水稻短根突變體ksr8的表型分析和基因克隆

林靜霞 朱俊兆 虞 潔 陳星月 李浩然 鄭文娟 朱世華 丁沃娜

(1寧波大學(xué)科學(xué)技術(shù)學(xué)院,浙江 寧波 315212；2寧波大學(xué)海洋學(xué)院,浙江 寧波 315211)

根系是維持植物生命活動的重要器官,它不僅能將土壤中的水分和養(yǎng)分輸送給地上部,還能合成植物激素和必需物質(zhì),促使植株健康生長[1-2]。水稻(Oryza sativaL.)是單子葉模式植物,根系是直接影響水稻地上部形態(tài)、單產(chǎn)、抗逆性等眾多農(nóng)藝性狀的重要器官；水稻根長是所有根系性狀中最重要的性狀。根系生長發(fā)育的調(diào)控機制非常復(fù)雜,涉及多個信號途徑的交互作用,對水稻根系發(fā)育機制的探究是改良遺傳效應(yīng)和提高作物產(chǎn)量的重要手段,對水稻優(yōu)質(zhì)品系的培育具有重要意義[3-4]。近十幾年來,已經(jīng)分離出一批具有短根表型的水稻根系突變體,水稻根系功能基因的研究取得了較大進展。從細胞學(xué)的角度分析,根系變短主要有兩個方面的原因：其一是根尖分生組織功能或結(jié)構(gòu)存在缺陷,其二是根尖細胞伸長受到抑制[4]。

已克隆的水稻根系發(fā)育基因部分與根細胞的分裂有關(guān),如AIM1、GLR3.1 和RRL3[5-7]。AIM1 編碼參與β 氧化作用的3-羥?；?輔酶A 脫氫酶,aim1 突變體的主根和不定根長度明顯變短,根尖分生區(qū)變小,進一步研究表明aim1 突變體根尖分生組織細胞分裂能力降低導(dǎo)致其短根性狀[5]。GLR3.1 是類谷氨酸受體基因,該基因突變導(dǎo)致水稻根系變短,glr3.1 突變體根的分生組織活性喪失,細胞程序性死亡,表明該基因?qū)Ω夥稚M織細胞的分裂和存活具有關(guān)鍵作用[6]。研究發(fā)現(xiàn)RRL3 基因在外界機械刺激下特異調(diào)控根尖分生組織細胞分裂的過程,導(dǎo)致分生區(qū)縮小,最終造成突變體rrl3 的短根表型[7]。

OsSPR1、OsCYT-INV1 和OsKASI等基因與根尖細胞的伸長有關(guān)[8-10]。OsSPR1 是一種參與胚后根伸長的線粒體基因,Osspr1 突變體根成熟區(qū)細胞的伸長嚴重受阻[8]。OsCYT-INV1 編碼一個中性/堿性轉(zhuǎn)化酶,Oscyt-inv1 突變體呈現(xiàn)短根表型,切片顯示該突變體根細胞的長度變小,伸長區(qū)細胞發(fā)生皺縮[9]。OsKASI編碼β-酮脂酰-?；d體蛋白合酶,該酶參與脂肪酸的合成,OskasI突變體根系明顯縮短,其主根伸長區(qū)和成熟區(qū)的細胞長度僅為野生型的四分之一[10]。

此外,還有一些調(diào)控水稻根長的基因與細胞分裂和細胞伸長有關(guān)。OsGLU3 編碼一個β-1,4-葡聚糖內(nèi)切酶,調(diào)控細胞壁的松馳,Osglu3-1 突變體成熟區(qū)細胞的長度僅為野生型的三分之一,分生組織細胞分裂活性降低[11]。OsDGL1 編碼一個多萜長醇二磷酸寡糖蛋白環(huán)糊精糖基轉(zhuǎn)移酶亞基,Osdgl1 突變體根中N糖基化過程受損,成熟區(qū)細胞長度變短,分生組織變小[12]。OsGatB基因編碼一個谷氨酰tRNA 酰胺基轉(zhuǎn)移酶B 亞基,Osgatb突變體的主根生長緩慢,根尖分生組織長度小于野生型,成熟區(qū)細胞長度明顯變短[13]。OsMOGS基因編碼甘露寡糖葡萄糖苷酶,該基因在細胞快速分裂的組織中強烈表達,osmogs突變體表現(xiàn)出根細胞分裂和伸長的嚴重缺陷[14]。

