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    ELISA測定中HRP/TMB顯色體系的優(yōu)化及穩(wěn)定性研究

    2020-06-28 02:00:50劉鳳銀盧嘉輝巫嘉琦黃燕璇鄒紅麗梁岳穆洪濤
    關(guān)鍵詞:吸光過氧化組分

    劉鳳銀, 盧嘉輝, 巫嘉琦, 黃燕璇, 鄒紅麗, 梁岳, 穆洪濤

    (廣東第二師范學(xué)院 生物與食品工程學(xué)院, 廣東 廣州 510303)

    *通信作者:穆洪濤,男,山東德州人,廣東第二師范學(xué)院生物與食品工程學(xué)院講師,博士.

    0 引言

    酶聯(lián)免疫吸附測定(Enzyme Linked Immunosorbent Assay,ELISA)是將抗原抗體結(jié)合的高度特異性及酶的高效催化性相結(jié)合的一種免疫分析方法,具有靈敏度高、快速簡便、成本低廉等優(yōu)點,目前已廣泛應(yīng)用于臨床醫(yī)學(xué)、食品科學(xué)、藥物分析、動物檢疫、病蟲害防治等領(lǐng)域[1-3]. ELISA測定中,最后一步的酶催化顯色反應(yīng)起到信號放大作用,通過測定顏色的深淺來計算待測物的含量. 因此,底物顯色液的質(zhì)量及顯色系統(tǒng)的穩(wěn)定性直接決定了試驗的成敗[4-6]. 目前,雖已有商品化的顯色液產(chǎn)品,但由于涉及商業(yè)機密,其配方極少公開,同時存在產(chǎn)品質(zhì)量參差不齊、價格昂貴等問題,當(dāng)教學(xué)或科研中需使用大量顯色液時,將大大增加實驗的成本和不穩(wěn)定性因素[7].

    本研究以農(nóng)藥氟樂靈間接ELISA顯色系統(tǒng)為例,通過單因素試驗,初步探討各因素對辣根過氧化物酶/3,3′,5,5′-四甲基聯(lián)苯胺(HRP/TMB)顯色體系的影響,通過正交試驗確定最佳工作條件,并對顯色液的儲藏穩(wěn)定性進行研究,以期提供一種HRP/TMB顯色體系的優(yōu)化方法及一種靈敏度高、性能穩(wěn)定的顯色液配方,為相關(guān)領(lǐng)域工作者提供參考.

    1 材料與方法

    1.1 材料

    1.1.1 實驗材料與試劑

    鼠源抗氟樂靈單克隆抗體、氟樂靈包被原(實驗室自制);牛血清白蛋白(BSA)、HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG抗體(HRP-IgG)(美國sigma公司);TMB、過氧化脲、吐溫-20、二甲基亞砜(DMSO)、甘油、蔗糖(上海阿拉丁試劑公司);96孔酶標(biāo)板(廈門怡佳美實驗器材有限公司). 其他試劑均為國產(chǎn)分析純;實驗用水為一級水.

    ELISA測定中所用緩沖液. 磷酸鹽緩沖液(PBS,0.01 mol/L,pH 7.4);碳酸鹽緩沖液(CB,0.05 mol/L,pH 9.6);洗滌緩沖液(PBST,0.01 mol/L,pH 7.4,PBS-0.5 mol/L,吐溫-20);封閉液(0.01 mol/L,pH 7.4,PBS-1% BSA,10%蔗糖,現(xiàn)配現(xiàn)用);終止液(10% H2SO4).

    1.1.2 實驗儀器

    SP-Max 2300A2光吸收型全波長酶標(biāo)儀(上海閃譜生物科技有限公司);Wellwashi MK2洗板機(美國Thermo公司);PHSJ-4F pH計(上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司);JA2603B(M)分析天平(0.1 mg)(上海精科科學(xué)儀器有限公司);微量移液器(德國艾本德股份公司);DK-8D電熱恒溫水槽(上海醫(yī)用恒溫設(shè)備廠);DHG-9140AD 鼓風(fēng)干燥箱(上海東麓儀器設(shè)備有限公司);NC-B型超純水設(shè)備(重慶尼珂).

