酶底物法測(cè)定水中總大腸菌群、糞大腸菌群和大腸埃希氏菌質(zhì)量控制研究

陳明桂， 楊 虹

(1.天津天濱瑞成環(huán)境技術(shù)工程有限公司，天津 300100；2.天津市生態(tài)環(huán)境監(jiān)測(cè)中心，天津 300100)

1 引言

總大腸菌群、糞大腸菌群和大腸埃希氏菌是人和溫血?jiǎng)游锬c道中的正常寄生細(xì)菌， 是水體糞便污染的最佳指示菌， 也是水質(zhì)評(píng)價(jià)的重要微生物指標(biāo)之一。總大腸菌群是具有某些特性的一組與糞便污染有關(guān)的細(xì)菌，包括埃希氏菌屬、腸桿菌屬、檸檬酸菌屬、克雷伯菌屬等菌屬。糞大腸菌群又叫耐熱大腸菌群，是總大腸菌群中的一部分，主要包括埃希氏菌屬和耐熱克雷伯菌屬，其能夠更為貼切反映水體受糞便污染程度。大腸埃希氏菌又稱大腸桿菌，是總大腸菌群、糞大腸菌群的主要種類[1]?？偞竽c菌群、糞大腸菌群和大腸埃希氏菌常用的測(cè)定方法主要有多管發(fā)酵法、濾膜法、紙片法和酶底物法。酶底物法由于具有檢出限低、準(zhǔn)確度高、操作方便、時(shí)效性高等優(yōu)點(diǎn)[2]，從而得到了廣泛應(yīng)用。但目前對(duì)酶底物法測(cè)定水中總大腸菌群、糞大腸菌群、大腸埃希氏菌的質(zhì)量控制研究仍較少，本文將從實(shí)驗(yàn)部分、實(shí)驗(yàn)室要求、實(shí)驗(yàn)室人員、工作菌懸液、設(shè)備、標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性比色盤和廢棄物處理等方面對(duì)實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制進(jìn)行研究，為檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性提供保障，能夠更好地服務(wù)環(huán)境保護(hù)工作。

2 實(shí)驗(yàn)部分

2.1 試劑和材料

Minimal Medium ONPG-MUG培養(yǎng)基；硫代硫酸鈉溶液：0.10 g/mL；乙二胺四乙酸二鈉溶液：0.15 g/mL；97孔定量盤；標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性比色盤。

2.2 儀器和設(shè)備

高壓蒸汽滅菌器：121 ℃可調(diào)；恒溫培養(yǎng)箱：允許溫度偏差37 ℃±1 ℃、44.5 ℃±0.5 ℃；程控定量封口機(jī)；紫外燈：波長(zhǎng)365～366 nm。

2.3 標(biāo)準(zhǔn)菌株

(1)金黃色葡萄球菌：26003-5a28-2(F2)，中國(guó)藥品食品檢定研究院。

(2)產(chǎn)氣腸桿菌：CICC10293(F2)，中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏管理中心。

(3)大腸埃希氏菌：44102-3a23-3(F2)，中國(guó)藥品食品檢定研究院。

2.4 樣品測(cè)定方法

根據(jù)《水質(zhì) 總大腸菌群、糞大腸菌群和大腸埃希氏菌的測(cè)定 酶底物法》 (HJ 1001-2018)進(jìn)行樣品采集、保存、接種、培養(yǎng)以及結(jié)果判讀、結(jié)果計(jì)算。總大腸菌群、大腸埃希氏菌于37 ℃±1 ℃下培養(yǎng)24 h，糞大腸菌群于44.5 ℃±0.5 ℃下培養(yǎng)24 h。每次實(shí)驗(yàn)應(yīng)填寫恒溫培養(yǎng)箱溫控記錄。

2.5 實(shí)驗(yàn)室空白

每批樣品都要用無(wú)菌水進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室空白測(cè)定。量取100 mL無(wú)菌水于滅菌后的三角瓶，加入2.7 g±0.5 g培養(yǎng)基粉末，充分混勻，完全溶解后全部倒入97孔定量盤內(nèi)，趕除氣泡，程控定量封口機(jī)封口。總大腸菌群、大腸埃希氏菌于37 ℃±1 ℃下培養(yǎng)24 h，糞大腸菌群于44.5 ℃±0.5 ℃下培養(yǎng)24 h。

2.6 陰性和陽(yáng)性對(duì)照

將標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)存菌株制成300～3000個(gè)/mL的工作菌懸液，取100 mL菌懸液于滅菌后的三角瓶中，加入2.7 g±0.5 g培養(yǎng)基粉末，充分混勻至完全溶解后，全部倒入97孔定量盤內(nèi)，以手撫平97孔定量盤背面，趕除孔內(nèi)氣泡，然后用程控定量封口機(jī)封口。將封口后的97孔定量盤放入特定溫度的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。

