miR-141-3p表達(dá)對(duì)人異位子宮內(nèi)膜細(xì)胞增殖與凋亡影響及其機(jī)制

(鄭州大學(xué)第三附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科,河南 鄭州 450052)

目前關(guān)于子宮內(nèi)膜異位癥發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明[1-2]。既往研究已表明，體腔化生、血管轉(zhuǎn)移等均可能引發(fā)子宮內(nèi)膜異位癥，而人異位子宮內(nèi)膜細(xì)胞(HEEC)惡性增殖及凋亡能力降低是子宮內(nèi)膜異位癥的主要病理機(jī)制[3-4]。因此，深入探究HEEC增殖及凋亡的分子機(jī)制有助于提高子宮內(nèi)膜異位癥治療效果。研究已表明，微小RNA-141(microRNA-141，miR-141)在子宮內(nèi)膜異位癥病人中表達(dá)下調(diào)，但關(guān)于其具體作用機(jī)制尚未明確[5-6]。miR-141是微小RNA-141-3p(microRNA-141-3p，miR-141-3p)的前體，關(guān)于miR-141-3p對(duì)HEEC生物行為的影響及其機(jī)制研究相對(duì)較少。已有研究表明，子宮內(nèi)膜異位癥病人中高遷移率族蛋白 B1(HMGB1)的表達(dá)水平升高，其可能通過(guò)調(diào)節(jié)新生血管生成而參與子宮內(nèi)膜異位癥發(fā)生過(guò)程[7]。Target Scan網(wǎng)站預(yù)測(cè)顯示，HMGB1可能是miR-141-3p的靶基因，但miR-141-3p是否可通過(guò)靶向調(diào)控HMGB1而影響HEEC的增殖及凋亡尚未明確。為此，本研究探討miR-141-3p表達(dá)對(duì)HEEC增殖及凋亡的影響，分析其與HMGB1的靶向調(diào)控關(guān)系及其可能作用機(jī)制。現(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

2016年2月—2018年10月，選取本院收治的45例子宮內(nèi)膜異位癥病人為研究對(duì)象，年齡35～60歲，平均(45.52±5.62)歲。臨床分期[8]：Ⅱ期10例，Ⅲ期20例，Ⅳ期15例。所有病人均經(jīng)手術(shù)病理證實(shí)為子宮內(nèi)膜異位癥，術(shù)前3個(gè)月內(nèi)未服用性激素類(lèi)藥物，于術(shù)中切取異位內(nèi)膜組織。同時(shí)，選取同期因婦科良性病變進(jìn)行子宮切除術(shù)的43例病人為對(duì)照組，年齡為42～60歲，平均(56.72±7.13)歲。所有病人均經(jīng)手術(shù)病理證實(shí)，術(shù)中切取正常子宮內(nèi)膜組織。排除合并其他生殖系統(tǒng)腫瘤者。兩組病人年齡、月經(jīng)周期等相比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。本研究經(jīng)本院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，病人均知情并簽署同意書(shū)。

1.2 實(shí)驗(yàn)材料

DMEM培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Hyclone公司；胰蛋白酶和胎牛血清均購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；Ⅰ型膠原酶購(gòu)自上海百賽生物技術(shù)股份有限公司；miR-141-3pmimics、miR-141-3p抑制劑(anti-miR-141-3p)及其各自陰性對(duì)照試劑均購(gòu)自廣州銳博生物科技有限公司；Lipofectamine2000購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；Trizol試劑購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒與實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(qRT-PCR)檢測(cè)試劑盒均購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher公司；MTT細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑盒購(gòu)自上海生物工程股份有限公司；Annexin V-FITC/PI檢測(cè)試劑盒購(gòu)自武漢艾美捷科技有限公司；雙熒光素酶活性檢測(cè)試劑盒購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；RIPA裂解液購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；兔抗人Cyclin D1、Bcl-2、P21、Bax抗體購(gòu)自美國(guó)Abcam公司；HRP標(biāo)記的IgG二抗購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司；兔抗人HMGB1抗體購(gòu)自武漢菲恩生物科技有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1體外原代培養(yǎng)HEEC 應(yīng)用差速梯度離心與細(xì)胞貼壁時(shí)間差等方法分離異位內(nèi)膜腺上皮細(xì)胞及間質(zhì)細(xì)胞。剪碎膜組織，Ⅰ型膠原酶(2 g/L)消化60 min，用100目濾網(wǎng)過(guò)濾，將含有PBS的DMEM培養(yǎng)液加入濾液內(nèi)，4 ℃條件下，以700 r/min離心7 min，棄上清，接種至培養(yǎng)皿(間質(zhì)細(xì)胞)，加入含有體積分?jǐn)?shù)0.10胎牛血清的培養(yǎng)液，放入37 ℃、體積分?jǐn)?shù)0.05 CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)[9]。

