美味牛肝菌液體菌種搖床發(fā)酵條件的研究

宋佩東

(遼寧省高速公路營運(yùn)管理有限公司本溪分公司，遼寧本溪117000)

我國楊樹資源豐富，如何合理開發(fā)利用林下經(jīng)濟(jì)資源是現(xiàn)在林業(yè)發(fā)展新的研究方向。食用菌作為人類食用的第二大蔬菜，更適合這種弱光，高濕及土質(zhì)豐富的林下環(huán)境，同時它也是食品工業(yè)和醫(yī)療保健工業(yè)重要的原料?，F(xiàn)在很多菌種人工栽培規(guī)模很大，篩選適合楊樹林地半野生栽培的菌種，要著重從它的藥用價值入手。美味牛肝菌(Boletusedulis)屬于擔(dān)子菌亞門(Basidiom ycotina)、層菌綱(Hymenomycetes)、傘菌目(Agaricases)、牛肝菌科(Boletaceae)[1]。它是一種食藥兼用經(jīng)濟(jì)價值較高的真菌，全國各地均有分布[2]。它含有豐富的蛋白質(zhì)和脂肪，含有人體必需的多種氨基酸、維生素及微量元素，有防病治病、強(qiáng)身健體的功能，因此國內(nèi)外市場的需求量不斷增加[3]。發(fā)酵菌絲體培養(yǎng)周期短、生長快，易于大規(guī)模工業(yè)生產(chǎn)，從其發(fā)酵液或固體培養(yǎng)物得到的菌絲體作為保健食品或提取多糖具有很好的應(yīng)用前景[4-5]。本文主要對牛肝菌的液體發(fā)酵培養(yǎng)條件進(jìn)行了優(yōu)化研究，期待為美味牛肝菌楊樹林下栽培提供一定的前期理論基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 菌株

美味牛肝菌，購自中國科學(xué)院微生物研究所菌種保藏中心。

1.2 基本發(fā)酵培養(yǎng)基

葡萄糖5 g，麥芽糖22 g，酵母膏14 g，硫酸銨2.7 g，磷酸二氫鉀0.5 g，硫酸亞鐵67 mg，硫酸銅100 μg，加蒸餾水1000 mL。

1.3 儀器設(shè)備

LGJ-10型冷凍干燥儀；A2級生物安全柜；AL104型電子天平；HH·S21-6-S恒溫水浴鍋；KDM型調(diào)溫電熱套；MLS-3020型全自動高壓蒸汽滅菌器；DHG-9240(A)鼓風(fēng)干燥箱；HZQ-C型恒溫振蕩器。

2 方法

2.1 液體發(fā)酵培養(yǎng)[6-8]

選出菌株生長均勻的一個平面培養(yǎng)的平皿，用無菌打孔器(直徑10 mm)打孔，無菌鑷子夾取一片菌絲碟接種于盛有100 mL發(fā)酵培養(yǎng)基的三角瓶中，28 ℃，160 r/min搖床發(fā)酵培養(yǎng)。分別測定每天菌絲干重，方法是用漏斗過濾發(fā)酵液，保留的菌絲于40 ℃的烘箱中烘干稱重，即為菌絲的干重。以發(fā)酵時間為橫坐標(biāo)，菌絲干重為縱坐標(biāo)作生長曲線。

2.2 美味牛肝菌液體發(fā)酵條件的優(yōu)化

2.2.1 單因素分析[9-11]。一般影響菌絲液體發(fā)酵培養(yǎng)的條件因素有培養(yǎng)溫度、搖床轉(zhuǎn)數(shù)、裝液量和初始pH等。本試驗(yàn)選擇了影響顯著的4個因素，每個因素多個梯度值進(jìn)行單因素分析。

培養(yǎng)溫度：選擇24、26、28、30、32 ℃五個梯度對菌絲體進(jìn)行培養(yǎng)。

搖床轉(zhuǎn)數(shù)：選擇110、130、150、170、190 r/min五個梯度對菌絲體進(jìn)行培養(yǎng)。

初始pH：選擇3.7、3.9、4.1、4.3、4.5、4.7七個梯度的起始pH。

裝液量：選擇50、100、150、200、250 mL五個梯度的裝液量。

每個實(shí)驗(yàn)3次重復(fù)，進(jìn)行液體發(fā)酵培養(yǎng)至菌絲生長量最多的時期，測其發(fā)酵液中美味牛肝菌菌絲干重。

2.2.2 正交試驗(yàn)分析[12-14]。確定發(fā)酵條件中每個因素對美味牛肝菌菌絲干重影響較大的3個水平，進(jìn)行L9(34)正交試驗(yàn)。各試驗(yàn)因素和水平見表1。

表1 發(fā)酵正交試驗(yàn)因素和水平表

3 結(jié)果與分析

3.1 美味牛肝菌生長曲線[15]

