miR-148a-3p靶向DLL4基因影響嬰幼兒血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞增殖和凋亡

李海燕 李凡

嬰幼兒血管瘤（Infant hemangioma，IH）是一類以血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖為特征的胚胎性良性腫瘤，約占先天性皮膚血管病變的80%，多見(jiàn)于早產(chǎn)兒和低出生體重兒[1]。雖然是一種良性腫瘤，但由于多生長(zhǎng)于面部，往往影響患者身心健康，嚴(yán)重時(shí)也會(huì)導(dǎo)致面部畸形，甚至危及生命[2]。然而，目前缺乏理想的治療方法。微小RNA（microRNA，miRNA）是一類約為22個(gè)核苷酸的非編碼RNA，其通過(guò)與靶mRNA 特異性結(jié)合抑制翻譯或促進(jìn)降解參與細(xì)胞增殖、凋亡等多種過(guò)程，是腫瘤的潛在治療靶點(diǎn)[3-4]。miR-148a-3p是近年發(fā)現(xiàn)的抑癌基因，非小細(xì)胞肺癌組織中miR-148a-3p 表達(dá)降低，過(guò)表達(dá)miR-148a-3p 可降低癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力[5]。過(guò)表達(dá)miR-148a-3p 還可抑制食管癌細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[6]。生物信息學(xué)分析顯示，（Delta-like ligand 4，DLL4）是miR-148a-3p 的潛在靶基因。DLL4 已被證實(shí)在DLL4 在增生期IH 組織中高表達(dá)并促進(jìn)IH 內(nèi)皮細(xì)胞的增殖[7]。然而，miR-148a-3p是否靶向DLL4 參與IH 進(jìn)展尚未可知。本研究以DLL4 為切入點(diǎn)，探討miR-148a-3p 對(duì)IH內(nèi)皮細(xì)胞增殖和凋亡的影響及其潛在機(jī)制，以期為IH 臨床治療提供有效靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

收集2016年1月至2019年3月于本院確診的120例增殖期IH 組織標(biāo)本。其中男孩52例，女孩68例，年齡中位數(shù)為7個(gè)月。所有樣本均經(jīng)我院病理科分析證實(shí)。所有患者及家屬均已簽署知情同意書，并獲得我院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

M199 培養(yǎng)液購(gòu)于上海鈺博生物；SYBR Green Master Mix 購(gòu)于大連Takara公司；miR-148a-3p 模擬物、抑制物、DLL4 過(guò)表達(dá)質(zhì)粒及其相應(yīng)對(duì)照由上海生工公司提供；四甲基偶氮唑藍(lán)（methyl thiazolyl tetrazolium，MTT）、膜聯(lián)蛋白-異硫氰酸熒光素/碘化丙啶（Annexin V-FITC/PI）細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)于上海碧云天公司；兔源DLL4 抗體、細(xì)胞周期素D1（CyclinD1）抗體、P21 抗體、B細(xì)胞淋巴瘤-2（B cell lymphoma-2，Bcl-2）抗體、Bcl相關(guān)X 蛋白（Bcl-associated X protein，Bax）抗體、磷酸甘油醛脫氫酶（glyceraldehyde phosphate dehydrogenase，GAPDH）抗體，山羊抗兔IgG 二抗購(gòu)于上海賽信通公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

參照侯團(tuán)結(jié)等[8]的方法分離血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞。采用M199 培養(yǎng)液于37℃，5% CO2，飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞，每隔1 天換液一次，30 d 后長(zhǎng)成單層細(xì)胞，鋪滿瓶底后進(jìn)行消化和傳代。

1.3 RT-qPCR 檢測(cè)

TRIzol試劑提取血管瘤組織、正常皮膚組織、各組細(xì)胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，利用SYBR Green Master Mix試劑配制PCR反應(yīng)體系，2-ΔΔCt法分析miR-148a-3p（內(nèi)參為U6）、DLL4mRNA（內(nèi)參為GAPDH）表達(dá)水平。

1.4 細(xì)胞轉(zhuǎn)染

接種血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞至96 孔板，當(dāng)細(xì)胞匯合度達(dá)到80%時(shí)，利用lipofectamine 2000 分別轉(zhuǎn)染miR-148a-3p mimics、miR-NC、si-NC、si-DLL4、miR-148a-3p mimics+pcDNA、miR-148a-3p mimics+pcDNA-DLL4至血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞，轉(zhuǎn)染48 h 檢測(cè)轉(zhuǎn)染效果后進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。

1.5 MTT 法檢測(cè)細(xì)胞活力

取3×103個(gè)細(xì)胞接種到96 孔板，24、48、72 h 時(shí)每孔加入20 μL 的MTT試劑，37℃孵育4 h 后，吸出培養(yǎng)基，每孔加入150 μL 的二甲基亞砜，震蕩溶解后酶標(biāo)儀檢測(cè)490 nm 處各孔的吸光度值。

