谷子SBP蛋白基因家族的鑒定及表達(dá)分析

宋 健 曹曉寧 王海崗 陳 凌 王君杰 喬治軍 劉思辰

(1山西大學(xué)生物工程學(xué)院,山西 太原 030006；2山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院經(jīng)濟(jì)作物研究所,山西 汾陽(yáng) 032200；3山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)作物品種資源研究所,山西 太原 030031)

Squamosa 啟動(dòng)子結(jié)合蛋白(squamosa promoter binding protein,SBP)是植物生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中非常重要的一類轉(zhuǎn)錄因子,主要參與花的形成[1-6]、葉的發(fā)育[1-2,6]、植物育性[2-4]、發(fā)育階段的轉(zhuǎn)變[2,6]、赤霉素(gibberellins,GA)響應(yīng)[2,4]、光周期響應(yīng)[2,4]、果實(shí)成熟[2-3,6]、調(diào)控器官大小和產(chǎn)量[3-5]、應(yīng)對(duì)脅迫應(yīng)答[1,5-6]等多個(gè)方面。SBP 蛋白具有一個(gè)高度保守的DNA 結(jié)合區(qū)域,該區(qū)域由80 個(gè)左右的氨基酸殘基組成。Yamasaki 等[7]通過(guò)核磁共振法,在AtSPL4 和AtSPL7 蛋白中均發(fā)現(xiàn)2 個(gè)鋅指結(jié)構(gòu),這2 個(gè)鋅指結(jié)構(gòu)均由8 個(gè)氨基酸殘基和Zn2＋組成,8 個(gè)氨基酸殘基包括組氨酸和半胱氨酸。2 個(gè)鋅指構(gòu)成分別為(Cys3HisCys2HisCys)和(Cys6HisCys),Zn2＋分別結(jié)合在前后4 個(gè)氨基酸殘基上。

Huijser 等[8]最早在金魚草(Antirrhinum majus)中發(fā)現(xiàn)SBP基因。目前已經(jīng)在水稻、小麥、玉米、大豆、番茄、高粱等作物中分離鑒定出SBP基因。SBP基因家族成員較多,其中,在擬南芥中共有17 個(gè)SPL基因[9-11]；水稻中有20 個(gè)OsSBPs基因,且其SBP基因主要在花和愈傷組織中表達(dá)[10-11]；二倍體小麥具有19個(gè)SPL基因,六倍體小麥中國(guó)春中具有58 個(gè)SPL基因[12]。研究表明,水稻[13]、小麥[14-16]中SBP基因具有調(diào)控光合產(chǎn)物積累,增加產(chǎn)量的作用。近些年,對(duì)玉米[17-19]、大豆[20-22]、番茄[23]、高粱[24-25]、水稻[26-28]、擬南芥[29]等作物中的SBP基因的研究顯示,SBP基因具有激素和逆境響應(yīng)元件,說(shuō)明SBP基因是與抗旱和耐逆相關(guān)的一類重要基因。

谷子(Setaria italica)是很強(qiáng)的抗旱耐瘠薄作物,其富含類胡蘿卜素、維生素B1 和維生素B2,具有非常高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值,是目前雜糧作物中播種面積較大的作物之一,也是干旱丘陵地區(qū)種植的首選農(nóng)作物之一。但由于北方降雨量稀少,尤其在谷子生長(zhǎng)發(fā)育的關(guān)鍵時(shí)期缺水少雨,導(dǎo)致谷子的生長(zhǎng)發(fā)育受阻,嚴(yán)重影響谷子產(chǎn)量。因此,挖掘與谷子抗旱性和耐逆性相關(guān)的基因,通過(guò)分子育種,提高谷子的抗旱耐逆性對(duì)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)具有十分重要的意義。雖然已有各種作物的SBP基因研究成果,但鮮見有關(guān)谷子SBP基因功能的研究報(bào)道。谷子全基因組測(cè)序的完成,為谷子功能基因的挖掘研究提供了有利支撐。本試驗(yàn)以谷子基因組數(shù)據(jù)為基礎(chǔ),采用生物信息學(xué)方法,對(duì)谷子SBP 基因家族進(jìn)行鑒定和分析；同時(shí)結(jié)合RT-qPCR 分析谷子SBP基因在PEG 脅迫及脫落酸(abscisic acid,ABA)誘導(dǎo)后的表達(dá)情況,以期為進(jìn)一步研究谷子SBP基因的功能奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

