基因組信息和化學(xué)信息三大類,有助于了解生物系統(tǒng)的高級(jí)功能和實(shí)用性,如在基因和分子水平了解細(xì)胞、生物和生態(tài)系統(tǒng)的信息,其對(duì)差異表達(dá)基因的Pathway注釋分析有助于進(jìn)一步解讀基因的功能[17]。差異表達(dá)基因在KEGG 數(shù)據(jù)庫中富集,以Q＜0.05 為標(biāo)準(zhǔn),對(duì)KEGG 中每個(gè)Pathway 應(yīng)用超幾何檢驗(yàn)進(jìn)行富集分析,找出差異表達(dá)基因中顯著性富集的Pathway。其中Q 值為多重假設(shè)檢驗(yàn)校正之后的P值,Q 值越小,表示差異表達(dá)基因在該通路中的富集顯著性越高[18]。本研究中,H-test vs CK 的差異表達(dá)基因富集到332 條通路,顯著富集的通路主要是蛋白質(zhì)消化吸收、類固醇生物合成以及細(xì)胞外基質(zhì)ECM-受體相互作用,L-test vs CK 的差異表達(dá)基因富集到332 條通路,顯著富集的通路為同源重組及DNA 復(fù)制。

圖2 KOG 功能分類統(tǒng)計(jì)圖Fig.2 KOG function classification chart

圖3 大海馬肝臟轉(zhuǎn)錄組中差異表達(dá)基因個(gè)數(shù)統(tǒng)計(jì)圖Fig.3 Statistical diagram of differentially expressed genes in liver transcriptome of H.kuda

圖4 大海馬肝臟轉(zhuǎn)錄組中差異基因韋恩圖Fig.4 Venn diagram of differential gene in liver transcriptome of H.kuda

表5、表6 為富集得到的前20 個(gè)KEGG 代謝通路,其中高溫脅迫組中免疫途徑(如ECM-受體相互作用、IgA 腸道免疫網(wǎng)絡(luò)、軍團(tuán)菌病、PI3K-Akt 信號(hào)通路等)、代謝通路(如蛋白質(zhì)消化吸收、類固醇生物合成、脂肪消化吸收、甘油酯代謝等)及細(xì)胞凋亡(依賴于鐵的程序性細(xì)胞死亡)等受到影響。涉及的顯著表達(dá)基因主要有SOD、HSP70、HSP90、PIK3R、CYCS、CASP9、CASP3、P21、Akt、IL-10、TLR、CCR9、MHC2 等。低溫脅迫主要涉及DNA 損傷修復(fù)(如同源重組、DNA 復(fù)制、細(xì)胞周期、核苷酸切除修復(fù)、堿基切除修復(fù)等)及代謝(花生四烯酸代謝、谷胱甘肽代謝、糖酵解等)等過程。篩選發(fā)現(xiàn)SOD、HSP70、HSP90、P21、P53、BAX、HSP70、HSP90、StARD7、ApoA4、CYP51、Fadsd6、MSH、DDB2、XRCC2、RAD52、Ogg1、PMS2 等基因在低溫應(yīng)激中發(fā)揮重要作用。

表5 H-test vs CK 差異基因富集的前20 個(gè)KEGG 代謝通路Table 5 Top 20 KEGG metabolic pathways enriched in H-test vs CK differential genes

2.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 結(jié)果

為驗(yàn)證基于RNA-Seq 方法檢測(cè)的結(jié)果是否準(zhǔn)確,隨機(jī)選取13 個(gè)差異表達(dá)基因(表1)進(jìn)行驗(yàn)證。以B2M作為內(nèi)參基因,采用RT-qPCR 相對(duì)定量方法檢測(cè)這些基因在試驗(yàn)組與處理組中的轉(zhuǎn)錄表達(dá)差異。將RT-qPCR 方法檢測(cè)結(jié)果與轉(zhuǎn)錄組分析結(jié)果進(jìn)行比較,結(jié)果表明,13 個(gè)被測(cè)基因的RT-qPCR 相對(duì)表達(dá)與RNA-seq 相對(duì)表達(dá)水平趨勢(shì)基本一致(圖5、圖6),證明了轉(zhuǎn)錄組分析結(jié)果的可靠性。

表6 L-test vs CK 差異基因富集的前20 個(gè)KEGG 代謝通路Table 6 Top 20 KEGG metabolic pathways enriched in L-test vs CK differential genes

圖5 高溫脅迫組RT-qPCR 及RNA-Seq 的比較分析Fig.5 Comparative analysis of RT-qPCR and RNA-Seq in H-test

圖6 低溫脅迫組RT-qPCR 及RNA-Seq 的比較分析Fig.6 Comparative analysis of RT-qPCR and RNA-Seq in L-test

