血清EGFL7、MTA1表達與鼻咽癌患者臨床特征及預后的關(guān)系

馮睡 尹金淑 謝洪 姬巍 劉艾竹 彭洪

鼻咽癌為發(fā)生于鼻咽腔側(cè)壁和頂部的一種高發(fā)性惡性腫瘤，其發(fā)病率在耳鼻咽喉各類惡性腫瘤中居于首位。鼻咽癌的發(fā)生發(fā)展與飲食習慣、遺傳易感性、環(huán)境、理化因素、EB 病毒感染等因素有關(guān)，并且是一個多步驟、多基因參與的復雜過程[1]。鼻咽癌侵襲轉(zhuǎn)移是患者預后不佳乃至死亡的主要因素，多數(shù)轉(zhuǎn)移為頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。表皮生長因子樣結(jié) 構(gòu) 域7（epidermal growth factor-likedomain 7，EGFL7）表達于血管內(nèi)皮系統(tǒng)，在生理或病理性血管管腔形成、功能維持等過程中發(fā)揮重要作用，近年來研究發(fā)現(xiàn)EGFL7 在一些腫瘤細胞中也有表達[2-3]。腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)基因（metastasis-associated gene1，MTA1）為近年來研究較多的與腫瘤浸潤轉(zhuǎn)移相關(guān)的基因，其在多種腫瘤細胞系中表達，并與腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移關(guān)系密切[4-5]。針對鼻咽癌缺乏特異性、敏感性高的標志物的情況，本研究對鼻咽癌患者血清EGFL7、MTA1表達情況和與患者臨床特征及預后的進行了探究，以期為鼻咽癌患者的臨床診療及預后評估提供有效指示指標。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取本院2014年1月至2016年1月收治的鼻咽癌患者病理組織60例，其中男37例，女23例，平均（52.6±3.7）歲，病理分期：Ⅰ期4例，Ⅱ期17例，Ⅲ期28例，Ⅳ期11例；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移：無38例，有22例；浸潤深度：T1～226例，T3～434例；分化程度：低11例，中29例，高20例；EB 病毒相關(guān)抗體陰性24例，陽性36例。根據(jù)鼻咽癌患者是否存在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，分為轉(zhuǎn)移組和未轉(zhuǎn)移組，并以同期20例正常鼻咽部組織作為對照組，其中男12例，女8例，平均（51.5±4.4）歲。

納入標準：①均經(jīng)病理學檢查確診；②均為首次確診，未接受放化療或其他抗腫瘤治療；③卡氏功能評分（Karnofsky，KPS）≥70 分。排除標準：①肝腎等重要臟器嚴重功能障礙者；②合并其他惡性腫瘤病史；所有患者及家屬均已簽署知情同意書；本研究上報院倫理委員會并獲得批準。③神經(jīng)病變、認知障礙者；④臨床資料缺失者。3組研究對象在性別、年齡上比較差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05），具有可比性。

1.2 方法

1.2.1 臨床資料收集

所有患者入院后統(tǒng)計年齡、性別、疾病史、病理分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、浸潤深度、EB 病毒相關(guān)抗體等臨床資料。預后統(tǒng)計：所有患者隨訪3～6年，直至患者任何原因?qū)е滤劳龌螂S訪日期結(jié)束，觀察患者預后生存情況，并計算中位生存時間（median survival time，MST）。

1.2.2 血清EGFL7、MTA1蛋白表達檢測

所有研究對象均入院后收集5 mL 空腹靜脈血，采用酶聯(lián)免疫吸附法（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）及北京普朗酶標儀測定血清EGFL7、MTA1蛋白表達，450 nm 波長測定吸光度值。試劑盒購自Abcam公司，嚴格依照試劑盒說明書執(zhí)行各項操作。

1.2.3 微血管密度（MVD）、淋巴管密度（LVD）水平測定

取鼻咽部組織行免疫組化染色測定MVD及LVD，于200倍顯微鏡下隨機選取5個視野進行計數(shù)血管數(shù)和淋巴管數(shù)，取平均值作為MVD、LVD的最終結(jié)果。