以谷子品種豫谷1號(hào)為試驗(yàn)材料,由河南省安陽(yáng)農(nóng)科所選育并提供。

1.2 谷子SBP 基因家族的鑒定

在JGI(Setaria italicav2.2)數(shù)據(jù)庫(kù)下載谷子的蛋白序列,用文獻(xiàn)中已公布的擬南芥、水稻和玉米的SBP蛋白序列作為種子文件,在谷子蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)中搜索BLAST 具有SBP 結(jié)構(gòu)域的侯選序列；同時(shí)使用HMMsearch 搜索谷子基因組中具有SBP 保守結(jié)構(gòu)域的蛋白序列。將查找到的所有谷子SBP 蛋白序列,使用 CDD(https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/bwrpsb/bwrpsb.cgi)和Pfam(http：//pfam.xfam.org/search)分析是否具有保守的SBP 蛋白結(jié)構(gòu)域,刪除比對(duì)結(jié)果保守結(jié)構(gòu)域小于50%的SBP 序列,最終確定谷子的SBP 蛋白家族成員。下載對(duì)應(yīng)的核酸序列,對(duì)鑒定結(jié)果進(jìn)行基因注釋。使用ProtParam tool(https：//web.expasy.org/protparam/)分析谷子SBP 蛋白的氨基酸組成、等電點(diǎn)、分子量、親疏水性指數(shù)等。使用SignalP 4.1(http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP-4.1/)和PSORT Prediction(http：//psort1.hgc.jp/form.html)分別進(jìn)行信號(hào)肽和亞細(xì)胞定位的預(yù)測(cè)。

1.3 谷子SBP 蛋白系統(tǒng)進(jìn)化樹及SiSBPs 基因結(jié)構(gòu)分析

將鑒定出的谷子SBP 氨基酸序列通過(guò)MEGA 6中MUSCLE 進(jìn)行序列比對(duì)(參數(shù)默認(rèn))。同時(shí)利用phylogeny 中的NJ 鄰接(neighbor joining,NJ)法構(gòu)建發(fā)育樹,Bootstrap 參數(shù)設(shè)定為1 000[30],Gaps 處理方法為成對(duì)刪除。在JGI 官網(wǎng)下載谷子Setaria italicav2.2中的SBP基因組序列和CDS 序列,使用ClustalX 對(duì)19個(gè)SiSBPs 蛋白序列進(jìn)行比對(duì),將比對(duì)結(jié)果保存為nwk格式。利用GSDS 2.0[31]的Sequence(FASTA)Format繪制SBP基因結(jié)構(gòu)圖。

1.4 不同作物間SBP 蛋白的系統(tǒng)發(fā)育分析

分別下載擬南芥、水稻、高粱、玉米的SBP 蛋白家族,通過(guò)Muscle 對(duì)各物種的SBP 蛋白進(jìn)行完全序列比對(duì),使用MEGA6.0 中的NJ 法(bootstrap 參數(shù)設(shè)定為1 000)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹[30]。

1.5 基因定位

在NCBI 谷子數(shù)據(jù)庫(kù)下載谷子的染色體組數(shù)據(jù),在JGI(Setaria italicav2.2)數(shù)據(jù)庫(kù)確定谷子SBP 家族成員的位置信息及其在染色體上的分布情況。并使用MapGene2Chromosome 繪制SiSBPs基因在谷子9 條染色體上的分布圖。