2.7 精密度測(cè)定

對(duì)低、中和高3種濃度的實(shí)際水樣進(jìn)行測(cè)定，每個(gè)樣品平行測(cè)定6次，以驗(yàn)證方法精密度。

2.8 準(zhǔn)確度測(cè)定

對(duì)有證標(biāo)準(zhǔn)樣品進(jìn)行測(cè)定，以驗(yàn)證方法準(zhǔn)確度。

3 質(zhì)量控制

3.1 實(shí)驗(yàn)室要求

實(shí)驗(yàn)室空間安排要合理，需要配備：①準(zhǔn)備室：進(jìn)行培養(yǎng)基制備，需明確標(biāo)示出無(wú)菌區(qū)和非無(wú)菌區(qū)；②無(wú)菌室：放置超凈工作臺(tái)，以用于接種水樣；③培養(yǎng)室：主要放置用于培養(yǎng)微生物的恒溫培養(yǎng)箱；④鑒定室：放置生物安全柜，用于轉(zhuǎn)移培養(yǎng)微生物；⑤高溫室：主要用于對(duì)廢棄物和其他器具進(jìn)行高溫消毒。無(wú)菌室在使用前后都要進(jìn)行清潔消毒處理，并每月對(duì)無(wú)菌室進(jìn)行沉降菌測(cè)試[4]。實(shí)驗(yàn)室要求通風(fēng)良好、避免灰塵、溫度恒定，室內(nèi)墻壁和地板要使用防透水材料，工作臺(tái)應(yīng)使用光滑、防水、抗腐蝕、接縫少的材料，保持室內(nèi)空氣的清潔和實(shí)驗(yàn)室用具的整潔。

3.2 實(shí)驗(yàn)室人員

實(shí)驗(yàn)員應(yīng)具有一定的專業(yè)理論知識(shí)和技能，并獲得專業(yè)考試證書(shū)；應(yīng)積極參加培訓(xùn)和理論知識(shí)學(xué)習(xí)，不斷提高業(yè)務(wù)技術(shù)水平并及時(shí)掌握微生物檢測(cè)新技術(shù)；定期進(jìn)行方法比對(duì)及人員比對(duì)；應(yīng)具有嚴(yán)謹(jǐn)認(rèn)真的工作態(tài)度。

3.3 工作菌懸液制備

標(biāo)準(zhǔn)菌株需要從標(biāo)準(zhǔn)菌種保藏中心或其他有效認(rèn)證的商業(yè)機(jī)構(gòu)獲得，嚴(yán)格按照使用說(shuō)明書(shū)進(jìn)行復(fù)蘇，并按照《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗(yàn)培養(yǎng)基和試劑的質(zhì)量要求》(GB4789.28-2013)制備成標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)存菌株，于-20 ℃低溫冷藏箱中保存[5]。

自-20 ℃低溫冷藏箱取出標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)存菌株一支，將菌液全部倒入盛有50 mL適合的液體培養(yǎng)基中，于36.5 ℃、30 r/min水浴恒溫振蕩器中培養(yǎng)18 h。然后驗(yàn)證菌株的純度和形態(tài)，挑取2～3個(gè)典型菌落于36.5 ℃、30 r/min水浴恒溫振蕩器中培養(yǎng)18 h。將培養(yǎng)后的菌懸液進(jìn)行稀釋，以血球計(jì)數(shù)板初步計(jì)數(shù)每小格2～3個(gè)活動(dòng)菌為宜，計(jì)算出菌液濃度，再根據(jù)菌液濃度稀釋至300～3000個(gè)/mL。

3.4 設(shè)備

培養(yǎng)總大腸菌群、大腸埃希氏菌所用恒溫培養(yǎng)箱應(yīng)達(dá)到37 ℃±1 ℃，培養(yǎng)糞大腸菌群所用的培養(yǎng)箱應(yīng)達(dá)到44.5 ℃±0.5 ℃，每天都要檢查培養(yǎng)箱溫度是否穩(wěn)定無(wú)誤，填寫控溫使用記錄。高壓蒸汽滅菌器每次使用時(shí)應(yīng)用121 ℃壓力蒸汽滅菌化學(xué)指示卡檢查是否符合滅菌條件，每季度進(jìn)行一次嗜熱脂肪肝菌芽孢菌片滅菌效果評(píng)價(jià)。計(jì)量部門對(duì)上述設(shè)備每年校準(zhǔn)一次，檢查溫度是否達(dá)到要求。實(shí)驗(yàn)人員根據(jù)校準(zhǔn)證書(shū)中的溫度偏差進(jìn)行修正，并在設(shè)備正面標(biāo)明修正因子。紫外線燈需定期檢測(cè)，包括對(duì)紫外線波長(zhǎng)、強(qiáng)度及評(píng)價(jià)其消毒效果的物理學(xué)指標(biāo)和生物學(xué)指標(biāo)的檢測(cè)[6]。