1.3.2實(shí)驗(yàn)分組 待HEEC傳代至第3代時(shí)，收集生長(zhǎng)狀態(tài)良好的HEEC，隨機(jī)分為miR-NC組(細(xì)胞中轉(zhuǎn)染miR-NC)、miR-141-3p組(轉(zhuǎn)染miR-141-3pmimics的細(xì)胞)。嚴(yán)格按照Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染試劑說(shuō)明書(shū)的步驟進(jìn)行操作，轉(zhuǎn)染6 h后更換含有體積分?jǐn)?shù)0.10胎牛血清的DMEM完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48 h，收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞完成功能驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)。

1.3.3qRT-PCR檢測(cè)miR-141-3p表達(dá)水平 采用Trizol法分別提取正常子宮內(nèi)膜組織、異位子宮內(nèi)膜組織、HEEC的總RNA，依次分別加入200 μL 氯仿與500 μL異丙醇，4 ℃下、12 000 r/min離心15 min，棄上清，RNA沉于管底。以體積分?jǐn)?shù)0.75乙醇洗滌RNA沉淀，晾干后加入適量無(wú)RNA酶水，充分溶解RNA，置于-80 ℃超低溫冰箱保存。應(yīng)用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，qRT-PCR法檢測(cè)miR-141-3p相對(duì)表達(dá)量。反應(yīng)條件：95 ℃、5 min，95 ℃、30 s，60 ℃、30 s，72 ℃、30 s，共循環(huán)40次。miR-141-3p以U6為內(nèi)參，采用 2-ΔΔCt法計(jì)算miR-141-3p的表達(dá)水平。

1.3.4MTT檢測(cè)細(xì)胞增殖 收集轉(zhuǎn)染后各組的HEEC，胰蛋白酶消化，制備細(xì)胞懸浮液，以每孔3×105個(gè)細(xì)胞的密度接種于96孔板。分別于培養(yǎng)24、48、72 h時(shí)每孔入MTT溶液20 μL，室溫孵育4 h，棄上清，每孔加入二甲基亞砜(DMSO)溶液150 μL，低速振蕩10 min。利用酶標(biāo)儀檢測(cè)各孔在490 nm波長(zhǎng)處的吸光度(A)。每組實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次。

1.3.5流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡 收集各組對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期HEEC，PBS洗滌，胰蛋白酶消化，4 ℃下、10 000 r/min離心5 min。PBS洗滌細(xì)胞，分別加入200 μL結(jié)合緩沖液，依次加入5 μL 的Annexin V-FITC與5 μL 的PI，室溫避孵育20 min。置于流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。 每組實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次。

1.3.6熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè) 靶基因預(yù)測(cè)網(wǎng)站預(yù)測(cè)miR-141-3p的靶基因，預(yù)測(cè)顯示miR-141-3p與HMGB1的3′UTR存在結(jié)合位點(diǎn)，將含有miR-141-3p結(jié)合位點(diǎn)及其突變位點(diǎn)的HMGB1-3′UTR片段插入PGL3熒光素酶報(bào)告基因載體，構(gòu)建野生型(WT-HMGB1)與突變型(MUT-HMGB1)的熒光素酶報(bào)告載體。實(shí)驗(yàn)分為4組：WT-HMGB1+miR-NC共轉(zhuǎn)染組、WT-HMGB1+miR-141-3pmimics共轉(zhuǎn)染組、MUT-HMGB1+miR-NC共轉(zhuǎn)染組、MUT-HMGB1+miR-141-3pmimics共轉(zhuǎn)染組。轉(zhuǎn)染24 h后收集細(xì)胞，采用雙熒光素酶活性檢測(cè)試劑盒檢測(cè)各組相對(duì)熒光素酶活性。每組實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次。

