GC-MS方法分析新鮮碧桃花揮發(fā)油及β-葡萄糖苷酶對(duì)碧桃花的增香和抗菌作用

史博文,劉錚錚,劉語(yǔ),宋寧*

(1.西安國(guó)際醫(yī)學(xué)中心麻醉手術(shù)中心,西安710075；2.西安交通大學(xué)藥學(xué)院，西安710061)

碧桃(AmygdaluspersicaLinn. var.persicaf.duplexRehd.)屬薔薇科落葉小喬木，是優(yōu)良的觀賞樹(shù)種之一，深受人們和園藝工作者的青睞。碧桃花，又名千葉桃花，是桃的變種，常見(jiàn)品種有白花碧桃、紅花碧桃、垂枝碧桃、撒金碧桃等?！对?shī)經(jīng)》有載：“桃之夭夭，灼灼其華”。碧桃在中國(guó)已有3000多年的栽培歷史，現(xiàn)在全國(guó)各地廣泛栽培，主產(chǎn)于西北、華北、華東、西南等地區(qū)[1]。碧桃除具有較高的園林綠化價(jià)值外，它的食用、藥用價(jià)值也為人類(lèi)創(chuàng)造了許多財(cái)富。碧桃樹(shù)干上汁液結(jié)膠形成的塊狀物俗稱(chēng)桃膠，不僅可食用，而且具有養(yǎng)陰生津，清瀉虛熱的作用[2]；其未成熟的果實(shí)稱(chēng)為碧桃干或桃奴，有收斂止汗之功[2]，還可治療兒童營(yíng)養(yǎng)性貧血[3]；由碧桃為主藥組成的碧桃咳喘飲可防治急慢性支氣管炎[4]。

目前，對(duì)碧桃的研究主要集中在栽培種植上[5-6]，對(duì)其化學(xué)成分和抗菌活性研究鮮有報(bào)道。同時(shí)，植物揮發(fā)油作為植物重要的次生代謝物質(zhì)之一，具有抗菌、抗炎、抗氧化、安全等特點(diǎn)[7-9]，在醫(yī)學(xué)、食品、香料、化妝品等方面具有廣闊的應(yīng)用前景。因此，本實(shí)驗(yàn)采用揮發(fā)油提取器法提取新鮮碧桃花中揮發(fā)油，并通過(guò)氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用方法進(jìn)行成分分析，采用抗菌實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)其體外抑菌活性，為進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用碧桃花揮發(fā)油提供理論依據(jù)。

β-葡萄糖苷酶是能夠水解芳香基或烷基葡萄糖甙或纖維二糖的糖苷鍵的一類(lèi)酶[10]，能將鮮花中如糖苷類(lèi)等本身無(wú)香味、不揮發(fā)的物質(zhì)水解，釋放出潛在的香氣成分，產(chǎn)生濃郁的具有天然特征香味的物質(zhì)，起到自然增香的作用[11-12]。

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)比較加入β-葡萄糖苷酶前后新鮮碧桃花揮發(fā)油化學(xué)成分變化研究β-葡萄糖苷酶對(duì)其增香作用，同時(shí)通過(guò)抗菌實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)β-葡萄糖苷酶對(duì)其抑菌作用的影響。

1 材料與方法

1.1 材料、儀器與試劑

材料：新鮮碧桃花于2019年3月采自西安交通大學(xué)藥學(xué)院的藥園，由西安交通大學(xué)藥學(xué)院牛曉峰教授鑒定為薔薇科植物碧桃(AmygdaluspersicaLinn. var.persicaf.duplexRehd.)的花(黃色花)；大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、傷寒沙門(mén)氏菌，以上菌種由西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部微生物教研室提供。

儀器：GCMS-TQ8040型氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(日本島津公司)；AY120電子天平(日本島津公司)；超凈工作臺(tái)(美國(guó)Thermo公司)；恒溫培養(yǎng)箱(美國(guó)Thermo公司)；立式高壓滅菌器(上海申安醫(yī)療器械廠)。

試劑：β-葡萄糖苷酶(上海源葉生物科技有限公司，100 U/g)；正己烷(上海阿拉丁生化科技股份有限公司，色譜純)；無(wú)水硫酸鈉(西安化學(xué)試劑廠，分析純)；磷酸氫二鈉(河南焦作市化工三廠，分析純)；檸檬酸(成都化學(xué)試劑廠，分析純)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 β-葡萄糖苷酶水解反應(yīng)。分別稱(chēng)取兩份200 g新鮮碧桃花于250 mL pH 5.0的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖溶液中，其中一份加0.5 g β-葡萄糖苷酶，另一份為空白對(duì)照。同時(shí)置于搖床中50 ℃恒溫水浴5 h。