    1.2 方法

    1.2.1 間接ELISA的操作步驟

    包被:將氟樂靈包被原用CB稀釋成1 μg/mL進行包板,100 μL/孔,37 ℃水浴箱中孵育過夜;洗滌:傾去孔內(nèi)液體,洗滌液洗板2次. 封閉:加封閉液120 μL/孔,37 ℃孵育3 h,甩干孔內(nèi)液體,倒置于37 ℃烘箱中,烘干1 h備用. 加樣及孵育:將抗氟樂靈單克隆抗體用PBST稀釋至合適濃度,100 μL/孔,37 ℃孵育40 min,洗板5次. 加酶標(biāo)二抗:將HRP-IgG用PBST稀釋5 000倍,100 μL/孔,37 ℃孵育40 min,洗板5次. 顯色:加顯色液,100 μL/孔,37 ℃孵育后,每孔加50 μL終止液,終止反應(yīng). 測定:采用酶標(biāo)儀測定各孔在450 nm處的吸光值A(chǔ)450 nm.

    1.2.2 顯色液的配制

    顯色液采用雙組分形式. 將0.2 mol/L乙酸鈉、0.1 mol/L檸檬酸按不同體積比混合,配置成不同pH的緩沖液,加入過氧化脲得組分1;精確稱取TMB溶于DMSO中,并加入一定體積的甘油,配置成儲備液,用含有EDTA-Na20.1 g、一水合檸檬酸0.42 g的溶液稀釋到合適濃度得組分2. 使用時,將組分1、組分2等體積混合,現(xiàn)配現(xiàn)用.

    1.2.3 單因素試驗

    進行ELISA實驗,測定各孔A450 nm值. 考察pH(3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5)、TMB質(zhì)量濃度(0.05、0.1、0.2、0.4、0.8、1.6 g/L)、過氧化脲質(zhì)量濃度(0.1、0.2、0.4、0.8、1.6、3.2 g/L)、DMSO體積分數(shù)(0.5%、1%、2%、4%、8%、16%)、甘油體積分數(shù)(0、0.5%、1.0%、2%、4%、8%)、顯色時間(5、10、15、20、25、30、35、40 min)對顯色效果的影響. 通過調(diào)整氟樂靈單克隆抗體的濃度,使最大吸光值在1.0~1.5之間. 同時做空白對照試驗,考察顯色液的自發(fā)顯色.

    1.2.4 正交試驗

    以緩沖液pH、TMB質(zhì)量濃度、過氧化脲質(zhì)量濃度、顯色時間為考察因素,根據(jù)單因素試驗結(jié)果,選取單因素峰值和前后臨近兩點共計3個水平,進行4因素3水平正交試驗. 具體正交試驗因素水平設(shè)置見表1.

    表1 正交試驗因素水平

    1.2.5 穩(wěn)定性試驗

    配制顯色液組分1、組分2,4 ℃密封避光儲存. 每隔10 d取出與當(dāng)天新配制組分1、組分2同時用于ELISA試驗,分別測定其對應(yīng)的吸光值,前者記為A,后者記為A0. 以儲存時間為橫坐標(biāo)、比吸光值A(chǔ)/A0為縱坐標(biāo),繪制曲線,確定本配方顯色液的儲存穩(wěn)定性及使用有效期.

    1.2.6 自制顯色液與市售同類產(chǎn)品對比分析

    按照最佳工作條件,配制HRP/TMB雙組分顯色液. 在氟樂靈ELISA檢測體系中,分別采用自制的和三種市售的雙組份顯色液,進行試驗,顯色0、3、6、9、12、15、18 min后測定A450 nm. 以顯色時間為橫坐標(biāo)、A450 nm為縱坐標(biāo),繪制曲線,比較不同顯色液的靈敏度、顯色時間、本底值及穩(wěn)定性等性能參數(shù).

    1.3 數(shù)據(jù)處理

    實驗做3個平行試驗. 實驗數(shù)據(jù)采用excel計算數(shù)據(jù)平均值及標(biāo)準(zhǔn)差;采用spss 19.0進行正交試驗設(shè)計及數(shù)據(jù)方差分析;采用origin 8.5對數(shù)據(jù)進行擬合分析.

    2 結(jié)果與討論

    2.1 單因素實驗

    a~j字母不同表示差異顯著(p<0.05)圖1 pH對顯色效果的影響

    2.1.1 pH對顯色效果的影響

    HRP/TMB顯色體系中,pH主要通過改變酶和底物的解離狀態(tài),影響酶與底物的結(jié)合能力以及酶的催化能力,進而影響顯色效果[8-9]. 根據(jù)采用的供氫體的不同,pH對顯色效果的影響亦不同. 通過調(diào)整緩沖液兩組分的體積比,使顯色液的最終pH分別為3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5,考察以TMB作為供氫體時, pH對顯色效果的影響. 結(jié)果見圖1. 可以看出,顯色液的pH對顯色效果有顯著影響. 當(dāng)pH為4.5~5.5時顯色效果最佳,當(dāng)pH大于5.5或小于4.5時,A450 nm顯著降低.