1.3.7蛋白免疫印跡(Western blot)檢測(cè)HMGB1、Cyclin D1、Bcl-2、P21、Bax蛋白表達(dá) 分別取各組HEEC，加入細(xì)胞裂解液裂解細(xì)胞，4 ℃條件下、12 000 r/min離心15 min。收集上清，BCA法測(cè)定蛋白濃度。蛋白煮沸變性，取30 μg蛋白上樣進(jìn)行100 g/L的SDS-PAGE凝膠電泳，將分離的蛋白凝膠轉(zhuǎn)移至PVDF膜。50 g/L脫脂奶粉封閉1 h，加入一抗(稀釋比1∶1 000)，4 ℃孵育24 h，TBST清洗；加入二抗(稀釋比1∶2 000)，室溫孵育30 min，TBST洗膜。應(yīng)用ECL試劑盒進(jìn)行化學(xué)發(fā)光反應(yīng)，置于凝膠成像系統(tǒng)并應(yīng)用Quantity One軟件定量分析蛋白條帶灰度值。每組實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 正常和異位子宮內(nèi)膜組織miR-141-3p表達(dá)

本文qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果表明，正常與異位子宮內(nèi)膜組織中miR-141-3p表達(dá)水平分別為0.87±0.08和0.17±0.02，異位子宮內(nèi)膜組織中miR-141-3p表達(dá)水平較正常子宮內(nèi)膜顯著降低，差異有顯著意義(t=56.880，P<0.001)。

2.2 miR-141-3p過(guò)表達(dá)對(duì)HEEC增殖與凋亡及相關(guān)蛋白影響

HEEC中轉(zhuǎn)染miR-141-3pmimics后，與miR-NC組(對(duì)照組)相比，miR-141-3p組(實(shí)驗(yàn)組)細(xì)胞活力顯著降低(t=10.972～13.403，P<0.001)，細(xì)胞凋亡率顯著升高(t=18.233，P<0.001)，Cyclin D與Bcl-2蛋白的水平降低(t=24.931、25.456，P<0.001)，P21與Bax蛋白的水平則升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=19.312、20.175，P<0.001)。見(jiàn)圖1與表1、2。

A：miR-141-3p過(guò)表達(dá)對(duì)HEEC凋亡的影響；B：miR-141-3p過(guò)表達(dá)對(duì)HEEC增殖與凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響。對(duì)照組：miR-NC；實(shí)驗(yàn)組：miR-141-3p。

圖1 miR-141-3p過(guò)表達(dá)對(duì)HEEC增殖與凋亡及相關(guān)蛋白影響

與對(duì)照組比較，*t=10.972～25.456，P<0.001。

分組Bax蛋白Bcl-2蛋白凋亡率(χ/%)對(duì)照組0.27±0.030.80±0.088.31±0.81實(shí)驗(yàn)組 0.82±0.08* 0.13±0.01* 22.16±2.13*

與對(duì)照組比較，*t=18.233～24.931，P<0.001。

2.3 miR-141-3p靶向?qū)MGB1蛋白表達(dá)的影響

Target Scan預(yù)測(cè)顯示，HMGB1的3′UTR含有miR-141-3p的互補(bǔ)序列。見(jiàn)圖2A。雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，WT-HMGB1+miR-NC共轉(zhuǎn)染組、WT-HMGB1+miR-141-3pmimics共轉(zhuǎn)染組、MUT-HMGB1+miR-NC共轉(zhuǎn)染組和MUT-HMGB1+miR-141-3pmimics共轉(zhuǎn)染組HMGB1的相對(duì)熒光素酶活性分別為1.05±0.10、0.27±0.03、1.07±0.10和1.02±0.09，HEEC細(xì)胞中轉(zhuǎn)染miR-141-3pmimics可顯著降低含有miR-141-3p結(jié)合位點(diǎn)熒光報(bào)告載體的相對(duì)熒光素酶活性(n=9，t=22.413，P<0.001)；后兩組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=1.115，P>0.05)。Western blot的檢測(cè)結(jié)果顯示，miR-NC組、miR-141-3p組、anti-miR-NC組和anti-miR-141-3p組HMGB1蛋白表達(dá)分別為0.63±0.06、0.21±0.02、0.64±0.06和0.99±0.10，各組比較差異有顯著性(n=9，F(xiàn)=208.278，P<0.001)。miR-141-3p過(guò)表達(dá)后，細(xì)胞中HMGB1蛋白的水平為0.21±0.02，與miR-NC組的0.63±0.06相比較顯著降低(t=19.922，P<0.05)；抑制miR-141-3p表達(dá)后，細(xì)胞中HMGB1蛋白水平為0.99±0.10，與anti-miR-NC組的0.64±0.06相比較顯著升高(t=9.004，P<0.05)。見(jiàn)圖2B。表明HMGB1是miR-141-3p的靶基因，miR-141-3p可負(fù)性調(diào)控HMGB1的表達(dá)。