1.3 統(tǒng)計學分析

采用SPSS 19.0軟件進行數(shù)據(jù)分析，計數(shù)資料用n表示，行χ2檢驗。計量資料以（）表示，兩兩比較采用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析；Spearman 檢驗分析血清EGFL7、MTA1蛋白與MVD、LVD 相關(guān)性；Kaplan-meier 生存函數(shù)分析EGFL7、MTA1 與患者預后的關(guān)系。P<0.05 為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 3組EGFL7、MTA1、MVD、LVD 水平比較

3組血清EGFL7、MTA1、MVD、LVD 比較：對照組＜未轉(zhuǎn)移組＜轉(zhuǎn)移組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見表1。

2.2 血清EGFL7、MTA1表達與鼻咽癌患者臨床特征的關(guān)系

不同性別、年齡、EB 病毒相關(guān)抗體陰陽性血清EGFL7、MTA1蛋白水平比較差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）；不同TNM 腫瘤分期、有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、浸潤深度、分化程度患者血清EGFL7、MTA1蛋白水平比較差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。見表2。

表1 各組EGFL7、MTA1、MVD、LVD 水平比較（±s）Table1 Comparison of EGFL7，MTA1，MVD，and LVD levels in each group（±s）

表1 各組EGFL7、MTA1、MVD、LVD 水平比較（±s）Table1 Comparison of EGFL7，MTA1，MVD，and LVD levels in each group（±s）

注：與對照組比較，aP＜0.05；與未轉(zhuǎn)移組比較，bP＜0.05。

組別對照組未轉(zhuǎn)移組轉(zhuǎn)移組F值P值n 20 38 22 EGFL7（ng/mL）44.8±5.8 178.6±15.7a 273.2±25.1ab 61.379 0.000 MTA1（pg/mL）28.3±3.9 145.5±11.6a 213.5±19.3ab 60.758 0.000 MVD 17.5±5.8 59.2±8.7a 82.2±8.6ab 39.454 0.000 LVD 2.4±1.2 4.4±1.5a 12.8±3.7ab 12.448 0.000

表2 血清EGFL7、MTA1表達與鼻咽癌患者臨床特征的關(guān)系[n（%），（±s）]Table2 Relationship between serum EGFL7 and MTA1 expression and clinical characteristics of patients with nasopharyngeal carcinoma[n（%），（±s）]

表2 血清EGFL7、MTA1表達與鼻咽癌患者臨床特征的關(guān)系[n（%），（±s）]Table2 Relationship between serum EGFL7 and MTA1 expression and clinical characteristics of patients with nasopharyngeal carcinoma[n（%），（±s）]

注：t1、P1為EGFL7 統(tǒng)計學分析值，t2、P2為MTA1 統(tǒng)計學分析值。

臨床特征性別年齡EB 病毒相關(guān)抗體TNM 分期淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移浸潤深度分化程度男女＞45≤45陽性陰性Ⅰ～ⅡⅢ～Ⅳ無有T1～2 T3～4低中高n=60 37（61.67）23（38.33）45（75.00）15（25.00）36（60.00）24（40.00）22（36.67）38（63.33）38（63.33）22（36.67）26（43.33）34（56.67）11（18.33）49（81.67）EGFL7（ng/mL）235.6±18.8 237.9±15.3 235.9±17.5 238.2±16.2 239.6±19.7 236.4±16.6 144.5±15.4 270.3±19.1 178.6±15.7 273.2±25.1 185.7±16.6 272.2±19.9 120.6±14.1 282.3±20.3 MTA1（pg/mL）179.3±16.4 178.2±15.3 177.6±18.4 179.5±19.0 181.5±22.8 177.4±16.2 103.2±14.9 213.2±18.7 145.5±11.6 213.5±19.3 162.7±15.4 218.2±18.7 114.5±13.3 219.5±16.0 t1值0.493 0.449 0.655 26.308 15.962 17.899 25.017 P1值0.624 0.655 0.515 0.000 0.000 0.000 0.000 t2值0.259 0.344 0.761 23.570 15.029 12.275 20.215 P2值0.797 0.732 0.450 0.000 0.000 0.000 0.000

2.3 血清EGFL7、MTA1表達與MVD、LVD 的相關(guān)性

相關(guān)性分析結(jié)果顯示，EGFL7及MTA 蛋白分別與MVD、LVD 存在顯著正相關(guān)性，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。見表3。