1.6 啟動(dòng)子分析

使用Plantscare 對(duì)SiSBPs進(jìn)行啟動(dòng)子分析。在phytozome 中下載谷子(Setaria italicav2.2)的全基因組序列和GFF3 文件,然后通過(guò)TBtools 批量提取谷子基因組序列,最后利用TBtools 的Fasta Extractor 將SBP序列全部提取出來(lái),分析SiSBPs編碼區(qū)起始密碼子上游2 000 bp 的啟動(dòng)子情況。

1.7 脅迫處理試驗(yàn)

將飽滿的谷子種子放入含有均衡營(yíng)養(yǎng)液的保濕水培盒并置于通風(fēng)較好的30℃光照培養(yǎng)箱中進(jìn)行育苗(16 h 光照＋8 h 黑暗),幼苗長(zhǎng)至4～5 葉時(shí)分別進(jìn)行10% PEG 6000 和100 μmol·L-1ABA 溶液脅迫處理,分別于脅迫0、2、4、6、12、18 h 時(shí),取谷子幼苗根、莖、葉,立即放入液氮速凍,于-80°冰箱保存,用于提取RNA。

1.8 谷子幼苗根莖葉總RNA 提取及反轉(zhuǎn)錄

分別將不同處理的根、莖、葉組織充分磨碎,使用植物總RNA 提取試劑盒提取RNA,瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA 完整性。將完整的RNA 總量統(tǒng)一定為1 000 ng,使用cDNA 第一鏈試劑盒對(duì)總RNA 進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。所用試劑盒均為天根生化科技北京有限公司產(chǎn)品。

1.9 PEG 6000 脅迫和外源ABA 誘導(dǎo)后SiSBPs 基因的RT-qPCR 分析

根據(jù)熒光定量引物設(shè)計(jì)的原則,使用Premier 5 設(shè)計(jì)熒光定量引物,產(chǎn)物片段設(shè)定為100～300 bp 之間,將設(shè)計(jì)好的引物先通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行特異性篩選,根據(jù)結(jié)果選用具有特異性的RT-qPCR 引物。以25S為內(nèi)參基因。使用Applied Biosystems QuantStudio 6 ＆ 7 Flex Real-Time PCR Software,對(duì)經(jīng)過(guò)10% PEG 6000 和ABA 脅迫后幼苗不同組織部位中SiSBP15、SiSBP19 的表達(dá)量進(jìn)行分析。反應(yīng)體系為20 μL,包括1 μL cDNA、0.6 μL 上游引物、0.6 μL 下游引物、10 μL mix、7.8 μL H2O。程序設(shè)定為：95℃預(yù)變性15 min；95℃變性10 s,60℃退火25 s,共40 個(gè)循環(huán)。運(yùn)行結(jié)束后將結(jié)果以Excel 格式導(dǎo)出。