3.5 標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性比色盤

標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性比色盤應(yīng)置于干燥陰涼處避光存放，孔內(nèi)的液體不少于其體積的2/3，否則需要重新更換。隨時(shí)觀察比色盤以防比色盤內(nèi)液體顏色發(fā)生變化，影響數(shù)據(jù)準(zhǔn)確性。無(wú)特殊情況需按其有效期提前更換。

3.6 廢棄物處理

實(shí)驗(yàn)過(guò)程產(chǎn)生的具有潛在危險(xiǎn)的廢棄物，需要進(jìn)行高壓蒸汽滅菌，在確保微生物滅活后，液體廢棄物倒入下水道，菌株培養(yǎng)的廢棄物應(yīng)放入標(biāo)有生物危害的黃色塑料袋中，交由有資質(zhì)的單位處理。對(duì)于實(shí)驗(yàn)室產(chǎn)生的其他一般廢棄物，將其放入一般垃圾袋中即可[7]。

4 結(jié)果討論

4.1 空白對(duì)照

培養(yǎng)后97孔定量盤均無(wú)任何顏色變化，證明實(shí)驗(yàn)室空白合格。

4.2 陰性和陽(yáng)性對(duì)照

將各標(biāo)準(zhǔn)菌株制成300～3000個(gè)/mL的菌懸液，將菌懸液按方法要求接種培養(yǎng)，結(jié)果顯示陽(yáng)性菌株呈現(xiàn)定量盤顏色變?yōu)辄S色為陽(yáng)性反應(yīng)，陰性菌株呈現(xiàn)定量盤顏色不發(fā)生變化為陰性反應(yīng)，證明陰陽(yáng)性對(duì)照試驗(yàn)合格。

4.3 精密度

將低、中和高3種不同濃度樣品分別對(duì)總大腸菌群、大腸埃希氏菌和糞大腸菌群進(jìn)行平行測(cè)定6次，結(jié)果見(jiàn)表1～3。結(jié)果顯示，低、中和高濃度樣品中總大腸菌群測(cè)定的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為1.2%、1.0%和1.9%，糞大腸菌群測(cè)定的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為1.7%、2.7%和5.9%，大腸埃希氏菌測(cè)定的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為1.7%、1.4%和7.2%，均滿足要求。

4.4 準(zhǔn)確度

總大腸菌群標(biāo)準(zhǔn)樣品QC-FD-035標(biāo)準(zhǔn)值為5200(2 300～12 000)MPN/100 mL，測(cè)定值為4279 MPN/100 mL；糞大腸菌群標(biāo)準(zhǔn)樣品QC-FD-006標(biāo)準(zhǔn)值為13 000 MPN/mL，測(cè)定值為12439 MPN/mL；大腸埃希氏標(biāo)準(zhǔn)樣品QC-FD-033標(biāo)準(zhǔn)值為3100(1000～9500) MPN/100mL，測(cè)定值為2001 MPN/100 mL，均滿足要求。

表1 總大腸菌群精密度的測(cè)定結(jié)果

表2 糞大腸菌群精密度的測(cè)定結(jié)果

表3 大腸埃希氏菌精密度的測(cè)定結(jié)果

綜上所述，采用酶底物法檢測(cè)水中的總大腸菌群、糞大腸菌群、大腸埃希氏菌，對(duì)樣品進(jìn)行全程序空白對(duì)照，陰陽(yáng)性對(duì)照試驗(yàn)，以及對(duì)精密度和準(zhǔn)確度進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果都在質(zhì)量控制范圍內(nèi)。按照以上質(zhì)量控制要求，加強(qiáng)管理，可獲得精確數(shù)據(jù)，滿足方法要求。酶底物法具有簡(jiǎn)便、精準(zhǔn)、快速、方法檢出限低等優(yōu)點(diǎn)，使酶底物法測(cè)定總大腸菌群、糞大腸菌群和大腸埃希氏菌的應(yīng)用越來(lái)越廣泛， 所以，做好酶底物法測(cè)定水中總大腸的質(zhì)量控制研究具有非常重要的意義。