狐源金黃色葡萄球菌的分離鑒定

劉勃興 趙安奇 康圓圓 滕文萍 吳同壘 史秋梅 張志強(qiáng)

狐源金黃色葡萄球菌的分離鑒定

劉勃興 趙安奇 康圓圓 滕文萍 吳同壘 史秋梅 張志強(qiáng)

（河北科技師范學(xué)院 河北省預(yù)防獸醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 河北 秦皇島 066004）

為確定引起秦皇島某狐養(yǎng)殖場(chǎng)的銀狐死亡病因，從病死銀狐肝臟、肺臟等分離到一株細(xì)菌，采用革蘭氏染色、細(xì)菌的生化鑒定、16S rDNA鑒定、致病性試驗(yàn)以及藥物敏感性試驗(yàn)對(duì)分離菌進(jìn)行研究。試驗(yàn)結(jié)果顯示，分離菌為金黃色葡萄球菌；該菌可致小鼠死亡，死亡率100%；分離菌對(duì)頭孢曲松、環(huán)丙沙星、恩諾沙星共3種抗生素表現(xiàn)敏感，對(duì)阿莫西林、新霉素等共8種抗生素表現(xiàn)耐藥。本研究分離狐源金黃色葡萄球菌具有較強(qiáng)的致病性和耐藥性，為金黃色葡萄球菌感染狐所致疾病的診治提供參考。

狐 金黃色葡萄球菌 分離鑒定 耐藥性

金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus，SA)屬于革蘭氏陽(yáng)性菌中的葡萄球菌屬(Staphy-lococcus)中的一員，在自然界中廣泛存在，是一種常見(jiàn)的人畜共患病原[1]。SA可引起奶牛乳房炎，犬、兔的膿皮癥，多種動(dòng)物的敗血癥，是制約我國(guó)養(yǎng)殖業(yè)健康發(fā)展的重要細(xì)菌病原，對(duì)人與動(dòng)物公共衛(wèi)生安全造成威脅[2]。目前，金黃色葡萄球菌感染病例通常采用抗生素類(lèi)藥物治療，但由于耐藥菌株的出現(xiàn)，導(dǎo)致在臨床上多種抗生素藥物治療效果不佳，因此，致病性金黃色葡萄菌的耐藥性的檢測(cè)具有十分重要的現(xiàn)實(shí)意義。本研究從一例患有敗血癥的銀狐體內(nèi)分離到一株疑似金黃色葡萄球菌的菌株，對(duì)其進(jìn)行鑒定并對(duì)分離菌株的致病性和耐藥性進(jìn)行研究。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病料來(lái)源 病死銀狐由秦皇島某狐養(yǎng)殖場(chǎng)送樣，臨床剖檢癥狀以敗血癥為主。

1.1.2 試驗(yàn)動(dòng)物 昆明小鼠，體重(20±2)g，購(gòu)自北京維通利華試驗(yàn)動(dòng)物有限公司。

1.1.3 主要試劑 胰蛋白胨大豆肉湯培養(yǎng)基(TSB)，購(gòu)自島高科技工業(yè)園海博生物技術(shù)有限公司；哥倫比亞血瓊脂培養(yǎng)基(羊血)，購(gòu)自廣州迪景微生物科技有限公司；革蘭氏染色液，購(gòu)自北京博奧拓達(dá)科技有限公司；藥敏紙片，鏈球菌細(xì)菌生化編碼鑒定管,均購(gòu)自杭州濱和微生物科技股份有限公司；2×Taq Master Mix、細(xì)菌DNA基因組提取試劑盒，均購(gòu)自康為世紀(jì)生物科技有限公司；PCR擴(kuò)增引物合成和序列測(cè)定服務(wù)均由上海生工生物工程公司完成。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)菌的分離純化 無(wú)菌采取病死狐肝臟，在超凈臺(tái)中將肝臟接種于血瓊脂培養(yǎng)基中，在37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，挑取優(yōu)勢(shì)菌落接種于TSB培養(yǎng)基中，置于37℃恒溫?fù)u床培養(yǎng)12h。