2 結(jié)果與分析

2.1 SiSBPs 基因家族成員鑒定結(jié)果

通過(guò)NCBI Blast 搜索出19 個(gè)SiSBPs基因,通過(guò)Hmmer search 查找出42 個(gè)可能的SBP 家族成員,利用CDD 去除不含有SBP 蛋白保守域的成員,最終確定有19 個(gè)SiSBPs 蛋白(表1)。該結(jié)果與phytozome中通過(guò)Pfam 蛋白ID(PF03110)關(guān)鍵詞在谷子全基因組數(shù)據(jù)庫(kù)中比對(duì)的結(jié)果基本一致。通過(guò)CDD 分析谷子SBP 蛋白家族的結(jié)構(gòu)域,結(jié)果顯示該蛋白家族的保守結(jié)構(gòu)域都含有74～76 個(gè)氨基酸殘基。除SiSBP12的結(jié)構(gòu)域有74 個(gè)氨基酸殘基構(gòu)成,SiSBP8 的結(jié)構(gòu)域有76 個(gè)氨基酸殘基構(gòu)成外,其余家族成員的保守結(jié)構(gòu)域均由75 個(gè)氨基酸殘基構(gòu)成。SiSBPs 蛋白所包含氨基酸數(shù)目范圍為199～1 118 aa,等電點(diǎn)為5.41～10.41,分子量介于20.49～122.18 kDa 之間,從蛋白親水性指數(shù)來(lái)看,SBP 蛋白家族均為親水性蛋白,其中SiSBP6 蛋白的親水性最強(qiáng)。SignalP 分析結(jié)果顯示,19個(gè)SiSBPs 蛋白均無(wú)信號(hào)肽。PSORT 對(duì)谷子19 個(gè)SBP蛋白進(jìn)行亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè),發(fā)現(xiàn)除SBP7 蛋白在細(xì)胞核中無(wú)信號(hào)外,其余18 個(gè)SBP 蛋白在細(xì)胞核中均有信號(hào),即存在于細(xì)胞核中,其中SBP2、SBP5、SBP11、SBP16、SBP17 蛋白僅存在于細(xì)胞核中,而SBP1、SBP6、SBP7 蛋白也存在于線粒體中,SBP3、SBP4、SBP10、SBP13 蛋白也存在于過(guò)氧化物酶體中,SBP6、SBP7、SBP8、SBP14、SBP15、SBP18 蛋白也存在于在葉綠體中,SBP9、SBP12、SBP15 蛋白也存在于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上,SBP19 蛋白也存在于細(xì)胞質(zhì)膜上。

2.2 谷子SBP 蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化、基因結(jié)構(gòu)及蛋白結(jié)構(gòu)域的分析

為研究SiSBPs 蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系,對(duì)谷子全基因組中的19 個(gè)SiSBPs 蛋白進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建,進(jìn)化樹的分支結(jié)果顯示(圖1),19 個(gè)SiSBPs 蛋白可以分為7 個(gè)分支,除SiSBP9 蛋白單獨(dú)為一個(gè)分支外,其余分支均包含2～4 個(gè)SBP 蛋白。谷子SBP 基因家族結(jié)構(gòu)的繪制結(jié)果顯示(圖2),SiSBP7 和SiSBP16 基因無(wú)upstream 序列,SiSBP17 既沒有upstream 序列,也無(wú)downstream 序列。其余16 個(gè)SiSBPs基因都包含上游序列、CDS 區(qū)、內(nèi)含子、下游序列,其中,SiSBP6 和SiSBP7均僅含有一個(gè)內(nèi)含子,SiSBP1、SiSBP4、SiSBP5、SiSBP8、SiSBP10、SiSBP13、SiSBP14、SiSBP16、SiSBP17、SiSBP18 均含有2個(gè)內(nèi)含子,SiSBP2 和SiSBP11 均含有3 個(gè)內(nèi)含子,SiSBP3 均含有4 個(gè)內(nèi)含子,SiSBP9 和SiSBP15 均含有9 個(gè)內(nèi)含子,SiSBP12 和SiSBP19 均含有10 個(gè)內(nèi)含子。從SiSBPs 蛋白結(jié)構(gòu)域的分析結(jié)果可知,SiSBP19 除了SBP 蛋白結(jié)構(gòu)域(PF03110)外,還有一個(gè)Ank-2(Ankyrin repeats 3 copies)蛋白的結(jié)構(gòu)(PF12796),而其余18 個(gè)SiSBPs蛋白只含有SBP 蛋白結(jié)構(gòu)域(圖3)。