1.6 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡

預(yù)冷的磷酸鹽緩沖液洗滌細(xì)胞2次，并懸浮于100 μL 的1×結(jié)合緩沖液中。分別加入5 μL 的Annexin V-FITC、PI 染色，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。

1.7 Western blot 檢測(cè)蛋白表達(dá)

提取細(xì)胞蛋白后進(jìn)行蛋白定量。取適量蛋白樣品，按照聚丙烯酰胺凝膠；轉(zhuǎn)膜；膜的封閉；一抗孵育；二抗孵育；化學(xué)發(fā)光顯色；灰度值分析步驟進(jìn)行。

1.8 雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)

含有miR-148a-3p 結(jié)合位點(diǎn)序列或突變序列的的3′-UTR-DLL4 的的野生型或突變型（WT 或MUT-DLL4）熒光素酶報(bào)告載體由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司提供。WT/MUT-DLL4 分別與miR-148a-3p mimics 或miR-NC 轉(zhuǎn)染血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞，48 h 時(shí)檢測(cè)各組細(xì)胞熒光素酶活性。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 20.0 進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)數(shù)資料用n表示，計(jì)量資料用（）表示。兩組間比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用SNK-q 檢驗(yàn)。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 miR-148a-3p和DLL4 在血管瘤組織中的表達(dá)

血管瘤組織中miR-148a-3p 的表達(dá)較正常皮膚組織降低，DLL4mRNA和DLL4 蛋白的表達(dá)較正常組織增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見(jiàn)圖1和表1。

2.2 miR-148a-3p 過(guò)表達(dá)對(duì)血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞增殖和凋亡的影響

與miR-NC組比較，miR-148a-3p 組血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞miR-148a-3p 表達(dá)顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。過(guò)表達(dá)miR-148a-3p 后血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞24～72 h 細(xì)胞活力、CyclinD1和Bcl-2蛋白表達(dá)顯著降低，凋亡率、p21和Bax 蛋白表達(dá)增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見(jiàn)表2。

2.3 抑制DLL4表達(dá)對(duì)血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞增殖和凋亡的影響

表1 miR-148a-3p和DLL4 在血管瘤組織中的表達(dá)（±s）Table1 Expression of miR-148a-3p and DLL4 in hemangioma tissue（±s）

表1 miR-148a-3p和DLL4 在血管瘤組織中的表達(dá)（±s）Table1 Expression of miR-148a-3p and DLL4 in hemangioma tissue（±s）

分組正常皮膚組織組血管瘤組織組t值P值n 120 120--miR-148a 3p 1.00±0.07 0.52±0.05 61.125 0.000 DLL4 mRNA 1.00±0.08 3.25±0.31 76.986 0.000 DLL4蛋白0.21±0.02 0.59±0.05 77.299 0.000

與si-NC組比較，si-DLL4組血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞DLL4 蛋白表達(dá)顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。抑制DLL4表達(dá)后血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞24～72 h細(xì)胞活力、CyclinD1和Bcl-2蛋白表達(dá)顯著降低，凋亡率、p21和Bax 蛋白表達(dá)增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見(jiàn)表3。

表2 miR-148a-3p 過(guò)表達(dá)對(duì)血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞增殖和凋亡的影響（±s）Table2 Effects of overexpressing miR-148a-3p on proliferation and apoptosis of hemangioendothelial cells（±s）

表2 miR-148a-3p 過(guò)表達(dá)對(duì)血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞增殖和凋亡的影響（±s）Table2 Effects of overexpressing miR-148a-3p on proliferation and apoptosis of hemangioendothelial cells（±s）

分組miR-NC組miR-148a-3p 組t值P值miR-148a-3p 1.00±0.08 2.93±0.28 19.883 0.000 OD值（490 nm）24 h 0.37±0.03 0.32±0.03 3.536 0.003 48 h 0.72±0.07 0.43±0.04 10.791 0.000 72 h 1.12±0.09 0.62±0.06 13.868 0.000凋亡率（%）8.36±0.83 22.14±2.21 17.512 0.000 CyclinD1蛋白0.68±0.06 0.22±0.02 21.820 0.000 p21蛋白0.18±0.02 0.57±0.05 21.726 0.000 Bcl-2蛋白0.77±0.07 0.30±0.03 18.514 0.000 Bax蛋白0.27±0.03 0.62±0.06 15.652 0.000

表3 抑制DLL4表達(dá)對(duì)血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞增殖和凋亡的影響（±s）Table3 Effect of inhibiting DLL4 on proliferation and apoptosis of hemangioendothelial cells（±s）