1.2.2 分離菌的革蘭氏染色 按照革蘭氏染色液說(shuō)明書(shū)對(duì)分離菌進(jìn)行染色，染色后用顯微鏡的油鏡觀察。

1.2.3 分離菌的生化鑒定 按照生化鑒定管的說(shuō)明書(shū)操作并對(duì)結(jié)果判定。

1.2.4 分離菌的16S rDNA鑒定 由上海生工生物工程公司合成16S rDNA通用引物，引物序列為27F：AGAGTTTGATCCTGGCTCAG，1492R：TACGGYTACCTTGTTACGACTT。用細(xì)菌基因組提取試劑盒提取分離菌DNA作為PCR模板。PCR反應(yīng)體系(總體積50μl)上游引物、下游引物、模板均為1μl，2×Taq Master Mix 25μl，ddH2O 22μl。PCR反應(yīng)程序94℃預(yù)變性5min；94℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸60s，共30個(gè)循環(huán)；72℃延伸10min。反應(yīng)結(jié)束后將PCR產(chǎn)物切膠回收，將回收產(chǎn)物送至上海生工生物工程公司測(cè)序。測(cè)序結(jié)果在NCBI的Blast分區(qū)檢索并下載相關(guān)參考菌株序列，用Lasergene軟件的Megalign功能建立進(jìn)化樹(shù)和同源性比對(duì)。

1.2.5 分離菌的致病性試驗(yàn) 參考文獻(xiàn)[3, 4]中的方法，以昆明小鼠為動(dòng)物模型進(jìn)行致病性試驗(yàn)。將純化后的菌液轉(zhuǎn)接至TSB培養(yǎng)基，置于恒溫?fù)u床培養(yǎng)12h，離心棄上清，用無(wú)菌PBS緩沖液重懸，調(diào)整菌液濃度至1×108cfu/ml。感染組小鼠5只，每只小鼠腹腔注射0.1ml調(diào)整濃度后的菌液；對(duì)照組小鼠5只，每只小鼠腹腔注射0.1ml無(wú)菌的PBS緩沖液。連續(xù)觀察試驗(yàn)小鼠一周，記錄發(fā)病及死亡情況，剖檢死亡小鼠，分離肝臟、心臟等器官細(xì)菌并鑒定。

1.2.6 分離菌的藥物敏感性試驗(yàn) 采取KB紙片法檢測(cè)分離菌對(duì)15種抗生素的敏感性，試驗(yàn)操作以及結(jié)果判定按照美國(guó)臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(huì)(Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行。

2 結(jié)果

2.1 分離菌的培養(yǎng)特性和形態(tài)特征

分離菌在血瓊脂培養(yǎng)基上培養(yǎng)，菌落表面光滑，濕潤(rùn)，隆起，呈淡黃色的卵圓形，菌落周?chē)忻黠@的β溶血環(huán)。革蘭氏染色結(jié)果顯示，分離菌為革蘭氏陽(yáng)性球菌，大部分呈葡萄狀排列。

圖1 分離菌的培養(yǎng)特性和形態(tài)特征

A分離菌在血瓊脂培養(yǎng)基菌落形態(tài)；B分離菌的革蘭氏染色形態(tài)(100×)

2.2 分離菌的生化鑒定

生化鑒定試驗(yàn)結(jié)果顯示，分離菌能分解蔗糖、甘糖、麥芽糖、甘露醇、尿素，還原硝酸鹽，其余反應(yīng)均為陰性(表1)。將試驗(yàn)結(jié)果對(duì)照《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊(cè)》，符合金黃色葡萄球菌的生化特性。

表1 分離菌的生化鑒定結(jié)果

2.3 分離菌的16S rDNA鑒定

分離菌的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)和同源性比對(duì)見(jiàn)圖。系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)顯示，分離菌與金黃色葡萄球菌參考菌株處于同一分支，與鏈球菌屬參考菌株處于同一個(gè)大分支，與大腸桿菌、沙門(mén)氏菌和巴氏桿菌屬的參考菌株不在同一分支。同源性比對(duì)結(jié)果顯示，分離菌與金黃色葡萄球菌參考菌株同源性為100%。分離菌的16S rDNA鑒定結(jié)果表明，分離菌為金黃色葡萄球菌。

圖2 分離菌的16S rDNA鑒定結(jié)果

C系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)；D同源性比對(duì)

2.4 分離菌的致病性試驗(yàn)