圖1 美味牛肝菌生長曲線

從圖1中可以看出，該菌種2 d開始進(jìn)入對數(shù)生長期，5 d達(dá)到最高峰，之后進(jìn)入穩(wěn)定期，持續(xù)1 d后進(jìn)入衰老期，因此5 d是美味牛肝菌菌株最佳的培養(yǎng)時間。

3.2 美味牛肝菌發(fā)酵條件優(yōu)化[16-17]

3.2.1 培養(yǎng)溫度對美味牛肝菌生長的影響

圖2 培養(yǎng)溫度對美味牛肝菌生長的影響

如圖2， 28 ℃菌絲質(zhì)量最高達(dá)到1.962 g。顯然較低的溫度不利于菌絲的生長，但溫度過高，自身物質(zhì)消耗過快，生物量降低。因此選擇28 ℃作為最適的培養(yǎng)溫度。

3.2.2 不同轉(zhuǎn)數(shù)對美味牛肝菌生長的影響

圖3 搖床轉(zhuǎn)數(shù)對美味牛肝菌生長的影響

如圖3，搖床轉(zhuǎn)數(shù)過高或過低均不利于菌絲生長，當(dāng)轉(zhuǎn)數(shù)為150 r/min，菌絲質(zhì)量最高達(dá)到2.173 g，其余轉(zhuǎn)數(shù)下的菌絲質(zhì)量均較低。因此確定最佳轉(zhuǎn)速為150r/min。

3.2.3 初始pH對美味牛肝菌生長的影響

圖4 初始pH對美味牛肝菌生長的影響

如圖4，美味牛肝菌的液體培養(yǎng)對pH的適應(yīng)范圍較廣，起始pH在3.7～4.3范圍內(nèi)菌絲生長隨著pH的增大而增快，pH4.3時菌絲干重最高1.942 g，但pH高于4.3時菌絲生長隨之下降。因此選擇最適pH為4.3。

3.2.4 裝液量對美味牛肝菌生長的影響

圖5 裝液量對美味牛肝菌生長的影響

如圖5，開始菌絲生長隨著裝液量的增加而增多，當(dāng)裝液量為150 mL菌絲含量達(dá)到最高，為2.202 g，隨后逐漸降低。因此以150 mL的裝液量最為適宜。

3.2.5發(fā)酵條件的正交試驗(yàn)分析

表2 發(fā)酵正交試驗(yàn)結(jié)果的極差分析

如表2，各因素對美味牛肝菌生長影響程度依次為B>A>C>D，ABCD四因素理論最佳組合為A2B3C1D1，即培養(yǎng)溫度28 ℃、搖床轉(zhuǎn)數(shù)170 r/min、初始pH4.1、裝液量100 mL。其中搖床轉(zhuǎn)數(shù)對美味牛肝菌生長影響顯著。

4 結(jié)論與討論

通過單因素和正交試驗(yàn)結(jié)果分析，美味牛肝菌最適發(fā)酵條件為：培養(yǎng)溫度28 ℃、搖床轉(zhuǎn)數(shù)170 r/min、pH4.1、裝液量100 mL。通過驗(yàn)證試驗(yàn)在此條件下的菌絲干重為2.215 g。

發(fā)酵條件中各因素都會影響菌絲的生長，溫度是影響微生物生長的重要因素，適宜的生長溫度能最大限度的發(fā)揮細(xì)胞內(nèi)代謝途徑中酶的活力，使細(xì)胞生長旺盛；攪拌作用直接影響發(fā)酵基質(zhì)的傳遞和溶氧水平，最終與發(fā)酵產(chǎn)物的產(chǎn)率和質(zhì)量息息相關(guān)；pH對細(xì)胞發(fā)育產(chǎn)生直接的影響，還對細(xì)胞產(chǎn)生不同程度的間接影響，它影響培養(yǎng)基中營養(yǎng)物質(zhì)的離子化程度，從而影響微生物對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收，影響環(huán)境中有害物質(zhì)對微生物的毒性；在好氧菌的深層培養(yǎng)中，氧氣的供應(yīng)是發(fā)酵能否成功的重要限制因素之一。裝液量過大時，培養(yǎng)基中溶解氧較少，不利于菌絲生長，裝液量小時，搖瓶中很難形成旋渦，不利于菌球的形成。

本研究獲得了美味牛肝菌液體發(fā)酵最佳發(fā)酵條件，為美味牛肝菌楊樹林下栽培提供前期的試驗(yàn)基礎(chǔ)。美味牛肝菌是林下經(jīng)濟(jì)作物食用菌優(yōu)良品種的選擇之一。期待為美味牛肝菌的經(jīng)濟(jì)價值及其藥用價值的開發(fā)提供一定的理論基礎(chǔ)。