本研究從甲基磺酸乙酯(ethylmethane sulfonate,EMS)誘變的秈稻Kasalath 突變體庫中篩選得到水稻短根突變體ksr8,對該突變體進行表型鑒定、遺傳分析、突變基因的圖位克隆、轉(zhuǎn)基因互補驗證以及短根細胞學(xué)基礎(chǔ)分析,旨在了解該水稻突變體根系發(fā)育的分子機制。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

從EMS誘變的秈稻(Kasalath)突變體庫中篩選出水稻短根突變體ksr8,連續(xù)自交幾代,確保其突變性狀可穩(wěn)定遺傳。將野生型秈稻Kasalath(WT)和粳稻Nipponbare 分別與突變體ksr8 雜交,將得到的F1群體用于表型觀察,通過F1自交獲得的F2群體用于遺傳分析和基因定位。

1.2 表型分析

WT 和突變體ksr8 的幼苗均采用溶液培養(yǎng)法[15]培養(yǎng),7 d 后觀察幼苗表型并拍照,分別測量幼苗的株高、主根長、不定根長和側(cè)根長,統(tǒng)計不定根的數(shù)目,每個樣本統(tǒng)計20 株。

將水培20 d 的水稻幼苗移到大田栽培種植,待其成熟時,隨機選取長勢正常的WT 和突變體ksr8,對整株及稻穗拍照,并統(tǒng)計株高、分蘗數(shù)和每穗實粒數(shù)等農(nóng)藝性狀,每個樣本統(tǒng)計10 株。

1.3 根尖樹脂切片和染色

分別對水培5 d 的WT 和突變體ksr8 根尖的分生區(qū)、伸長區(qū)和成熟區(qū)進行樹脂包埋,并制備半超薄切片,切片染色后拍照[16]；對水稻幼苗根尖部分進行醋酸洋紅染色并觀察拍照。

1.4 突變基因的圖位克隆

1.4.1 分子標記的選擇和設(shè)計[17]根據(jù)Gramene 網(wǎng)站(http：//www.gramene.org/)中已公布的SSR(simple sequence repeat)分子標記,選擇覆蓋水稻12 條染色體且遺傳距離均勻分布的多態(tài)性SSR 引物,用于突變基因的初定位。根據(jù)粳稻Nipponbare 和秈稻Kasalath 間的序列差異設(shè)計初定位區(qū)間內(nèi)具有多態(tài)性的InDel(insertion-deletion)標記進行精細定位。

1.4.2 基因定位 使用簡易TPS 法[18]從水稻的葉片中分別提取Kasalath、Nipponbare、F1和F2分離群體的DNA。將F2分離群體中30 個短根株系的DNA 等量混合以形成突變體基因池,并通過PCR 擴增靶基因,再用非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳(polyacrylamide gel electrophoresis,PAGE)檢測PCR 產(chǎn)物,銀染顯色后觀察帶型,判斷連鎖關(guān)系,對于疑似連鎖的標記采取進一步解包驗證。在初步確定粗定位區(qū)間后,設(shè)計新的分子標記,擴大定位群體,縮小定位區(qū)間。通過水稻基因組數(shù)據(jù)庫的網(wǎng)站(http：//rice.plantbiology.msu.edu/cgibin/gbrowse/rice/)來分析定位區(qū)間內(nèi)的候選基因,測序驗證確定其突變位點,并對候選基因進行突變位點的保守分析。