A：HMGB1的3′UTR含有miR-141-3p的互補(bǔ)序列。B：Western blot檢測(cè)HMGB1表達(dá)，a為miR-NC組、b為miR-141-3p組、c為anti-miR-NC組、d為anti-miR-141-3p組。

圖2miR-141-3p靶向?qū)MGB1蛋白表達(dá)的影響

3 討 論

子宮內(nèi)膜異位癥主要指子宮腔被覆內(nèi)膜外存在子宮內(nèi)膜組織生長(zhǎng)及浸潤(rùn)。研究表明，miRNA可通過(guò)調(diào)控下游靶基因表達(dá)而參與子宮內(nèi)膜異位癥發(fā)生過(guò)程[10-12]。但仍有部分miRNA在子宮內(nèi)膜異位癥中的機(jī)制尚未完全闡明，因此本研究探尋新型miR-141-3p在子宮內(nèi)膜異位癥發(fā)生過(guò)程中的可能作用機(jī)制。miR-141-3p在腫瘤細(xì)胞中呈低表達(dá)，miR-141-3p過(guò)表達(dá)后可顯著抑制細(xì)胞增殖及其侵襲能力，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[13-20]。但是，miR-141-3p在子宮內(nèi)膜異位癥中的表達(dá)及其作用機(jī)制尚不明確。本研究結(jié)果顯示，miR-141-3p在異位子宮內(nèi)膜組織中呈低表達(dá)，說(shuō)明miR-141-3p表達(dá)降低可能參與子宮內(nèi)膜異位癥發(fā)生過(guò)程。本文進(jìn)一步研究顯示，miR-141-3p過(guò)表達(dá)后，HEEC的增殖能力顯著降低，細(xì)胞凋亡率顯著升高，Cyclin D1、Bcl-2蛋白表達(dá)下調(diào)，P21、Bax蛋白表達(dá)上調(diào)。已有報(bào)道指出，Cyclin D1可正向調(diào)控細(xì)胞周期進(jìn)程，促進(jìn)細(xì)胞增殖；P21可以通過(guò)抑制Cyclin D1與CDK4結(jié)合而阻滯細(xì)胞周期進(jìn)程，抑制細(xì)胞增殖[21-26]。Bcl-2、Bax蛋白是HEEC凋亡過(guò)程中的重要作用因子，Bcl-2蛋白表達(dá)升高可抑制HEEC凋亡，而B(niǎo)ax蛋白表達(dá)升高可促進(jìn)HEEC凋亡[27]。說(shuō)明miR-141-3p過(guò)表達(dá)可通過(guò)干擾細(xì)胞增殖及凋亡相關(guān)蛋白而調(diào)節(jié)HEEC的增殖及凋亡行為。即miR-141-3p過(guò)表達(dá)可抑制HEEC的增殖，促進(jìn)其凋亡。

HMGB1在子宮內(nèi)膜異位癥病人血清中的表達(dá)水平升高，并可作為子宮內(nèi)膜異位癥診斷的重要指標(biāo)[28]。HMGB1屬于DNA結(jié)合蛋白。研究表明，HMGB1可促進(jìn)炎癥反應(yīng)及血管生成，還可通過(guò)調(diào)節(jié)多種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路而參與多種疾病發(fā)生及發(fā)展過(guò)程[29。相關(guān)研究報(bào)道指出，HMGB1還可通過(guò)促進(jìn)Treg細(xì)胞分泌及增強(qiáng)其介導(dǎo)的免疫抑制作用而參與子宮內(nèi)膜異位癥發(fā)生過(guò)程[30]。本研究結(jié)果表明，miR-141-3p可靶向調(diào)控HMGB1表達(dá)。提示miR-141-3p過(guò)表達(dá)可能通過(guò)靶向調(diào)控HMGB1而抑制HEEC增殖，誘導(dǎo)其凋亡。

綜上所述，子宮內(nèi)膜異位癥病人中miR-141-3p的表達(dá)明顯降低，miR-141-3p過(guò)表達(dá)可能通過(guò)調(diào)控HMGB1的表達(dá)而抑制HEEC的增殖及促進(jìn)其凋亡。本研究結(jié)果為揭示子宮內(nèi)膜異位癥的發(fā)病機(jī)制奠定理論基礎(chǔ)，為子宮內(nèi)膜異位癥治療提供了新的思路。但關(guān)于miR-141-3p在子宮內(nèi)膜異位癥發(fā)生及發(fā)展過(guò)程中，具體通過(guò)調(diào)控哪種信號(hào)通路而發(fā)揮作用尚需進(jìn)一步探究。