1.2.2 揮發(fā)油的提取。將β-葡萄糖苷酶水解前后的碧桃花分別置于2000 mL圓底燒瓶中，加水800 mL，沸石數(shù)粒，搖勻，按2015版《中國(guó)藥典(四部)》揮發(fā)油測(cè)定法(通則2204甲法)提取揮發(fā)油，保持微沸5 h。收集所得揮發(fā)油，加入少量無(wú)水硫酸鈉，靜置。稱(chēng)取揮發(fā)油適量置于10 mL量瓶中，加正己烷溶解并稀釋至刻度，待測(cè)(用于GC-MS分析)。稱(chēng)取新鮮碧桃花揮發(fā)油適量，臨用前用無(wú)菌蒸餾水配成2.000、1.000、0.500、0.250、0.125、0.063、0.031、0.016 mg/mL溶液(用于抗菌試驗(yàn))，未加β-葡萄糖苷酶處理所提取的碧桃花揮發(fā)油為揮發(fā)油(1)，加β-葡萄糖苷酶處理后提取的碧桃花揮發(fā)油為揮發(fā)油(2)。

1.2.3 氣相色譜-質(zhì)譜條件

1.2.3.1 氣相條件：色譜柱為SHIMADZU SH-Rxi-5sil MS毛細(xì)管色譜柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)；載氣為氦氣；進(jìn)樣口溫度為250 ℃；分流比為5∶1；流速為1.0 mL/min；升溫程序：初始溫度60 ℃，保持3 min，以2 ℃/min速率升到120 ℃，再以3 ℃/min速率升到210 ℃，保持2 min，再以15 ℃/min升溫至280 ℃，保持2 min；進(jìn)樣量：1 μL。

1.2.3.2 質(zhì)譜條件：接口溫度：250 ℃；離子源：EI；離子源電壓：60 ev；離子源溫度：230 ℃；質(zhì)量掃描范圍：45～550 m/z；溶劑峰切除時(shí)間：2.5 min，質(zhì)譜檢測(cè)起測(cè)時(shí)間：3.0 min。

1.2.4 最小抑菌濃度的測(cè)定。采用瓊脂平板稀釋法計(jì)算最低抑菌濃度(MIC)[13-14]。以環(huán)丙沙星為對(duì)照，將環(huán)丙沙星和碧桃花揮發(fā)油用無(wú)菌蒸餾水進(jìn)行倍比稀釋?zhuān)苽湎盗袧舛认♂屢?，然后用無(wú)菌吸管將稀釋液分別定量加入到無(wú)菌培養(yǎng)皿中，與定量加入的培養(yǎng)基充分混勻，靜置凝固后，制成含樣品平板，按皿底的記號(hào)，在以上培養(yǎng)基上分別接種傷寒沙門(mén)氏菌、大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌，移入培養(yǎng)箱中35～37 ℃培養(yǎng)24 h，觀察細(xì)菌生長(zhǎng)情況；另取一個(gè)稀釋系列，不接種任何菌種作為對(duì)照，以完全沒(méi)有菌生長(zhǎng)的最低濃度作為碧桃花揮發(fā)油的最低抑菌濃度(MIC)。計(jì)算最小抑菌濃度(MIC)。

1.2.5 數(shù)據(jù)處理。所得的色譜和質(zhì)譜信息經(jīng)數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)與其內(nèi)存譜庫(kù)(NIST)自動(dòng)檢索和解析，并用峰面積歸一法測(cè)定了各化學(xué)成分在揮發(fā)油中的相對(duì)百分含量?？咕鷮?shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，顯著性差異水平為0.05。

2 結(jié)果

2.1 新鮮碧桃花中揮發(fā)油成分分析

經(jīng)GC-MS分析測(cè)得新鮮碧桃花中揮發(fā)油提取物的總離子流圖如圖1和圖2所示。

圖1 新鮮碧桃花揮發(fā)油的GC-MS總離子流圖(無(wú)酶)

采用NIST標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜圖數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行綜合對(duì)比分析，由色譜峰面積歸一化法計(jì)算各化學(xué)成分的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，共鑒定出32種主要的揮發(fā)性化學(xué)成分，分析結(jié)果見(jiàn)表1。

注：*代表加β-葡萄糖苷酶組

由表1可知，新鮮碧桃花在分析鑒定出32種揮發(fā)性化學(xué)成分，主要有醇類(lèi)(5種，占2.53%)，烯類(lèi)(1種，占0.57%)，烷烴類(lèi)(8種，占6.76%)，酚類(lèi)(4種，占7.7%)，醛類(lèi)(6種，占49.91%)，酮類(lèi)(2種，占13.33%)，酯類(lèi)(3種，占17.74%)，醚類(lèi)(1種，占0.23%)芳烴類(lèi)(1種，占1.02%)和酸類(lèi)(1種，占0.21%)10類(lèi)化合物。其中，醛類(lèi)、酮類(lèi)和酯類(lèi)化合物相對(duì)含量較高，其主要成分為苯甲醛(48.92%)，苯甲酸芐酯(12.79%)，植酮(6.89%)，2-羥基-5-甲基苯乙酮(6.44%)，乙酸芐酯(4.68%)。醚類(lèi)和酸類(lèi)化合物含量較低。