2.3 不同作物SBP 蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化分析

根據(jù)染色體的分布,對(duì)谷子全基因組獲得的19 個(gè)SiSBPs 蛋白進(jìn)行重新命名。同時(shí)在phytozome 中下載擬南芥(17 個(gè))、水稻(19 個(gè))、高粱(19 個(gè))、玉米(36個(gè))的SBP 蛋白,同樣根據(jù)染色體分布對(duì)這幾個(gè)物種的SBP 蛋白重新命名。利用MEGA6 中的NJ 法對(duì)5個(gè)物種的SBP 蛋白構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。由圖4可知,這110 個(gè)SBP 蛋白大致分為9 個(gè)分支,谷子的19 個(gè)SBP蛋白分布在其中7 個(gè)分支,其中,SiSBP5、SiSBP8、SiSBP13、SiSBP16、SiSBP18 聚在第Ⅰ分支,SiSBP1、SiSBP10 聚在第Ⅱ分支,SiSBP4、SiSBP6、SiSBP7、SiSBP14、SiSBP17 聚在第Ⅲ分支,SiSBP2、SiSBP3、SiSBP11 聚在第Ⅳ分支,SiSBP9、SiSBP15 分別聚在第Ⅵ和第Ⅷ分支,SiSBP12、SiSBP19 聚在第Ⅸ分支。而AtSBP6 單獨(dú)為第Ⅴ分支,AtSBP5 和AtSBP11 聚在第Ⅶ分支。總體來(lái)看,谷子的SBP 蛋白家族與高粱和水稻SBP 蛋白家族的親緣關(guān)系較近,與玉米的親緣關(guān)系次之,與擬南芥的親緣關(guān)系最遠(yuǎn)。此外,第Ⅰ分支中SiSBP5、SiSBP8 都是單獨(dú)為一個(gè)亞分支,第Ⅲ分支中SiSBP6 和SiSBP7 聚為一個(gè)小分支,說(shuō)明這2 個(gè)蛋白進(jìn)化關(guān)系更近。

2.4 谷子SBP 基因家族的染色體定位分析

根據(jù)SBP 基因家族鑒定結(jié)果中所在的染色體位置信息,使用Map Gene 2 Chromosome 工具繪制19 個(gè)SiSBPs基因在谷子染色體上的分布圖。由圖5可知,谷子SBP基因家族成員在谷子的9 條染色體上均有分布。其中,在2 號(hào)染色體上分布最多,包含4 個(gè)SBP基因,在1號(hào)和6 號(hào)染色體上各有3 個(gè)SBP基因,在1號(hào)、2 號(hào)和6 號(hào)染色體上的SBP基因占該基因家族的一半以上,在3 號(hào)、4 號(hào)和5 號(hào)染色體上各有2 個(gè)SBP基因,在7 號(hào)、8 號(hào)和9 號(hào)染色體上都只有1 個(gè)SBP基因分布。分析發(fā)現(xiàn),SBP基因在染色體上的分布大都集中在染色體的端部,僅3 號(hào)和8 號(hào)染色體上的SBP8和SBP18 位于染色體中部,3 號(hào)染色體的SBP9 和9 號(hào)染色體的SBP19 位于近端部。

表1 SiSBPs 基因家族信息Table 1 SiSBPs gene family information

2.5 谷子SBP 基因家族的啟動(dòng)子分析

通過(guò)Plantscare 對(duì)19 個(gè)SiSBPs基因編碼區(qū)起始密碼子上游2 000 bp 序列進(jìn)行順式作用元件分析,結(jié)果顯示,谷子SBP 基因家族啟動(dòng)子區(qū)域主要涉及的順式作用元件包括以下幾類：干旱響應(yīng)元件,高溫、低溫及滲透脅迫響應(yīng)元件,光反應(yīng)元件,植物激素類(生長(zhǎng)素、脫落酸、赤霉素、MeJA、水楊酸、乙烯)響應(yīng)元件,病原菌及損傷類響應(yīng)元件等(表2)。19 個(gè)SiSBPs基因啟動(dòng)子區(qū)基本都存在的響應(yīng)元件有TATA-box、CAATbox、MYB、MYC、STRE、as-1、ABRE 和G-Box。

2.6 谷子SBP 基因家族的表達(dá)分析

圖1 谷子SBP 蛋白系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.1 Phylogenetic tree of SBP proteins in foxtail millet

圖2 谷子SBP 基因家族結(jié)構(gòu)圖Fig.2 The structure of SBP genes family in foxtail millet