1.5 轉(zhuǎn)基因互補驗證

根據(jù)KSR8 基因的啟動子序列,設(shè)計上下游分別含SacⅠ和SmaⅠ酶切位點(下劃線表示)的引物：PrKSR8-F(5′-AAAGAGCTCCCAGCCTACGACGCCACGA ACAGA-3′)和PrKSR8-R(5′-AAACCCGGGAAGTATCGT CGCCGAGGGTGTCCG-3′)。根據(jù)KSR8 編碼序列(coding sequence,CDS),設(shè)計上下游分別包含SmaⅠ和SalⅠ酶切位點(下劃線表示)的引物：KSR8-F(5′-A AACCCGGGATGGCCGCCGCCACCTCCCAA-3′)和KSR8-R(5′-AAAGTCGACTTATGAACTAATGCCAAGCTGAGT GC-3′)。以WT 葉片的DNA 和cDNA 為模板分別進行PCR 擴增,將擴增得到的KSR8 啟動子片段及CDS分別與表達載體pCAMBIA1300 連接,構(gòu)建好的回復(fù)載體由農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)入突變體ksr8 愈傷組織中并分化成苗[19]。篩選根系正常的轉(zhuǎn)基因植株進行繁種,獲得純合株系后進行表型分析。

1.6 突變體對外源精氨酸的響應(yīng)分析

在含有0.5 mmol·L-1CaCl2水溶液的培養(yǎng)框中分別加入不同濃度梯度的精氨酸母液,使精氨酸終濃度分別為0、0.05、0.1、0.2、0.5 mmol·L-1。WT 和突變體ksr8 已萌發(fā)的種子在上述培養(yǎng)液中培養(yǎng)7 d 后觀察幼苗全株表型、拍照并統(tǒng)計其主根長度。

2 結(jié)果與分析

2.1 突變體ksr8 的表型鑒定

對培養(yǎng)7 d 的WT 和突變體ksr8 幼苗進行表型觀察,發(fā)現(xiàn)突變體ksr8 的地上部和根系發(fā)育均存在缺陷。突變體ksr8 的株高只有WT 的59.43%(圖1-A、表1),主根和不定根的長度受到極顯著抑制,分別只有WT 的15.53%和15.96%(圖1-B、表1),但不定根數(shù)較WT 有顯著增加(圖1-C、表1)。體式鏡下觀測到突變體ksr8的側(cè)根長度只有WT 的48.61%(圖1-C、表1),ksr8 靠近根尖部位的根毛濃密且長(圖1-C)。

表1 WT 和突變體ksr8 水培7 d 幼苗表型比較Table 1 The characteristics of 7-day-old hydroponic seedlings of wild type and ksr8 mutant

圖1 WT 和突變體ksr8 水培7 d 幼苗表型Fig.1 Phenotypic characterization of 7-day-old hydroponic seedlings of wild type and ksr8 mutant

2.2 突變體ksr8 的農(nóng)藝性狀分析

比較成熟期WT 和突變體ksr8 的農(nóng)藝性狀發(fā)現(xiàn),突變體ksr8 的株高只有WT 的74.77%(圖2-A、C)；分蘗數(shù)極顯著下降,只有WT 的15.87%(圖2-C)；每穗實粒數(shù)也減少,為WT 的77.33%,且芒刺退化(圖2-B、C)。綜上,突變體ksr8 的基因突變不僅限制了根系的發(fā)育,而且對水稻的單產(chǎn)也有影響。