3 討論

夏季高溫或冬季寒潮[19]以及人工養(yǎng)殖過程中換水等水溫驟變對(duì)水產(chǎn)生物的生長、發(fā)育和攝食等方面均有較大影響[20]。本研究分析了高/低溫脅迫處理的幼體大海馬肝臟轉(zhuǎn)錄組變化,高/低溫脅迫組與對(duì)照組相比分別獲得差異表達(dá)基因14 009 個(gè)和20 030 個(gè),表明溫度脅迫可能激活了多種細(xì)胞代謝,以應(yīng)答溫度應(yīng)激對(duì)大海馬幼體造成的傷害。高/低溫脅迫均造成了抗氧化以及細(xì)胞凋亡方面相關(guān)基因表達(dá)的顯著改變,如超氧化物歧化酶(SOD)、熱休克蛋白(HSP70、HSP90)、細(xì)胞色素C(CYCS)、半胱天冬酶- 9(CASP9)、半胱天冬酶-3(CASP3)、細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑(P21)、腫瘤蛋白P53、Bcl-2 相關(guān)的X蛋白(BAX)等。此外,高溫脅迫組中免疫途徑中磷脂酰肌醇3-激酶調(diào)節(jié)亞基(PIK3R)、P21、RAC-γ 絲氨酸/蘇氨酸-蛋白激酶(Akt)、白細(xì)胞介素10(IL-10)、Toll 樣受體(TLR)等基因表達(dá)發(fā)生顯著變化。而低溫脅迫組中脂肪酸合成和DNA 損傷修復(fù)的相關(guān)基因表達(dá)差異顯著,如StAR 相關(guān)脂質(zhì)轉(zhuǎn)移結(jié)構(gòu)域蛋白7(StARD7)、載脂蛋白A-Ⅳ(ApoA4)、羊毛甾醇14α-脫甲基酶(CYP51)、Δ-6 脂肪?；ワ柡兔?Fadsd6)、DNA 錯(cuò)配修復(fù)蛋白(MSH)、DNA 損傷結(jié)合蛋白DDB2、DNA 修復(fù)蛋白XRCC2、DNA 修復(fù)蛋白R(shí)AD52、8-氧代鳥嘌呤糖基化酶(Ogg1)、錯(cuò)配修復(fù)核酸內(nèi)切酶PMS2 等。此外,本研究發(fā)現(xiàn)(圖3)低溫脅迫組上調(diào)基因數(shù)是高溫脅迫組的2.6 倍,說明低溫脅迫較高溫脅迫組誘導(dǎo)了更多基因表達(dá),在斑馬魚幼體[21]和大黃魚幼體[19]中也發(fā)現(xiàn)了這樣的現(xiàn)象,可能與大海馬幼體階段的耐寒能力有關(guān)。

溫度脅迫會(huì)增加水生生物體內(nèi)的活性氧(reactive oxygen,ROS)含量,其積累到一定程度會(huì)激發(fā)體內(nèi)抗逆性和抗感染的重要生物分子HSP70、HSP90[22]和SOD等基因的表達(dá)量顯著上調(diào)[23]。本研究中,高/低溫脅迫處理均造成了HSP70、HSP90 和SOD等抗氧化相關(guān)基因顯著上調(diào),可能是為了消除體內(nèi)的ROS,而熱休克蛋白(heat shock proteins,HSPs)作為分子伴侶可防止有害蛋白質(zhì)聚集,促進(jìn)蛋白質(zhì)正確折疊并幫助修復(fù)[24]。

細(xì)胞凋亡指為維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定,由基因控制的細(xì)胞自主的有序死亡。高/低溫脅迫均會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞凋亡相關(guān)基因表達(dá)差異顯著,但兩者表達(dá)差異基因不同。本研究發(fā)現(xiàn)高溫脅迫組中顯著上調(diào)的基因主要是P21、CYCS、CASP9 和CASP3。而低溫脅迫組差異表達(dá)的凋亡相關(guān)基因有P53、P21、BAX。細(xì)胞色素C 大量釋放會(huì)激活Caspase-9,進(jìn)而激活Caspase-3 后誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[25]。P53 參與多種修復(fù)DNA 損傷途徑,如染色質(zhì)重塑、堿基切除修復(fù)等[26]。而P21 是位于P53 基因下游的細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制因子,主要作用是減少受損DNA 的復(fù)制和積累,抑制細(xì)胞凋亡[27]。此外,BAX表達(dá)Bcl-2 相關(guān)的X 蛋白,通過抗氧化機(jī)制影響細(xì)胞凋亡[28]。本研究結(jié)果表明,高溫脅迫激活了caspase 依賴的細(xì)胞凋亡途徑,而低溫脅迫則造成與抑制細(xì)胞凋亡的相關(guān)基因上調(diào),并激活大量DNA 損傷修復(fù)基因,以抵抗低溫傷害。