2.6.1 PEG 6000 脅迫對(duì)SiSBPs基因相對(duì)表達(dá)量的影響 經(jīng)10% PEG 6000 脅迫處理后,SiSBP2、SiSBP3、SiSBP8、SiSBP9、SiSBP11、SiSBP12、SiSBP13、SiSBP15 和SiSBP19 在谷子莖、葉中的表達(dá)量與未脅迫時(shí)相比均呈上調(diào)趨勢(shì)(圖6),且其在葉中表達(dá)量的增幅均大于莖。PEG 6000 脅迫后,SiSBP2、SiSBP3 在葉和莖中的表達(dá)都呈現(xiàn)先上調(diào)后下調(diào)再上調(diào)的趨勢(shì)；葉中SiSBP8 表達(dá)呈先上調(diào)后下調(diào)再上調(diào)的趨勢(shì),而在莖中呈先上調(diào)后下調(diào)的趨勢(shì)；SiSBP9、SiSBP11、SiSBP13、SiSBP15 和SiSBP19 在莖和葉中的表達(dá)都呈先上調(diào)后下調(diào)的趨勢(shì)；SiSBP12 在葉和莖中的表達(dá)為上調(diào)后下調(diào)、再上調(diào)最后下調(diào)。PEG 脅迫后各SiSBPs基因在葉中的表達(dá)量是未脅迫時(shí)的10～180 倍,而在莖中的表達(dá)量是未脅迫時(shí)的4～15 倍。其中,SiSBP3 表達(dá)量的上調(diào)最小,脅迫18 h 后其在葉中表達(dá)量約是未脅迫時(shí)的10 倍,脅迫4 h 后在莖中的表達(dá)量是未脅迫時(shí)的5 倍。與未脅迫相比,表達(dá)量上調(diào)增幅最大的基因?yàn)镾iSBP13,脅迫4 h 后在葉和莖中的表達(dá)量同時(shí)達(dá)到最高峰,葉中的上調(diào)最顯著,是未脅迫的180 倍,莖中的上調(diào)較小,是未脅迫的15 倍以上。綜上,這9 個(gè)SiSBPs基因表達(dá)明顯受10%PEG 6000 脅迫的調(diào)控。

表2 SiSBPs 基因家族啟動(dòng)子區(qū)順式作用原件Table 2 Cis-acting regulatory elements in promoter of SiSBPs gene family

圖3 谷子SBP 蛋白的結(jié)構(gòu)域分析Fig.3 Domain analysis of SBP proteins in foxtail millet

圖4 谷子、擬南芥、水稻、高粱和玉米的SBP 家族蛋白系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.4 SBP family protein phylogenetic tree of millet， Arabidopsis， rice， sorghum and maize

圖5 谷子SBP 基因在染色體上的定位Fig.5 The location of the SBP genes on different chromosomes of millet

圖6 PEG 6000 脅迫下SiSBPs 基因的相對(duì)表達(dá)量Fig.6 Relative expressions of SiSBPs gene under the PEG 6000 treatments

圖7 外源激素ABA 脅迫下SiSBPs 基因的相對(duì)表達(dá)量Fig.7 Relative expressions of SiSBPs gene under stress treatment of exogenous hormone ABA

