滑膜組織Galectin-3、BMP-2蛋白在骨關(guān)節(jié)炎患者中的表達及臨床價值

趙麗莉 高宇 梁涢 羅毅

骨關(guān)節(jié)炎（Osteoarthritis，OA）是一種滑膜關(guān)節(jié)退行性疾病，在病程中滑膜組織可通過分泌致炎因子，造成軟骨下骨硬化、關(guān)節(jié)軟骨丟失、疼痛等，影響關(guān)節(jié)正常功能，致殘率較高，嚴重降低患者生活質(zhì)量，因此加強對OA 的研究具有重要意義[1]。半乳糖凝集素3（Galectin-3）可調(diào)控細胞生長、凋亡等，在人工椎間盤病變患者標本中可檢測到陽性表達，與椎間盤退變有關(guān)，并具有體外誘導炎癥因子表達的功能，故推測其可能與OA 有關(guān)[2]。骨形成蛋白-2（Bone morphogenetic protein-2，BMP-2）能促進成骨細胞分化，加速前十字韌帶重建后的骨愈合，但在OA 中的研究較少[3]。本研究探究滑膜組織Galectin-3、BMP-2 在OA患者中的表達及臨床價值，報告如下。

1 資料和方法

1.1 主要試劑

兔抗人Galectin-3 單克隆一抗、生物素化的二抗（美國Santa Cruz公司）；兔抗人BMP-2 單克隆一抗、生物素化的二抗（北京百奧萊博科技有限公司）；DAB 顯色劑（上海信裕生物科技有限公司）。

1.2 一般資料

選取本院2017年6月至2019年8月收治的OA患者126例作為觀察組，另選取同期因膝關(guān)節(jié)韌帶損傷或半月板損傷行關(guān)節(jié)鏡診治術(shù)患者124例作為對照組。兩組性別、年齡、體質(zhì)量指數(shù)、患病側(cè)、飲酒史、吸煙史、合并疾病等資料比較，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05），但有可比性。

納入標準：①OA組均符合OA 診斷標準[4]；②臨床資料完整；③無認知、精神障礙；④單側(cè)病變者；⑤所有患者及家屬均已簽署知情同意書。排除標準：①合并系統(tǒng)性紅斑狼瘡者；②伴有血液系統(tǒng)疾病者；③存在惡性腫瘤者；④合并嚴重凝血功能障礙者；⑤伴有急性感染類疾病者。根據(jù)WOMAC 骨關(guān)節(jié)炎指數(shù)[5]評估判斷病情程度研究經(jīng)本院倫理委員會同意批準。

表1 兩組臨床資料對比[n（%），（±s）]Table1 Comparison of clinical data between the 2 groups[n（%），（±s）]

表1 兩組臨床資料對比[n（%），（±s）]Table1 Comparison of clinical data between the 2 groups[n（%），（±s）]

資料年齡(歲)性別（男/女）體質(zhì)量指數(shù)（kg/m2）患病側(cè)左側(cè)右側(cè)飲酒史吸煙史合并疾病高脂血癥糖尿病心臟病高血壓觀察組（n=126）55.49±4.10 66/60 22.25±1.79 58（46.03）68（53.97）57（45.24）51（40.48）20（15.87）9（7.14）5（3.97）6（4.76）對照組（n=124）55.18±4.42 59/65 22.31±1.73 63（50.81）61（49.19）52（41.94）56（45.16）16（12.90）11（8.87）3（2.42）4（3.23）t/χ2值0.575 0.576 0.269 0.571 0.277 0.560 0.447 0.254 0.113 0.088 P值0.566 0.448 0.788 0.450 0.599 0.454 0.504 0.615 0.737 0.767

1.3 方法

1.3.1 滑膜組織Galectin-3、BMP-2表達

采用免疫組化染色法檢測，滑膜組織標本固定，脫水，包埋，連續(xù)切片，60℃恒溫箱中烤片過夜，脫臘至水。3%雙氧水沖洗載玻片，PBS 液沖洗3次×5 min，復合酶37℃修復標本10 min，按照1∶100 比例滴加兔抗人Galectin-3、BMP-2 單克隆一抗，37℃濕盒孵育1.5 h，室溫下復溫0.5 h，PBS沖洗3次×5 min。滴加生物素化的二抗，室溫靜置0.5 h，PBS 洗3次×5 min。滴加DAB 顯色劑顯色5 min，蘇木精復染，脫水透明，中性樹膠封片。顯微鏡下觀察，細胞膜、細胞核或細胞質(zhì)有棕色顆粒附著為陽性，僅有片狀、黃染或無顆粒附著為陰性，通過IMage-Pro Plus6.0軟件分析，200倍鏡下隨機選取5個視野，滑膜組織Galectin-3、BMP-2陽性表達率為滑膜組織陽性染色面積占視野下組織總面積的平均光密度。