分離菌感染小鼠后，小鼠精神萎靡，共濟(jì)失調(diào)，并于36h全部死亡。剖檢死亡的小鼠，發(fā)現(xiàn)其肺臟、肝臟等器官有明顯出血癥狀，分離肝臟、心臟細(xì)菌并鑒定，分離到金黃色葡萄球菌。對(duì)照組小鼠無(wú)病征以及死亡。

2.5 分離菌的藥物敏感性試驗(yàn)

分離菌藥物敏感性結(jié)果見(jiàn)表2。分離菌對(duì)頭孢曲松、環(huán)丙沙星、恩諾沙星共3種抗生素表現(xiàn)敏感，對(duì)氨芐西林、阿米卡星、卡那霉素、替米考星共4種抗生素表現(xiàn)中介，對(duì)阿莫西林、新霉素、多西環(huán)素、土霉素、氟苯尼考、磺胺間甲氧嘧啶、磺胺對(duì)甲氧嘧啶、復(fù)方新諾明共8種抗生素表現(xiàn)耐藥。分離菌具有多重耐藥性，并且耐藥情況比較嚴(yán)重。

表2 分離菌的藥物敏感性試驗(yàn)結(jié)果 (mm)

注：R表示耐藥，I表示中介，S表示敏感。

3 討論

（1）金黃色葡萄球菌是人畜共患的條件性致病菌，在空氣、水、土壤等環(huán)境和動(dòng)物機(jī)體內(nèi)廣泛存在[5]。有報(bào)道從患病的牛、兔、雞等動(dòng)物分離到金黃色葡萄球菌的報(bào)道[6-8]，但國(guó)內(nèi)外從患病毛皮動(dòng)物分離到金黃色葡萄球菌的報(bào)道較少，因此，臨床診斷過(guò)程中對(duì)金黃色葡萄球菌感染所致毛皮動(dòng)物發(fā)病未得到人們重視。本次從患有敗血癥的銀狐肝臟分離到一株金黃色葡萄球菌，通過(guò)致病性試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)該分離菌感染小鼠后小鼠死亡率較高，說(shuō)明分離菌具有較強(qiáng)致病力。商圓圓從患病水貂體內(nèi)分離到金黃色葡萄球菌，其分離菌同樣具有較高的致病性[9]。因此，在臨床診斷過(guò)程中應(yīng)注意金黃色葡萄球菌感染毛皮動(dòng)物發(fā)病。（2）由金黃色葡萄球菌引起的動(dòng)物疾病的防治主要依賴(lài)于抗生素類(lèi)藥物，但由于抗生素類(lèi)藥物濫用，導(dǎo)致細(xì)菌的耐藥性愈加嚴(yán)重，最終使抗生素類(lèi)藥物的治療效果越來(lái)越差。本次分離的狐源金黃色葡萄球菌具有嚴(yán)重的耐藥性，僅β－內(nèi)酰胺類(lèi)的頭孢曲松，喹諾酮類(lèi)環(huán)丙沙星和恩諾沙星對(duì)該菌具有較好的抑菌效果，其余抗生素類(lèi)藥物的對(duì)分離菌的抑菌效果不佳甚至無(wú)抑菌效果。但由于不同地區(qū)飼養(yǎng)方式和治療方法不同，因此，建議臨床治療狐感染金黃色葡萄球菌所致疾病先通過(guò)藥物敏感性試驗(yàn)篩選出抑菌效果較好的藥物，再根據(jù)臨床情況合理用藥，可以減少細(xì)菌耐藥性的產(chǎn)生，還可減少養(yǎng)殖戶(hù)的經(jīng)濟(jì)損失。（3）若經(jīng)診斷養(yǎng)殖的動(dòng)物感染金黃色葡萄球菌，應(yīng)及時(shí)就診，并注意加強(qiáng)飼養(yǎng)管理，提高機(jī)體免疫力，對(duì)飼養(yǎng)環(huán)境、水槽食槽等進(jìn)行消毒，避免疾病擴(kuò)散傳播。

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秦皇島市科技創(chuàng)新平臺(tái)建設(shè)運(yùn)行項(xiàng)目(201702B001)；河北省科技廳項(xiàng)目(18246629G)；河北省教育廳項(xiàng)目(ZD2017234)；農(nóng)業(yè)部特種動(dòng)物疫病重點(diǎn)試驗(yàn)室開(kāi)放課題(01830)

（2020–02–29）

S852.61+1

A

1007-1733(2020)06-0004-03