    2.1.2 TMB質(zhì)量濃度對顯色效果的影響

    可作為HRP供氫體的有鄰苯二胺(OPD)、2,2′-聯(lián)氨-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸(ABTS)和TMB,前兩者由于具有潛在的致癌性而逐漸被TMB所替代[10]. 本研究中,采用TMB作為供氫體. 由圖2所示,隨著TMB質(zhì)量濃度的提高,吸光值先增大后降低;TMB質(zhì)量濃度為0.2 g/L時,吸光值最大,0.4 g/L時吸光值稍降,但兩者無顯著差異;0.8 g/L時吸光值顯著下降,可能原因是組分1、組分2混合后,pH升高,TMB溶解度下降,其在溶液中的分散度下降;配置TMB質(zhì)量濃度為1.6 g/L顯色液時,TMB過飽和析出.

    2.1.3 過氧化脲質(zhì)量濃度對顯色效果的影響

    HRP對受氫體的專一性很高,僅作用于H2O2、小分醇的過氧化物和尿素過氧化物,其中過氧化脲的穩(wěn)定性遠高于前兩者[5,11]. 為了獲得穩(wěn)定性更高的顯色液,保證實驗的重復(fù)性,本研究采用過氧化脲作為受氫體. 由圖3所示,隨著過氧化脲質(zhì)量濃度的提高,吸光值先增大后逐漸降低,0.2 g/L時達到最大. 可能原因是HRP以鐵卟啉為輔基,分子中含有一個Fe2+,高質(zhì)量濃度過氧化脲致部分Fe2+氧化為Fe3+,導(dǎo)致酶失活;同時,高質(zhì)量濃度過氧化脲有一定的漂白作用,導(dǎo)致吸光值降低.

    2.1.4 DMSO體積分數(shù)對顯色效果的影響

    在顯色劑的配置中,TMB的溶解度是一關(guān)鍵因素,直接影響到檢測的敏感性[10]. TMB為脂溶性,性質(zhì)穩(wěn)定,但溶解度較低,其中在DMSO中的溶解度最大(20 mg/mL),因此本研究采用DMSO作為TMB的溶劑. DMSO體積分數(shù)過低,TMB的分散效果不佳,但有機溶劑體積分數(shù)過高會降低酶活性,影響顯色效果. 由圖4所示,當(dāng)DMSO體積分數(shù)控制在8%之內(nèi)時,吸光值變化不大,超過16%時,吸光值下降明顯;DMSO體積分數(shù)為2%時,吸光值達到最大,因此本研究選取2%作為最佳DMSO體積分數(shù). 此體積分數(shù)下,TMB的溶解度良好.

    2.1.5 甘油體積分數(shù)對顯色效果的影響

    TMB對溫度敏感,儲備液需4 ℃存放,但由于DMSO在4 ℃呈固態(tài),導(dǎo)致取用不便. 本研究嘗試加入一定體積分數(shù)的甘油,使儲備液保持液體狀態(tài). 故考察了不同體積分數(shù)甘油對顯色效果的影響,見圖5. 可以看出,適當(dāng)加入一定體積分數(shù)的甘油,吸光值增大,有助于顯色反應(yīng)的進行;但甘油體積分數(shù)過高,吸光值緩慢降低,抑制顯色反應(yīng)的進行. 本著靈敏、節(jié)約原則,選取儲備液可保持穩(wěn)定液態(tài)時甘油的加入量,即0.5%.

    2.1.6 顯色時間對顯色效果的影響

    酶促反應(yīng)為一可逆過程. 隨著反應(yīng)的進行,底物TMB質(zhì)量濃度越來越低,產(chǎn)物濃度越來越高,酶促反應(yīng)速率逐漸降低. 由圖6所示,當(dāng)顯色反應(yīng)進行15 min時,底物TMB已基本消耗完畢,吸光值最大;隨著顯色時間的延長,吸光值基本保持不變.

    2.2 正交實驗

    影響HRP/TMB顯色的因素很多,本研究根據(jù)單因素試驗結(jié)果,選取了對顯色影響較大的四個因素:pH、TMB質(zhì)量濃度、過氧化脲質(zhì)量濃度和顯色時間,進行L9(34)正交試驗,考察各因素之間的交互作用. 結(jié)果見表2. 由極差分析結(jié)果可知,對顯色效果影響的主次順序為 TMB質(zhì)量濃度>過氧化脲質(zhì)量濃度>pH>顯色時間. HRP/TMB顯色體系的最佳反應(yīng)組合條件為A2B3C3D1. 此組合在表2中未出現(xiàn),正交實驗均值最高組合為A1B3C3D3. 進一步比對兩種組合下的顯色效果,A2B3C3D1組合顯色吸光值為1.501,A1B3C3D3組合顯色吸光值為1.392,兩者有顯著性差異(t=16.700 8,p<0.05),因此確定最佳顯色條件為A2B3C3D1,即pH為5.0,TMB質(zhì)量濃度為0.4 g/L,過氧化脲質(zhì)量濃度為0.4 g/L,DMSO體積分數(shù)為2%,甘油體積分數(shù)為0.5%,顯色時間為10 min.