1.3.2 關(guān)節(jié)液炎癥標記物檢測

嚴格無菌操作，抽取患膝關(guān)節(jié)液1 mL，3 000 r/min 離心10 min 采用酶聯(lián)免疫吸附法檢測上清白介素-6（Interleukin-6，IL-6）、白介素-8（Interleukin-8，IL-8）、腫瘤壞死因子-α（Tumor necrosis factor，TNF-α）表達，IL-6試劑盒購于艾美捷科技有限公司，IL-8 購于武漢賽培生物科技有限公司，TNF-α購于齊一生物科技（上海）有限公司。

1.4 觀察指標

①比較兩組滑膜組織Galectin-3、BMP-2 水平/濃度的差異。②分析滑膜組織Galectin-3、BMP-2與OA 診斷的關(guān)系。③比較不同OA 嚴重程度患者滑膜組織Galectin-3、BMP-2表達。④比較不同OA 嚴重程度患者關(guān)節(jié)液炎癥標記物（IL-6、IL-8、TNF-α）水平。⑤分析滑膜組織Galectin-3、BMP-2與關(guān)節(jié)液炎癥標記物相關(guān)性。

1.5 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 22.0軟件進行數(shù)據(jù)處理，計數(shù)資料用n（%）表示、χ2檢驗，計量資料以（）表示，多組間比較以單因素方差分析，兩兩比較以LSD-t 檢驗，采用Logistic 分析滑膜組織Galectin-3、BMP-2與OA 發(fā)病的關(guān)系，采用Pearson 分析滑膜組織Galectin-3、BMP-2 與關(guān)節(jié)液炎癥標記物相關(guān)性。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組滑膜組織Galectin-3、BMP-2陽性表達率比較

觀察組滑膜組織Galectin-3、BMP-2陽性表達率高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見表2、圖1。

2.2 滑膜組織Galectin-3、BMP-2與OA發(fā)病的關(guān)系

Logistic回歸分析顯示，滑膜組織Galectin-3、BMP-2 與OA 診斷顯著相關(guān)，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見表3。

表2 兩組滑膜組織Galectin-3、BMP-2 比較（±s）Table2 Comparison of Galectin-3 and BMP-2 in 2 groups of synovial tissues（±s）

表2 兩組滑膜組織Galectin-3、BMP-2 比較（±s）Table2 Comparison of Galectin-3 and BMP-2 in 2 groups of synovial tissues（±s）

組別觀察組對照組t值P值n 126 124 Galectin-3（%）42.47±6.78 5.82±1.39 58.985＜0.001 BMP-2（%）28.63±5.26 8.72±2.14 39.086＜0.001

表3 滑膜組織Galectin-3、BMP-2 與OA 發(fā)病的關(guān)系Table3 Relationship between galectin-3，BMP-2 and the incidence of OA in synovial tissue

2.3 不同OA 嚴重程度患者滑膜組織Galectin-3、BMP-2 的比較

滑膜組織Galectin-3、BMP-2陽性表達率隨病情程度增加呈升高趨勢，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見表4。

2.4 不同OA 嚴重程度患者關(guān)節(jié)液炎癥標記物

關(guān)節(jié)液IL-6、IL-8、TNF-α 水平隨病情程度增加呈升高趨勢，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見表5。

2.5 滑膜組織Galectin-3、BMP-2 與關(guān)節(jié)液炎癥標記物相關(guān)性

Pearson 相關(guān)性分析，滑膜組織Galectin-3 與關(guān)節(jié)液IL-6（r=0.515）、IL-8（r=0.635）、TNF-α（r=0.620）呈正相關(guān)，滑膜組織BMP-2 與關(guān)節(jié)液IL-6（r=0.602）、IL-8（r=0.499）、TNF-α（r=0.634）呈正相關(guān)，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見圖2。

表4 不同病情程度患者滑膜組織Galectin-3、BMP-2比較（±s）Table4 Comparison of Galectin-3 and BMP-2 in synovial tissues of patients with different levels of disease（±s）

表4 不同病情程度患者滑膜組織Galectin-3、BMP-2比較（±s）Table4 Comparison of Galectin-3 and BMP-2 in synovial tissues of patients with different levels of disease（±s）

組別輕度患者中度患者重度患者F值P值n 38 56 32 Galectin-3（%）31.77±5.83 42.08±6.29 55.86±7.10 124.278＜0.001 BMP-2（%）20.05±4.16 27.44±5.27 40.90±6.74 132.326＜0.001

表5 不同病情程度患者關(guān)節(jié)液炎癥標記物比較（±s）Table5 Comparison of synovial inflammation markers in patients with different disease levels（±s）

表5 不同病情程度患者關(guān)節(jié)液炎癥標記物比較（±s）Table5 Comparison of synovial inflammation markers in patients with different disease levels（±s）