生物體受到溫度、pH 值等刺激或細(xì)胞毒性損傷時(shí),PI3K-Akt 信號(hào)傳導(dǎo)途徑會(huì)調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡、蛋白質(zhì)合成和細(xì)胞周期等重要過程[29]。本研究結(jié)果表明,在高溫脅迫下,PI3K-Akt 信號(hào)途徑相關(guān)基因的表達(dá)受到顯著影響(表5),共有62 個(gè)基因上調(diào),81 個(gè)基因顯著下調(diào)。此途徑中的2 個(gè)關(guān)鍵基因PIK3R1 以及AKT3的表達(dá)均顯著下調(diào)。而低溫脅迫下,PI3K-Akt 信號(hào)傳導(dǎo)途徑總體未受到較大影響。Sun 等[30]在雜色鮑(Haliotis diversicolor)中也發(fā)現(xiàn)在熱應(yīng)激或缺氧及病原體攻擊時(shí),PI3K、AKT基因表達(dá)顯著下調(diào)。此外,此途徑中涉及免疫的差異基因有IL-10、TLR等顯著上調(diào),顯著下調(diào)的差異基因有CC 趨化因子受體9 型(CCR9)、主要組織相容性復(fù)合物(MHC2)等。IL-10可下調(diào)T 輔助細(xì)胞因子(Th1 和Th2)、趨化因子和MHC Ⅱ類抗原的表達(dá),是免疫和炎癥的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子[31]。TLR 信號(hào)通路也在先天免疫防御機(jī)制中起關(guān)鍵作用[32]。以上結(jié)果表明,高溫脅迫相較低溫脅迫更可能導(dǎo)致大海馬體內(nèi)免疫系統(tǒng)紊亂,最終導(dǎo)致患病率上升。

本研究中,低溫脅迫組中與脂肪酸代謝等有關(guān)的基因,如Fadsd6、ApoA4、StARD7 和CYP51 等基因表達(dá)顯著上調(diào),而高溫脅迫組中僅ApoA4 顯著上調(diào)。魚的脂肪酸代謝對(duì)溫度變化很敏感[33],膜脂肪酸去飽和被認(rèn)為是魚適應(yīng)低溫的一種重要機(jī)制,對(duì)維持膜的流動(dòng)性、酶活力和細(xì)胞的正常功能至關(guān)重要[34]。研究發(fā)現(xiàn),低水溫可以增加硬骨魚類Δ6-去飽和酶基因表達(dá),而水溫升高導(dǎo)致幾種淡水魚的Δ6-去飽和酶活性降低[35]。這可能是因?yàn)榈蜏孛{迫導(dǎo)致魚體細(xì)胞中脂肪酸組成發(fā)生改變,增加膜脂的不飽和脂肪酸比率,以維持細(xì)胞膜流動(dòng)性。載脂蛋白可能用于細(xì)胞增殖和組織修復(fù)期間支持細(xì)胞生長材料的運(yùn)輸。而StAR 蛋白是介導(dǎo)膽固醇生物合成中線粒體轉(zhuǎn)運(yùn)的限速蛋白[36],CYP51 是CYP 超家族中進(jìn)化最保守的成員,而且是甾醇生物合成的關(guān)鍵酶[37]。本研究中低溫脅迫導(dǎo)致類固醇及不飽和脂肪酸等相關(guān)基因表達(dá)上調(diào),而在高溫脅迫中相反,可能是因?yàn)橹舅釋?duì)于大海馬幼體抵抗低溫應(yīng)激有重要作用。

環(huán)境刺激會(huì)造成氧化和抗氧化系統(tǒng)之間的平衡被打破,導(dǎo)致DNA 受到損傷。細(xì)胞周期調(diào)節(jié)、蛋白質(zhì)伴侶蛋白、DNA 修復(fù)等過程有降低DNA 損傷的作用[38]。本研究中,低溫脅迫組富集了多條DNA 損傷修復(fù)途徑(表6),如同源重組、DNA 復(fù)制、細(xì)胞周期、嘧啶代謝、核苷酸切除修復(fù)、堿基切除修復(fù)、錯(cuò)配修復(fù)、嘌呤代謝等。篩選得到的上調(diào)基因有MSH、DDB2、XRCC2、RAD52、Ogg1、PMS2 等。上述基因中,高溫脅迫中顯著上調(diào)的僅有PMS2,說明低溫脅迫可能導(dǎo)致魚體內(nèi)產(chǎn)生DNA 損傷,誘導(dǎo)修復(fù)基因顯著表達(dá)以抵抗低溫應(yīng)激。

4 結(jié)論

本研究采用RNA-Seq 技術(shù),在新一代Illumina 測(cè)序平臺(tái),采用PE150 測(cè)序策略,構(gòu)建了幼體大海馬肝臟轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫,獲得了大量幼體大海馬的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)信息,并分別構(gòu)建高溫和低溫應(yīng)激后的基因表達(dá)數(shù)據(jù)庫,對(duì)3 個(gè)數(shù)據(jù)庫進(jìn)行從頭拼接、組裝和分析,挖掘了溫度脅迫相關(guān)的基因。通過轉(zhuǎn)錄組研究手段了解幼體大海馬的溫度應(yīng)激反應(yīng),并初步了解其所涉及的重要過程和途徑,為進(jìn)一步研究溫度應(yīng)激的確切機(jī)制提供了基礎(chǔ),而且有助于預(yù)防極端溫度對(duì)大海馬造成損傷。