2.6.2 外源ABA 脅迫對(duì)SiSBPs基因相對(duì)表達(dá)量的影響 外源100 μmol·L-1ABA 脅迫谷子幼苗后,SiSBP2、SiSBP3、SiSBP8、SiSBP9、SiSBP11、SiSBP12、SiSBP13、SiSBP15 和SiSBP19 在谷子莖、葉中的表達(dá)量與未脅迫相比均呈上調(diào)趨勢(shì)(圖7)。外源ABA 脅迫后,SiSBP2 在莖和葉中的表達(dá)量峰值均出現(xiàn)在脅迫4 h 時(shí)；SiSBP3 在葉中出現(xiàn)2 個(gè)表達(dá)高峰,分別是脅迫2、12 h 時(shí),脅迫12 h 時(shí)在莖中的表達(dá)量最高；SiSBP8在莖和葉中出現(xiàn)表達(dá)高峰的時(shí)間,分別是脅迫4、12 h時(shí)；SiSBP9 在葉中的表達(dá)呈先上調(diào)后下調(diào)再上調(diào)的趨勢(shì),而在莖中呈先上調(diào)后下調(diào)的趨勢(shì)；在脅迫4 h 時(shí),SiSBP11 在葉中的表達(dá)量最高,脅迫6 h 時(shí),SiSBP11在莖中的表達(dá)量最高；SiSBP12 在莖和葉中出現(xiàn)表達(dá)高峰的時(shí)間,分別是脅迫2、4 h 時(shí)；SiSBP13 在莖部的表達(dá)量于脅迫4 h 時(shí)最高,在葉中的表達(dá)量持續(xù)上調(diào)；脅迫4 h 時(shí),SiSBP15 在莖部的表達(dá)量最高,脅迫12 h時(shí),SiSBP15 在葉中的表達(dá)量達(dá)到峰值；脅迫4 h 時(shí),SiSBP19 在莖和葉中表達(dá)量均達(dá)到峰值。與未脅迫相比,ABA 脅迫后,在葉中表達(dá)量上調(diào)較高的基因?yàn)镾iSBP11 和SiSBP13,分別是未脅迫的19.6 倍、28.1倍,在莖中表達(dá)量上調(diào)較高的基因?yàn)镾iSBP9、SiSBP11、SiSBP13,分別是未脅迫的6.4 倍、6.7 倍、8.6 倍。9 個(gè)SiSBPs基因的表達(dá)均受外源ABA 的調(diào)控,說(shuō)明SiSBPs基因是谷子生長(zhǎng)過(guò)程中較為重要的一類與逆境脅迫相關(guān)的基因家族。

3 討論

SBP 是植物中重要的轉(zhuǎn)錄因子,通過(guò)結(jié)合下游基因啟動(dòng)子區(qū)的順式作用元件,調(diào)控下游基因的表達(dá)[6]。不同物種之間SBP 基因家族成員數(shù)目差異較大,擬南芥[9,11]有17 個(gè)、玉米[18]有42 個(gè)、高粱[23]有18 個(gè)、水稻[10-11]有20 個(gè),這可能與全基因組的復(fù)制相關(guān)。高粱、水稻與谷子的SBP 基因家族成員相差不大,說(shuō)明這3 個(gè)物種在分離之后全基因組未發(fā)生大規(guī)模復(fù)制。SiSBPs 蛋白所包含氨基酸數(shù)目、等電點(diǎn)以及分子量都存在較大差異,可能是由于各家族成員在生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中的功能不同。

系統(tǒng)發(fā)育樹結(jié)果顯示,谷子SBP 蛋白分布于7 個(gè)分支。在第1 分支中包含高粱的SbSBP3、SbSBP14,與這兩個(gè)蛋白關(guān)系較近的谷子SBP 蛋白有SiSBP5 和SiSBP16。常建忠等[24]研究顯示,高粱的SbSBP3、SbSBP14 基因與高粱的籽粒發(fā)育、干物質(zhì)積累和產(chǎn)量構(gòu)成有關(guān),推測(cè)SiSBP5 和SiSBP16 可能是產(chǎn)量相關(guān)的候選基因。同時(shí),位于第1 分支中的SbSBP13、OsSBP8與SiSBP8 的同源關(guān)系較近,以及位于第3 分支中的SbSBP16 與SiSBP4、SiSBP14 的同源關(guān)系較近。研究表明OsSBP8 是控制植株葉舌發(fā)育的關(guān)鍵基因[29],預(yù)測(cè)SiSBP4、SiSBP8、SiSBP14 可能是谷子中與株型發(fā)育相關(guān)的基因,植株葉片上沖,可增加光照的吸收,提高光合產(chǎn)物的積累,為后續(xù)株型育種提供一定的目標(biāo)基因。在第9、第8 和第6 分支中還有與脅迫應(yīng)答相關(guān)的3 個(gè)SbSBPs基因,分別是SbSBP1、SbSBP15、SbSBP17,與這3 個(gè)同源關(guān)系較近的基因?yàn)镾iSBP9、SiSBP15、SiSBP19,推測(cè)這3 個(gè)基因是谷子SBP 基因家族中與逆境脅迫相關(guān)的重要基因成員,可能會(huì)提高植物對(duì)逆境環(huán)境的耐受性。同時(shí),谷子SBP 基因家族成員的啟動(dòng)子區(qū)有各種響應(yīng)元件,如干旱響、高溫、低溫及滲透脅迫響應(yīng)元件、光反應(yīng)元件、植物激素類(生長(zhǎng)素、脫落酸、赤霉素、MeJA、水楊酸、乙烯)響應(yīng)元件、病原菌及損傷類響應(yīng)元件等,說(shuō)明SiSBPs基因的表達(dá)受諸多因素的調(diào)控,涉及非生物脅迫、生物脅迫和生長(zhǎng)發(fā)育等方面。