組別輕度患者中度患者重度患者F值P值n 38 56 32 IL-6（ng/L）13.15±3.82 35.94±10.20 61.08±16.33 169.027＜0.001 IL-8（ng/L）6.01±1.80 9.53±3.04 14.29±4.11 63.706＜0.001 TNF-α（ng/L）0.52±0.20 1.23±0.57 2.14±0.68 83.291＜0.001

3 討論

目前普遍認為，OA是一種由滑膜、軟骨、骨等參與的炎癥性疾病，其炎癥通路是由IL-6、IL-8、TNF-α 等多種細胞因子參與的，各炎癥因子水平被證實與OA患者病情有關(guān)，能持續(xù)刺激滑膜、軟骨等，造成組織損傷，并誘導成纖維細胞、基質(zhì)金屬蛋白酶分泌，導致滑膜增生、邊緣骨贅形成、關(guān)節(jié)間隙變窄等，從而誘發(fā)OA[6-7]。

Galectin-3是半乳糖凝集素家族中一個結(jié)構(gòu)獨特的成員，在多種組織中均有表達[8]。抑制Galectin-3 表達能明顯下調(diào)基質(zhì)金屬蛋白酶3 表達，抑制核因子-κB 信號通路，減輕脂多糖誘導的軟骨細胞炎癥損傷，呈現(xiàn)出軟骨保護特性[9]。本研究顯示，OA患者滑膜組織Galectin-3 表達高于因膝關(guān)節(jié)韌帶損傷或半月板損傷行關(guān)節(jié)鏡診治術(shù)患者，與OA診斷顯著相關(guān)，并隨病情嚴重程度增加呈升高趨勢。分析其原因，Galectin-3 可刺激成纖維細胞生長，被激活的成纖維細胞可附著于骨組織和軟骨，逐漸破壞關(guān)節(jié)結(jié)構(gòu)，并介導細胞黏附、白細胞趨化，參與炎癥反應、組織纖維化，造成關(guān)節(jié)損傷，故在OA 中高表達，與OA 發(fā)病及患者病情有關(guān)[10-11]。Weinmann 等[12]報道顯示，Galectin-3 可誘導人骨關(guān)節(jié)炎中的IL-6、TNF-α 等，是OA 進展的分子開關(guān)，支持本研究中滑膜組織Galectin-3 與關(guān)節(jié)液IL-6、IL-8、TNF-α 呈正相關(guān)的觀點，佐證了Galectin-3 能通過炎癥因子參與OA 的發(fā)病?？梢姀幕蛩桨邢騁alectin-3，沉默或抑制Galectin-3 表達，可能有助于改善OA 的炎癥反應情況，緩解或控制OA 病情，但這一結(jié)論仍需更多研究的論證。

BMP-2是驅(qū)動成骨細胞分化和活性的必不可少的生長因子，對骨形成至關(guān)重要[13]。本研究顯示，OA患者滑膜組織BMP-2表達高于因膝關(guān)節(jié)韌帶損傷或半月板損傷行關(guān)節(jié)鏡診治術(shù)患者，與OA發(fā)病顯著相關(guān)，與Weidner 等[14]報道相似，可能是由于OA 滑膜組織的炎癥反應刺激及退行性變化，導致BMP-2 升高，進而參與關(guān)節(jié)軟骨的修復。且本研究還發(fā)現(xiàn)，滑膜組織BMP-2陽性表達率隨病情程度增加呈升高趨勢，表明BMP-2 與OA患者病情有關(guān)，推測病情越嚴重，軟骨破壞可能更明顯，機體為修復軟骨產(chǎn)生適應性或應激性變化更大，分泌更多的BMP-2，以發(fā)揮修復作用[15]。同時滑膜組織BMP-2 與IL-6、IL-8、TNF-α 呈正相關(guān)，這一現(xiàn)象是由于OA 局部的激烈炎癥反應可能通過細胞因子網(wǎng)絡系統(tǒng)啟動了滑膜組織的成骨性能，從而使BMP-2 與促炎因子呈現(xiàn)出正相關(guān)變化[16]。而根據(jù)以往報道，IL-6、IL-8、TNF-α 均與OA 臨床癥狀嚴重程度、關(guān)節(jié)功能顯著相關(guān)，佐證了Galectin-3、BMP-2 與OA 發(fā)病和病情有關(guān)[17]。提示治療OA 時，不僅應重視關(guān)節(jié)炎癥反應的控制，亦應從軟骨修復等角度干預，雙管齊下，可能有助于提高臨床治療效果。

綜上所述，滑膜組織Galectin-3、BMP-2 在OA患者中呈高表達，與OA 的發(fā)病和病情嚴重程度顯著相關(guān)，并與關(guān)節(jié)液炎癥因子表達呈正相關(guān)，提示檢測滑膜組織Galectin-3、BMP-2 可輔助OA及其嚴重程度的診斷和預后的判斷。