2.3 突變體ksr8 根尖的樹脂切片和染色分析

圖2 WT 和突變體ksr8 成熟期表型Fig.2 Phenotype of wild type and ksr8 mutant at mature stage

經(jīng)樹脂半超薄切片縱切發(fā)現(xiàn),突變體ksr8 主根成熟區(qū)的細胞形態(tài)與WT 相似(圖3-A、D),但分生區(qū)和伸長區(qū)的細胞形態(tài)與WT 相比差異顯著(圖3-B、C),分生區(qū)明顯變短(圖3-C),伸長區(qū)細胞伸長受到嚴重抑制(圖3-B),細胞長度僅為WT 的47.01%(圖3-D)。醋酸洋紅染色可用于觀察分生區(qū)組織長度,結(jié)果顯示,突變體ksr8 的根尖染色區(qū)域長度僅為WT 的48.39%(圖3-E、F)。由此可見,突變體ksr8 的短根表型與伸長區(qū)細胞變短和根尖細胞分裂功能缺陷有關(guān)。此外,突變體ksr8 的根冠長度也明顯變短(圖3-C)。

圖3 WT 與突變體ksr8 的根尖細胞形態(tài)分析Fig.3 Morphological analysis of root tip cells of wild type and ksr8 mutant

2.4 突變體ksr8 的遺傳分析

WT 與突變體ksr8 雜交獲得的F1個體根系正常,均表現(xiàn)出與WT 相同的長根性狀,這表明突變體ksr8的短根性狀由隱性核基因控制。F1自交產(chǎn)生的F2群體經(jīng)溶液培養(yǎng)7 d 后出現(xiàn)了性狀分離,其中447 株F2植株中有326 株為正常表型,有121 株為短根表型,經(jīng)卡方檢驗符合3∶1分離比(χ2＝1.02＜χ20.05＝3.84)(表2)。

表2 突變體ksr8 的遺傳學(xué)分析Table 2 Genetic analysis of short root mutant ksr8

2.5 KSR8 基因的圖位克隆

以Kasalath、Nipponbare 和F1的DNA,以及混合30 株短根突變體的DNA 混合形成的突變池為模板,用在水稻12 條染色體上均勻分布的115 對SSR 引物進行目的基因的初步定位,發(fā)現(xiàn)KSR8 基因可能與3號染色體的分子標記RM3280 連鎖。擴大定位群體,增加了531 株短根單株,在RM3280 物理位置附近設(shè)計了4 對有多態(tài)性的InDel 標記,最終將突變基因定位在分子標記InD3 和RM3280 之間,物理距離約106 kb(圖4-A)。定位區(qū)間候選基因測序分析發(fā)現(xiàn),基因號為LOC_Os03g19280 的候選基因第3 外顯子上發(fā)生了單堿基突變；生物信息學(xué)分析該基因編碼精氨酰琥珀酸裂解酶,CDS 全長1 560 bp,包含7 個外顯子,編碼519 個氨基酸,其CDS 序列653 bp 處的G 突變成A,導(dǎo)致第218 位精氨酸(R)突變成賴氨酸(K)(圖4-B、C)。KSR8 與同源蛋白的序列比對分析表明,ksr8中突變的氨基酸殘基是保守的,表明它可能是該蛋白功能的重要殘基(圖4-D)。

圖4 KSR8 基因的圖位克隆Fig.4 Map-based cloning of KSR8 gene

2.6 KSR8 基因的互補驗證分析

為驗證KSR8 基因突變導(dǎo)致ksr8 產(chǎn)生突變的表型,構(gòu)建自身啟動子驅(qū)動的KSR8 基因的回復(fù)載體,經(jīng)農(nóng)桿菌介導(dǎo)侵染ksr8 突變體愈傷組織并成功獲得回復(fù)株系。篩選出長根性狀的轉(zhuǎn)基因苗進一步繁種純化并選擇出純合植株,最終得到的轉(zhuǎn)基因恢復(fù)水稻苗的表型與WT 相一致(圖4-E)。