通過(guò)表1的對(duì)比可知，在新鮮碧桃花中加入β-葡萄糖苷酶后香氣成分的含量顯著增加。加入β-葡萄糖苷酶后新增了2種化合物，分別為(-)-冰片和2,4-癸二烯醛，減少了1種化合物，為4-叔丁基-2,6-二異丙基苯酚。同時(shí)，反式-2,4-癸二烯醛、壬醛、苯甲酸乙酯、乙酸芐酯等化合物含量均增加，相對(duì)含量分別增加7.04%、0.24%、0.16%、2.57%，增長(zhǎng)率達(dá)到4141.76%、137.40%、58.15%和54.86%，而苯甲酸芐酯、丁香酚、苯甲酸等化合物含量相對(duì)減少。

天然香料來(lái)自于動(dòng)植物，但以植物為主。有研究表明[15]，香味成分與葡萄糖等結(jié)合成糖苷后，不具揮發(fā)性或揮發(fā)性很低，酶和化學(xué)方法分解這些糖苷能增加精油產(chǎn)量，對(duì)香氣的形成起著重要的作用。碧桃花中許多化學(xué)成分可用作香料，在食品、化妝品、化工等行業(yè)應(yīng)用廣泛。冰片是龍腦香科植物龍腦香的樹(shù)脂和揮發(fā)油加工品提取獲得的結(jié)晶，廣泛用于配制迷迭香、熏衣草型香精，并用于中藥和中國(guó)墨中。丁香酚天然存在于丁香油、丁香羅勒油以及肉桂油等精油中，具有強(qiáng)烈的丁香香氣和辛香香氣，是調(diào)配香石竹花香的體香，用入有色香皂加香，也可用于辛香、木香和東方型、薰香型中，還可用于食用的辛香型、薄荷、堅(jiān)果、各種果香、棗子香等香精及煙草香精中。反式-2,4-癸二烯醛GB 2760-1996規(guī)定為允許使用的香料，主要用于配制雞肉香精及土豆片、柑橘、油炸品和香辛型食品。壬醛GB 2760-1996規(guī)定為暫時(shí)允許使用的食用香料，主要用于配制橙子、檸檬和白檸檬等型香精，用量極微。苯甲酸乙酯常用于配制香水香精和人造精油，也可用作食用香料。乙酸芐酯常用于配制茉莉型等花香香精和皂用香精。

加入β-葡萄糖苷酶后碧桃花中反式-2,4-癸二烯醛、壬醛、苯甲酸乙酯、乙酸芐酯等香精類(lèi)成分含量大幅增加，同時(shí)新增了(-)-冰片和2,4-癸二烯醛2種化合物，說(shuō)明β-葡萄糖苷酶可水解碧桃花香氣前體物質(zhì)，釋放出碧桃花中潛在香氣成分，對(duì)碧桃花有一定的增香作用。

2.2 抗菌實(shí)驗(yàn)結(jié)果

新鮮碧桃花揮發(fā)油對(duì)傷寒沙門(mén)氏菌等4種供試細(xì)菌的抑制實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表2所示。

表2 新鮮碧桃花揮發(fā)油抗菌實(shí)驗(yàn)MIC值(mg·mL-1,n=3 )

由表2可知，新鮮碧桃花揮發(fā)油對(duì)傷寒沙門(mén)氏菌等4種供試菌具有明顯抑制作用。揮發(fā)油(1)和揮發(fā)油(2)進(jìn)行比較，揮發(fā)油(2)仍具有一定增加抗菌作用。說(shuō)明經(jīng)過(guò)β-葡萄糖苷酶處理后再提取的揮發(fā)油抗菌活性不變。

3 結(jié)論

通過(guò)建立碧桃花揮發(fā)油的GC-MS方法，共鑒定出32種揮發(fā)性化學(xué)成分，其揮發(fā)油的化學(xué)成分主要以醛、酮、酯類(lèi)化合物為主。加入β-葡萄糖苷酶后反式-2,4-癸二烯醛等香精類(lèi)化學(xué)成分含量大幅增加，說(shuō)明β-葡萄糖苷酶能釋放出碧桃花中潛在香氣成分，對(duì)碧桃花有一定的增香作用，同時(shí)抗菌實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明β-葡萄糖苷酶不改變其抗菌活性，為進(jìn)一步開(kāi)發(fā)和利用碧桃花資源提供了理論依據(jù)。