表3 血清EGFL7、MTA1表達與MVD、LVD 的相關(guān)性Table3 Correlation of serum EGFL7 and MTA1 expression with MVD and LVD

2.4 血清EGFL7、MTA1表達與鼻咽癌患者預后的關(guān)系

以鼻咽癌患者血清EGFL7、MTA1 平均值為中位數(shù)，分為低EGFL7 組、高EGFL7 組及低MTA1 組、高MTA1 組，Kaplan-meier 生存函數(shù)結(jié)果顯示，低EGFL7 組的MST 為高于高EGFL7 組的MST，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。低MTA1 組MST 高于高MTA1 組的MST，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。見圖1。

3 討論

鼻咽癌為上皮源性惡性腫瘤，主要為黏膜上皮鱗狀上皮化生基礎(chǔ)上形成的癌變，病變區(qū)域存在豐富的淋巴組織。腫瘤細胞早期汲取營養(yǎng)主要途徑為被動擴散，隨著腫瘤生長，血液運輸營養(yǎng)物質(zhì)占據(jù)主導地位[6]。因此，新生血管的形成是腫瘤細胞增殖、浸潤及轉(zhuǎn)移的必要條件。EGFL7 為新發(fā)現(xiàn)的一種分泌型蛋白，其主要包含兩個進化中高度保守的表皮生長因子樣結(jié)構(gòu)域，研究證實[7]EGFL7 在胚胎血管發(fā)育中發(fā)揮重要作用。近年來研究表明[8-9]，EGFL7 可增強內(nèi)皮細胞和成纖維細胞的運動遷移能力，其在成熟組織中表達極低，但在腫瘤等增殖性組織中存在高表達。本研究中，鼻咽癌患者血清EGFL7 水平明顯升高，且在存在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的鼻咽癌患者中EGFL7 水平更高。提示，EGFL7 表達水平升高與鼻咽癌疾病進展及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移存在密切關(guān)系。另有研究指出[10]，EGFL7 可通過活化FAK 信號通路促進腫瘤細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移，抑制EGFL7 可降低腫瘤細胞的遷移運動。

MTA1基因為腫瘤轉(zhuǎn)移有關(guān)基因家族的一員，在正常組織中MTA1表達水平極低，但在多種癌組織中呈高表達，并與惡性腫瘤的組織浸潤、侵襲轉(zhuǎn)移關(guān)系密切[11]。本研究結(jié)果提示，MTA1 在鼻咽癌細胞侵襲、轉(zhuǎn)移過程中具有關(guān)鍵作用。本研究結(jié)果顯示，不同TNM 腫瘤分期、有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、浸潤深度、分化程度患者血清EGFL7、MTA1蛋白水平血清EGFL7、MTA1 存在顯著差異，且隨著腫瘤進展，血清EGFL7、MTA1蛋白水平隨之升高。本研究中，血清EGFL7、MTA1 與患者MVD、LVD 存在正相關(guān)性。提示，血清EGFL7、MTA1對鼻咽癌患者血管、淋巴結(jié)具有雙重作用。侵襲轉(zhuǎn)移是惡性腫瘤細胞的主要生物學特征之一，也是影響患者預后的主要影響因素。腫瘤內(nèi)皮細胞分泌的EGFL7 蛋白從原發(fā)灶滲入血流，導致血清EGFL7 水平升高，EGFL7 蛋白從血液中捕獲腫瘤細胞并促進其侵襲新的組織器官，從而導致轉(zhuǎn)移性病灶的形成。同時，EGFL7 蛋白本身可刺激腫瘤細胞的運動遷移能力，參與了腫瘤原發(fā)灶向周圍正常組織的侵襲轉(zhuǎn)移[12-13]。MTA1蛋白含有1個鋅指DNA 結(jié)合域及許多SPXX 域，這些結(jié)構(gòu)參與了細胞生長、分化的信號傳導途徑的調(diào)控，因此MTA1蛋白水平升高促進了腫瘤的分化，促進其惡性程度增加和侵襲轉(zhuǎn)移[14-15]。

綜上所述，血清EGFL7、MTA1表達水平與鼻咽癌患者臨床分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移存在密切關(guān)系，血清EGFL7、MTA1 高表達鼻咽癌患者預后較差。