2.7 突變體ksr8 對外源精氨酸的響應(yīng)分析

觀察外源精氨酸處理培養(yǎng)7 d 后的幼苗,發(fā)現(xiàn)經(jīng)過不同濃度精氨酸處理后突變體ksr8 和WT 的表型變化明顯不同,隨著精氨酸濃度的升高,WT 的根伸長受到抑制,而突變體ksr8根系在0.1、0.2 和0.5 mmol·L-1濃度下表型逐漸開始恢復(fù),特別是主根的缺陷表型(圖5-A),且隨著精氨酸濃度的升高恢復(fù)越明顯(圖5-B),在0.5 mmol·L-1精氨酸處理下突變體ksr8 和WT 的根長基本一致,表明精氨酸參與調(diào)控突變體ksr8 的根系發(fā)育,且適當?shù)木彼釢舛葘λ靖档恼０l(fā)育具有積極作用。

圖5 添加外源精氨酸對水稻根發(fā)育的影響Fig.5 Effect of the exogenous addition of arginine on root growth

3 討論

水稻根長作為根系最重要的性狀,具有極強的可塑性[20]。目前已克隆的水稻根長相關(guān)基因有20 多個,大多數(shù)在不同的代謝途徑和復(fù)雜的信號通路中起作用[4]。OsGNA1 編碼葡糖胺-6-磷酸乙酰轉(zhuǎn)移酶,參與尿苷二磷酸-N-乙酰葡糖胺的合成,是維持水稻根細胞的正常代謝和形態(tài)所必需的[21]；OsGLU3 編碼一個β-1,4-葡聚糖內(nèi)切酶,能通過調(diào)控細胞壁的松馳來調(diào)節(jié)根的伸長[11]；OsCCC1 編碼K＋/Na＋/Cl-協(xié)同轉(zhuǎn)運蛋白,通過調(diào)控K＋/Na＋/Cl-平衡以維持細胞滲透勢,參與細胞伸長[22]；OsKASI編碼β-酮脂酰-?；d體蛋白合酶,通過參與脂肪酸合成來調(diào)控水稻根系發(fā)育[10]；OsARF12 編碼一個生長素應(yīng)答基因的轉(zhuǎn)錄激活因子,通過影響生長素信號傳導(dǎo)以介導(dǎo)水稻根的伸長[23]。這些基因突變后均造成突變體主根、不定根和側(cè)根變短,本研究篩選到的突變體ksr8 的根系表型與上述突變體類似,通過基因圖位克隆發(fā)現(xiàn)KSR8 基因編碼一個精氨酰琥珀酸裂解酶。

氨基酸作為含氮的小分子有機化合物不僅是構(gòu)建細胞、修復(fù)組織的基礎(chǔ)材料,還是合成核苷酸、激素、生物堿及多胺等多種含氮化合物的前體物質(zhì)[24],在植物的生長發(fā)育、養(yǎng)分吸收及應(yīng)對某些非生物脅迫等方面都具有重要的作用[25-26]。精氨酸作為植物體內(nèi)功能最多的一種氨基酸,其生物合成途徑有8 個步驟,涉及乙酰谷氨酸合成酶、乙酰谷氨酸激酶、乙酰谷氨酸還原酶、乙酰鳥氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶、乙酰谷氨酸鳥氨酸乙酰基轉(zhuǎn)移酶、鳥氨酸氨甲?；D(zhuǎn)移酶、精氨酰琥珀酸合成酶以及精氨酰琥珀酸裂解酶8 種酶的催化反應(yīng)[27]。目前,有關(guān)精氨酸合成途徑基因調(diào)控植物根系發(fā)育的報道較少,擬南芥TUMOR PRONE5(TUP5)基因編碼乙酰鳥氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(acetylornithine aminotransferase,ACOAT),催化精氨酸生物合成的第四步,該基因突變造成根系變短,突變體tup5-1 的短根表型可以通過添加外源精氨酸來恢復(fù)[28]。研究發(fā)現(xiàn)一個編碼精氨酰琥珀酸裂解酶的基因OsASL1 參與調(diào)控水稻根系的正常發(fā)育,突變體osred1 呈短根表型,添加外源精氨酸可以恢復(fù)突變體的短根表型[29-30]。本研究通過圖位克隆技術(shù)克隆到的KSR8 基因也編碼精氨酰琥珀酸裂解酶,該酶催化精氨酸生物合成的最后一步,但測序結(jié)果顯示ksr8 和osred1 的突變位點不同,表明突變基因ksr8 和OsASL1 基因等位。