本研究重點(diǎn)對(duì)SiSBPs基因與抗旱、耐逆方面的相關(guān)性做了進(jìn)一步分析。結(jié)果表明,經(jīng)過(guò)10% PEG 6000脅迫和外源ABA 誘導(dǎo)之后,9 個(gè)SiSBPs基因在莖和葉中的表達(dá)都上調(diào),且9 個(gè)SiSBPs基因在葉中的上調(diào)表達(dá)與莖中相比較顯著。這些基因的啟動(dòng)子區(qū)都包含脫水響應(yīng)元件(MYC)、脫落酸響應(yīng)元件(ABRE),進(jìn)一步證明了啟動(dòng)子區(qū)分析結(jié)果的可靠性。其中,SiSBP11和SiSBP13 上調(diào)表達(dá)的增幅最大,推測(cè)這2 個(gè)SBP基因可能是參與植物逆境脅迫應(yīng)答的主要基因,為下一步研究抗旱耐逆的相關(guān)基因提供了備選基因。谷子作為禾本科C4作物,其抗旱、光合能力都非常強(qiáng),但本研究只針對(duì)SiSBPs基因響應(yīng)干旱脅迫及ABA 誘導(dǎo)的應(yīng)答做了初步研究,對(duì)SiSBPs基因?qū)夂袭a(chǎn)物積累方面的功能還未深入探究,下一步需要對(duì)SiSBPs 家族成員在光合產(chǎn)物積累過(guò)程中所起的作用進(jìn)行分析,為挖掘谷子抗旱高產(chǎn)相關(guān)的候選基因提供參考。

4 結(jié)論

本研究結(jié)果表明,谷子SBP 基因家族共有19 個(gè)成員,這19 個(gè)基因家族成員啟動(dòng)子區(qū)的響應(yīng)元件主要為光照、激素類等元件,SBP 蛋白在細(xì)胞的大部分細(xì)胞器中均有分布。在10%PEG 6000 脅迫和100 μmol·L-1ABA 誘導(dǎo)后,谷子SBP基因在莖和葉中的表達(dá)量顯著上調(diào),證實(shí)SBP基因?qū)γ{迫應(yīng)答的響應(yīng)調(diào)控具有重要作用,也說(shuō)明SBP基因涉及植物生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中的多方面調(diào)控。同時(shí),在谷子SBP 基因家族中篩選出了與干旱脅迫最相關(guān)的基因SiSBP13,以及與ABA 脅迫相關(guān)的3 個(gè)重要基因,即SiSBP9、SiSBP11、SiSBP13。但尚未對(duì)這些相關(guān)基因做進(jìn)一步驗(yàn)證,未對(duì)這些關(guān)鍵基因所涉及的其他重要功能作分析。本研究結(jié)果為揭示谷子SBP 蛋白功能和發(fā)掘谷子的抗逆基因提供了一定的理論依據(jù)。