表3 抑制DLL4表達(dá)對(duì)血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞增殖和凋亡的影響（±s）Table3 Effect of inhibiting DLL4 on proliferation and apoptosis of hemangioendothelial cells（±s）

分組si-NC組si-DLL4組t值P值DLL4 蛋白0.63±0.06 0.25±0.03 16.994 0.000 OD值（490 nm）24 h 0.39±0.03 0.37±0.03 1.414 0.176 48 h 0.75±0.07 0.51±0.05 8.370 0.000 72 h 1.14±0.09 0.69±0.06 12.481 0.000凋亡率（%）7.56±0.71 19.47±1.56 20.846 0.000 CyclinD1蛋白0.69±0.06 0.28±0.03 18.336 0.000 p21 蛋白0.19±0.02 0.54±0.05 19.498 0.000 Bcl-2蛋白0.79±0.07 0.36±0.03 16.939 0.000 Bax 蛋白0.24±0.03 0.60±0.06 16.100 0.000

2.4 miR-148a-3p靶向調(diào)控DLL4 的表達(dá)

TargetScan在線預(yù)測(cè)顯示，miR-148a-3p 與DLL4 的3′-UTR 區(qū)域存在互補(bǔ)核苷酸序列，見(jiàn)圖2。雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)顯示，與轉(zhuǎn)染miR-NC 比較，轉(zhuǎn)染miR-148a-3p mimics 可降低WT-DLL4 的熒光素酶活性，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），而對(duì)MUT-DLL4 的熒光素酶活性無(wú)顯著影響，見(jiàn)表4。Western blot 檢測(cè)顯示，miR-148a-3p 組血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞DLL4 蛋白表達(dá)較miR-NC組降低；anti-miR-148a-3p 組血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞DLL4 蛋白表達(dá)較antimiR-NC組升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)表5和圖3。

表4 雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)（±s）Table4 Double luciferase report experiments（±s）

表4 雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)（±s）Table4 Double luciferase report experiments（±s）

分組miR-NC組miR-148a-3p 組t值P值WT-DLL4 1.02±0.06 0.49±0.04 22.049 0.000 MUT-DLL4 1.04±0.08 1.01±0.07 0.847 0.410

2.5 DLL4 過(guò)表達(dá)逆轉(zhuǎn)miR-148a-3p 對(duì)血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞增殖和凋亡的作用

與miR-NC組比較，miR-148a-3p 組血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞24～72 h 細(xì)胞活力、DLL4、CyclinD1和Bcl-2蛋白表達(dá)顯著降低，凋亡率、p21和Bax 蛋白表達(dá)增加；與miR-148a-3p+pcDNA組比較，miR-148a-3p+pcDNA-DLL4組血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞24～72 h 細(xì)胞活力、DLL4、CyclinD1和Bcl-2蛋白表達(dá)顯著增加，凋亡率、p21和Bax 蛋白表達(dá)降低（P＜0.05）。見(jiàn)表6。

表5 miR-148a-3p 調(diào)控DLL4 蛋白的表達(dá)（±s）Table5 miR-148a-3p regulates DLL4 protein expression（±s）

表5 miR-148a-3p 調(diào)控DLL4 蛋白的表達(dá)（±s）Table5 miR-148a-3p regulates DLL4 protein expression（±s）

注：與miR-NC組比較，aP＜0.05；與anti-miR-NC組比較，bP＜0.05

分組miR-NC組miR-148a-3p 組anti-miR-NC組anti-miR-148a-3p 組F值P值DLL4 蛋白0.60±0.06 0.25±0.02a 0.58±0.05 0.87±0.08b 179.814 0.000

3 討論

近年來(lái)多項(xiàng)研究揭示了miRNA 在血管瘤進(jìn)展中的重要作用。例如，miR-424 的表觀遺傳沉默可促進(jìn)血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)，抑制細(xì)胞凋亡[9]。上調(diào)miR-206 可降低血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和侵襲能力，增加細(xì)胞凋亡[10]。下調(diào)miR-130a 可顯著抑制血管瘤的生長(zhǎng)和血管生成[11]。本研究發(fā)現(xiàn)IH 組織中miR-148a-3p 表達(dá)低于正常皮膚組織，于是推測(cè)miR-148a-3p 表達(dá)異常與IH 進(jìn)展有關(guān)。功能獲得實(shí)驗(yàn)顯示，miR-148a-3p 的恢復(fù)可顯著抑制血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞的增殖并誘導(dǎo)凋亡。進(jìn)一步分析細(xì)胞增殖和凋亡調(diào)控因子表達(dá)發(fā)現(xiàn)，過(guò)表達(dá)miR-143 顯著誘導(dǎo)p21和Bax 的表達(dá)，并降低CyclinD1和Bcl-2表達(dá)。p21 蛋白是一種內(nèi)源性細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶（Cyclin-dependent kinases，CDK）抑制劑，其通過(guò)抑制cyclin/CDK 復(fù)合物的活性阻止G1/S 相變[12]。Bax和Bcl-2 細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵調(diào)控因子，Bax 表達(dá)增加和Bcl-2表達(dá)降低可促進(jìn)線粒體膜孔的開(kāi)放，促進(jìn)細(xì)胞色素c 的釋放，促進(jìn)線粒體介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。與本研究結(jié)論類似，miR-148a-3p在宮頸癌[13]、食管癌[14]、口腔癌[15]中亦呈低表達(dá)，上調(diào)其表達(dá)可抑制腫瘤的惡性進(jìn)展。以上結(jié)果表明，miR-148a-3p 在IH 生長(zhǎng)中起抑制作用。