    2.3 穩(wěn)定性試驗

    為提高實驗效率,避免每次使用前都需要現(xiàn)配組分1和組分2,本研究測定了其3個月內(nèi)顯色效果的變化情況. 為防止不同批次包被、一抗?jié)舛群兔笜?biāo)抗體稀釋度對吸光值的影響,本研究采用比吸光值代替吸光值,以提高數(shù)據(jù)的可信性. 結(jié)果見圖7. 可見,90 d后,顯色液的顯色效果呈緩慢下降趨勢;110 d后下降趨勢明顯. 120 d內(nèi),本底值穩(wěn)定在0.1以下,顯色液自發(fā)顯色不明顯. 因此,顯色液組分1和組分2,需分別存放在4 ℃冰箱中,3個月內(nèi)穩(wěn)定性良好.

    2.4 自制顯色液與市售同類產(chǎn)品對比分析

    為考察本研究制備出的HRP/TMB雙組分顯色液的質(zhì)量,本研究選購了3種市售的代表性雙組分顯色液產(chǎn)品,與本實驗自制顯色液,同時進行ELISA實驗,從靈敏度、顯色時間、本底值及穩(wěn)定性幾個方面進行對比分析. 具體結(jié)果見圖8. 從圖中可知,與市售顯色液1相比,自制顯色液靈敏度較高,顯色反應(yīng)較迅速,時間較短;與市售顯色液2相比,自制顯色液靈敏度與其相當(dāng),但比其顯色時間短;與市售顯色液3相比,自制顯色液靈敏度略低,兩者均反應(yīng)較迅速,在12 min左右,達到了顯色平臺期. 四種顯色液的本底值都比較低,其中市售顯色液3的本底值略高,但均保持在0.2以下,在顯色時間內(nèi),不影響結(jié)果. 作為商品化產(chǎn)品,3種市售顯色液的有效期均在18個月以上,穩(wěn)定性遠優(yōu)于本實驗自制的顯色液.

    表2 正交試驗結(jié)果

    實驗序號影響因素pHTMB 質(zhì)量濃度/(g/L)過氧化脲質(zhì)量濃度/(g/L)顯色時間/minA450nm111110.732212221.110313331.405421230.859522311.296623121.202731320.745832130.907933211.169k11.0820.7790.9471.066k21.1191.1041.0461.019k30.9401.2591.1491.057R0.1790.4800.2020.047

    注:k1、k2、k3為各因素同一水平下A450nm的平均值;R為各因素k1、k2、k3的極差.

    3 結(jié)論與討論

    HRP/TMB顯色過程是ELISA試驗成敗的關(guān)鍵因素. 本研究通過單因素試驗探討了pH、TMB質(zhì)量濃度、過氧化脲質(zhì)量濃度、DMSO體積分數(shù)、甘油體積分數(shù)和顯色時間對顯色效果的影響,并通過L9(34)正交實驗確定了影響顯色效果的主次順序為TMB質(zhì)量濃度>過氧化脲質(zhì)量濃度>pH>顯色時間,確定了HRP/TMB顯色體系最佳工作條件為pH為5.0,TMB質(zhì)量濃度為0.4 g/L,過氧化脲質(zhì)量濃度為0.4 g/L,DMSO體積分數(shù)為2%,甘油體積分數(shù)為0.5%,顯色時間為10 min. 在不添加保護劑的情況下,4 ℃儲藏,可穩(wěn)定3個月左右.

    與3種市售同類產(chǎn)品對比,自制的顯色液在靈敏度、顯色時間方面均較好,但穩(wěn)定性要遠低于商品化的產(chǎn)品. 目前,本實驗研制的HRP/TMB雙組分顯色液能夠滿足絕大多數(shù)的實驗室ELISA研究,但尚不能滿足商品化銷售對保質(zhì)期的要求. 后續(xù),可嘗試通過添加聚乙烯吡咯烷酮、曲拉通X-405等穩(wěn)定劑,進一步延長顯色液保質(zhì)期,擴大其應(yīng)用范圍[12-13].

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