本研究結(jié)果顯示,OsASL1 基因突變會導(dǎo)致突變體ksr8 和osred1 的根系發(fā)育嚴重受阻,且兩者的短根表型與伸長區(qū)細胞變短和分生區(qū)細胞分裂缺陷有關(guān),轉(zhuǎn)基因互補試驗證實OsASL1 基因突變導(dǎo)致短根表型,外源添加精氨酸均可恢復(fù)兩者的根系缺陷表型。但ksr8和osred1 在突變方式以及表型上存在差異,從突變方式來看,osred1 是粳稻品種Nipponbare 在愈傷組織再生過程中引起的突變品系,OsASL1 基因第2 外顯子內(nèi)(CDS 419 bp 處)的G 突變成了T,導(dǎo)致其蛋白序列第140 位的精氨酸(Arg)突變成了亮氨酸(Leu),從而引起短根表型；而突變體ksr8 則是由秈稻Kasalath 經(jīng)EMS誘變后篩選得到,該突變性狀是由OsASL1 基因的第3 外顯子內(nèi)發(fā)生點突變造成的,其CDS 序列653 bp 處的G 突變成A,導(dǎo)致編碼的第218 個氨基酸精氨酸(Arg)突變成賴氨酸(Lys)。從表型上看,突變體osred1 和ksr8 的地上部存在差異,osred1 幼苗株高與野生型相似,而7 d 苗齡ksr8 的株高僅為野生型的59.43%,表明OsASL1 基因不同背景和位點的突變對地上部生長發(fā)育的影響有所不同。此外,本研究還統(tǒng)計了突變體ksr8 成熟期的農(nóng)藝性狀,發(fā)現(xiàn)其株高、分蘗數(shù)、每穗實粒數(shù)等重要的農(nóng)藝性狀都受到顯著影響,表明OsASL1 不僅參與水稻根系的生長發(fā)育,而且與水稻單產(chǎn)密切相關(guān)。

對水稻根系發(fā)育缺陷突變體的挖掘和研究,使得對水稻根系發(fā)育遺傳調(diào)控機制的認識取得了重大進展。本研究對突變體ksr8 的表型鑒定、遺傳分析、圖位克隆及轉(zhuǎn)基因互補驗證等分析表明精氨酸是水稻根正常伸長所必需的,為進一步探究精氨酸調(diào)控植物根系細胞分裂和細胞伸長的分子機制提供了理論基礎(chǔ)。

4 結(jié)論

本研究在水稻中克隆得到OsASL1 基因,該基因編碼催化精氨酸合成通路最后一個步驟的精氨酰琥珀酸裂解酶。轉(zhuǎn)基因互補試驗證實OsASL1 的點突變引起ksr8 的短根表型,分析發(fā)現(xiàn)ksr8 根的分生區(qū)細胞分裂功能存在缺陷,伸長區(qū)細胞顯著變短,表明OsASL1 的突變可能會抑制水稻根細胞的正常分裂與伸長,最終導(dǎo)致根系變短。此外,結(jié)果顯示添加外源精氨酸可以恢復(fù)ksr8 的根系缺陷表型,這表明適量的精氨酸在水稻根系伸長發(fā)育過程中發(fā)揮重要作用。因此,OsASL1可能通過參與精氨酸生物合成途徑來調(diào)節(jié)水稻根系游離精氨酸的濃度,進而影響根細胞的分裂與伸長,最終決定水稻的根系性狀。本研究為明確OsASL1 在水稻根系發(fā)育過程中的作用機理奠定了基礎(chǔ),并為進一步揭示精氨酸調(diào)控植物根細胞正常分裂與伸長的分子機制提供了寶貴的基因資源和理論依據(jù)。