表6 DLL4 過(guò)表達(dá)逆轉(zhuǎn)了miR-148a-3p 對(duì)血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞增殖和凋亡的作用（±s）Table6 Overexpressing DLL4 reverses the effects of miR-148a-3p on proliferation and apoptosis of hemangioendothelial cell（±s）

表6 DLL4 過(guò)表達(dá)逆轉(zhuǎn)了miR-148a-3p 對(duì)血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞增殖和凋亡的作用（±s）Table6 Overexpressing DLL4 reverses the effects of miR-148a-3p on proliferation and apoptosis of hemangioendothelial cell（±s）

注：與miR-NC組比較，aP＜0.05；與miR-148a-3p+pcDNA組比較，bP＜0.05。

分組miR-NC組miR-148a-3p 組miR-148a-3p+pcDNA組miR-148a-3p+pcDNA-DLL4組F值P值DLL4蛋白0.62±0.06 0.24±0.03a 0.23±0.03 0.53±0.05b 181.823 0.000 OD值（490 nm）24 h 0.38±0.03 0.31±0.03a 0.30±0.03 0.37±0.03b 16.667 0.000 48 h 0.73±0.07 0.44±0.04a 0.41±0.03 0.64±0.05b 87.394 0.000 72 h 1.13±0.09 0.65±0.06a 0.60±0.05 0.98±0.08b 114.990 0.000凋亡率（%）6.59±0.63 21.45±2.18a 23.64±2.33 11.05±1.18b 201.212 0.000 CyclinD1蛋白0.67±0.06 0.23±0.02a 0.22±0.02 0.56±0.05b 275.130 0.000 p21 蛋白0.17±0.02 0.58±0.05a 0.59±0.06 0.28±0.03b 220.054 0.000 Bcl-2蛋白0.78±0.07 0.31±0.03a 0.29±0.03 0.67±0.06b 217.718 0.000 Bax 蛋白0.26±0.03 0.64±0.06a 0.66±0.06 0.37±0.03b 157.967 0.000

為了更深入地了解miR-148a-3p 抑制IH 內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)的機(jī)制，本研究通過(guò)生物信息學(xué)預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)DLL4是miR-148a-3p的潛在靶基因。DLL4是Notch 受體的配體之一，其主要表達(dá)與內(nèi)皮細(xì)胞，在調(diào)節(jié)腫瘤血管生成中起著關(guān)鍵作用。研究顯示DLL4 促進(jìn)腎細(xì)胞癌生長(zhǎng)、侵襲及血管生成進(jìn)而促進(jìn)腫瘤的血行轉(zhuǎn)移[16]。沉默DLL4 可抑制乳腺癌細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)凋亡[17]。本研究發(fā)現(xiàn)IH 組織中DLL4表達(dá)增加，與前人[7]研究結(jié)果吻合。功能缺失實(shí)驗(yàn)顯示，抑制DLL4 抑制血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞的增殖并誘導(dǎo)凋亡，誘導(dǎo)p21和Bax 的表達(dá)，抑制CyclinD1和Bcl-2表達(dá)。同時(shí)本研究發(fā)現(xiàn)DLL4是miR-148a-3p 的靶基因，過(guò)表達(dá)miR-148a-3p 可抑制DLL4表達(dá)，而抑制miR-148a-3p 則促進(jìn)DLL4表達(dá)。此外，恢復(fù)實(shí)驗(yàn)顯示過(guò)表達(dá)DLL4 可減弱miR-148a-3p 介導(dǎo)的血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞增殖抑制和凋亡促進(jìn)作用。表明miR-148a-3p靶向DLL4是其抑制IH 生長(zhǎng)的重要機(jī)制。

總之，本研究表明血管瘤組織中miR-148a-3p表達(dá)下調(diào)，過(guò)表達(dá)miR-148a-3p 通過(guò)靶向DLL4 抑制血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)凋亡，這一發(fā)現(xiàn)為IH 的治療提供了潛在靶點(diǎn)。